MACS磁珠分选
医学-流式细胞术基本原理
Long pass
Short pass
Band pass
• 透射光路
FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统
• 全反射光路
PerCP-Cy5.5
PE SSC
FITC PE-Cy7
PE-TexasRed
FACS Aria流式细胞仪器信号检测系统
1.2.3 电子系统
• 光电检测器
将光信号转换成电子信号。
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量 分析和分选的技术。
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
PMT
前向散射光 光电二极管
（二）电信号两种放大方式
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析 处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin)
对数(logarithmic; log)
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号 变异范围较大，多使用对数放大。
标记抗体的荧光素
激发光波长 发射光波长
（nm）
（nm）
490
520
488
575
490
675
650
660
496/546
670
496/546767495519650
665
中文名
异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
干货流式细胞分选的那些事儿
干货流式细胞分选的那些事儿作者：解螺旋.罗小黑转载请注明来源：解螺旋，医生科研助手将感兴趣的目的细胞分离纯化出来，一直是细胞生物学中的一个重要研究手段。
无论是体外刺激研究细胞因子的表达谱，还是细胞共培养检测细胞功能，均对细胞的纯度具有很高的要求。
目前分离纯化细胞的手段主要有两种：MACS（magnetic-activated cell sorting），原理就是用结合了磁珠的抗体去标记细胞，让目的细胞带上磁珠，通过磁场将结合了磁珠与没结合磁珠的细胞分离开来。
MACS是细胞分选的重要手段，设备简单，只需要一块磁铁，不需要专门的大型仪器，得到的细胞活性好，适合大多数的实验室。
缺点就是能分选的细胞类型有限。
FACS（fluorescence-activated cell sorting），也就是我们今天要了解的流式分选。
这部分原理与流式分析一致。
利用荧光素标记不同的分子，通过调节合适的电压、补偿等，通过荧光将目的细胞与非目的细胞区分开来。
MACS和FACS的优缺点：流式分选和流式分析在样本的准备上具有很多相通的地方，都是把样本处理成单细胞，最后上样的时候让细胞处于单个悬液的状态。
绝大部分人不需要进行仪器的操作，更关心的是如何提高细胞得率以及如果提高分选出来的细胞活性等问题。
首先是样本的准备，无论是组织还是血液来源的细胞，均应保证细胞在上样之前处于比较好的状态。
提示：o可以在重悬细胞的时候PBS中加入1%-2%的胎牛血清o大部分流式分选仪的上样器均没有冷却系统，要想分选后获得比较好的细胞活性，应尽量减少细胞在室温的暴露时间o样本较多的时候可以分成小份体积上样，每次1ml或者2ml，剩下的放在冰箱冷藏。
该方法长时间分选的时候能较好地提高分选出来的细胞活性，缺点就是人不能长时间离开，以防止样品跑空，空气进入分选管道。
其次，我们来聊一聊分选的模式，一般的流式分选仪上都有三种模式：纯化（purify）、富集（enrich）、单细胞（single cell）。
磁珠分选xiu
细胞）； • 不需要抗体和目旳细胞结合，即细胞不被
激惹（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分 析）； • 复合分选旳一部分。
联合使用两种以上分选策略，主要用于细胞亚群旳分选或者得 到高纯度非常稀有旳细胞。
合用范围：
（1）非目旳细胞也体现用来阳性选择旳抗 原 （2）分选非常稀有细胞，先清除非目旳细 胞再行阳性分选，可取得高纯度旳稀有目 旳细胞。
MACS分选策略
• 阳性分选 • 清除分选 • 复合分选
。
• 阳性分选中，目旳细胞被磁性标识后，作 为阳性标识组分直接分选出来。阳性分选
策略优点：纯除分选是把非目旳细胞磁性标识后从细 胞混合物中清除旳措施，即未磁性标识旳 细胞为目旳细胞。
清除分选策略合用范围
素微珠、抗荧光素微珠 • 多选微珠:专门为分选细胞亚群而研制旳一种微珠。 这种微珠经过特殊旳方式与抗体偶联， 在第一次阳性分选完毕后， 与细胞结合旳多选微珠 能够被解离试剂剪切下来， 阳性分选旳细胞能够进行 再次阳性分选或者清除分选。
• MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠旳 塑料容器，铁珠表面有亲水包被
2.上分离柱前,充分振荡,混悬细胞,打散细胞团块; •
3.用分离柱分选, 降低水中气泡,使分离柱不被气 泡阻滞; 分选过程中不能干柱 •
其他磁分选产品
Dynal 大磁珠 后续应用研究，如流式细胞术，则需要将 Dynabeads 与靶细胞分离。 合用于高频细胞
stemcell
MACS 与FACS
• MACS相比FACS旳优点： 1， 适合大批量旳细胞分选，FACS分选速度相对而言要慢诸多； 2，稳定性高，反复性强，而FACS因为机器运营时间长会造成参数漂 移故而实际获取得靶细胞阳性率会大大下降； 3，不必大型设备，普遍适合大多数试验室旳细胞分选工作； 4，操作简朴，不必专门旳设备操作人员（FACS操作需要一定旳经 验）。 FACS相比MACS旳优点： 1，少许细胞分选时比MACS精确得多，速度也快； 2，能够多种marker分选、正选负选同步进行（例如 CD117+/CD90lo/Sca-1+/CD45-），而MACS一般只能进行阳选或阴选， marker往往同步只能做一种（或一类）； 3，抗体能够用荧光直接标旳，也可用间标旳（最佳是厂家标明能够 用于FACS），选择余地大，但是MACS旳抗体往往需要和磁珠配套， 选择余地小。
MACS如何选择合适的分选器
如何选择合适的分选器？美天旎MACS技术已经成为磁性细胞分选的金标准，其文献引用量一直远超同类其他产品。
MACS磁珠分选所用到的主要组份有：MACS磁珠、MACS分选柱和MACS分选器。
如果您是第一次使用美天旎磁珠，则可以选择合适的起始套装，这样既能满足您的分选要求，又节省成本。
美天旎提供以下套装产品供您选择，针对您的实验，选择最适合您的分选器套装产品。
手动分选产品产品一：MiniMACS Starting Kit （送磁珠）130-090-312 MiniMACS Starting Kit对应使用分选柱：MS适合分选策略：阳性分选最大上样量：2X108最大目的细胞吸附量：107一次上样数量：1个产品二：MidiMACS Starting Kit （送磁珠）130-042-301 MidiMACS Starting Kit（LS）对应使用分选柱：LS适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：2X109最大目的细胞吸附量：108一次上样数量：1个130-090-329 MidiMACS Starting Kit（LS）对应使用分选柱：LD适合分选策略：阴性分选最大上样量：2X109最大目的细胞吸附量：108一次上样数量：1个产品三：Mini & MidiMACS Starting Kit（送磁珠）130-042-501 Mini & MidiMACS Starting Kit（MS LS）对应使用分选柱：MS LS适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：2X108+2X109最大目的细胞吸附量：107+108一次上样数量：2个Mini & MidiMACS Starting KitMACS MultiStand 分选架MidiMACS Separation Unit 分选器130-042-501 Mini & MidiMACS Starting Kit （MS LD）对应使用分选柱：MS LD适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：2X108+2X109最大目的细胞吸附量：107+108一次上样数量：2个产品四：OctoMACS Starting Kit （送磁珠）130-042-108 OctoMACS Starting Kit对应使用分选柱：MS适合分选策略：阳性分选最大上样量：8X2X108最大目的细胞吸附量：8X107一次上样数量：8个产品五：QuadroMACS Starting Kit （送磁珠）130-091-051 QuadroMACS Starting Kit （LS）对应使用分选柱：LS适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：4X2X109最大目的细胞吸附量：4X108一次上样数量：4个130-092-857 QuadroMACS Starting Kit（LD）对应使用分选柱：LD适合分选策略：阴选最大上样量：4X2X109最大目的细胞吸附量：4X108一次上样数量：4个产品六：VarioMACS Separator（手动细胞分选）130-090-282 VarioMACS Separator（手动细胞分选）对应使用分选柱：MS, LS, LD and CS适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：4X10E9最大目的细胞吸附量：2X10E8一次上样数量：1个半自动分选产品130-095-346 MultiMACS Cell24 Separator（半自动分选器）对应使用分选柱：LS LD适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大细胞上样量：24X2X10E9最大一次上样量：24个全自动分选产品autoMACS Starting Kit（全自动分选器）对应使用分选柱：自动分选柱（可重复使用）适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大细胞上样量：4x10e9最大目的细胞吸附量：2x10e8最大一次上样量：6个。
德国美天妮磁珠分选
MACS® 细胞分选策略
• 阳性分选
• 去除分选 • 去除分选后再阳性分选
• 多重分选
MD0044.02
MACS细胞分选策略
1、阳性分选：
• 根据特异性标志分选细胞: 阳性分选是指目的细胞磁性标记
后，作为阳性的标记组分直接分选出来。
• 优点：
》高纯度，尤其是富集稀有的细胞 》高回收率 》操作简便、迅速
MD0044.02
识别DC和DC亚群 New
DC 亚群特异性标志: Blood Dendritic Cell Antigens
Lineage- (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) HLA-DR+ CD11c+ CD123low/-
BDCA-2/4+ BDCA-1+ BDCA-3+
MD0044.02
MACS® 技术分选与分析功能性T细胞
T细胞分选
T细胞亚群
T细胞功能亚群
抗原特异性 T细胞
Th细胞（ CD4） Tc细胞（ CD8） 调节性 T细胞 (CD4+CD25+) TCRr/d 细胞 (TCRr/d微珠 ) NK/T细胞 (CD56多选微珠＋ CD3微珠 )
NaiveT细胞 (CD45RO阴选 ) 活化 T细胞（ CD69、 CD25、 CD30） 效应 T细胞（ CD27） 记忆 T细胞（ CD45RA阴选、 CD45RO阳选） Th2细胞 (anti-CRTH2)
IFN-r IL-2 IL-4 IL-10 TNF-a
MD0044.02
MACS® 细胞因子分泌细胞分析与分选 New
Catch Reagent
MACS(磁珠分选)介绍-优宁维
技术一：MACS磁珠分选介绍MACS技术为德国美天旎生物技术有限公司（Miltenyi Biotec GmbH）的专利产品，是一种集合了免疫学、细胞生物学、磁力学等知识于一体的高度特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。
MACS技术已成为细胞分选的标准方法，从实验室到临床，从小规模到大规模，从常见细胞到稀有细胞和复杂的细胞亚群，从人类和小鼠细胞到其它种系的细胞，MACS技术提供了一种可在每一个实验室进行高品质细胞分选的方法。
MACS技术主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。
MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。
MACS分选柱置于一个永久性磁场—MACS分选器中，可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的细胞。
用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。
分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。
所有的操作在2.5－30分钟内即可完成，得到的细胞可立即用于后继实验。
德国美天旎公司是一个以细胞分选技术为主、拥有多样化产品的生物技术公司。
开发研制并销售世界上最先进的细胞分选、细胞生物学、相关分子生物学产品和技术，尤其在干细胞分选、DC细胞分选与分析、细胞因子分泌细胞分选与分析、免疫治疗、再生医学方面占有极大的优势，CD133、BDCA-2（CD303）、BDCA-4（CD304）单抗为其专利产品。
MACS技术优点1、稳定、高质量的分选使用MACS技术，可获得高纯度（90-99%）、高回收率的分选细胞群。
2、对细胞无损伤50nm微珠和MACS分选柱均无毒性，对细胞无损伤，可以纯化有活力和功能活性的细胞而不影响其活性。
3、操作简便、快速MACS技术操作简单，消毒方便。
磁珠孵育时间很短，仅需15分钟。
手动分选可在30分钟内完成，autoMACS分选可在2.5-10分钟之内完成。
4、从实验室到临床MACS技术可以实现从105到1011个细胞分选。
德国美天妮磁珠分选
MACS技术 技术
设备与试剂
• MACS分选器
autoMACS分选仪 分选仪
• 9种程序，一机完成所有细胞分选 种程序， 种程序 • 成本低，两个可重复使用的分选 成本低， 周内100次 柱（2周内 次） 周内 • 快速（3－10分钟） 快速（ － 分钟 分钟） •重复性好 重复性好 • 全自动分选，仪器操作简单 全自动分选， • 适用范围广：从少量标本（105） 适用范围广：从少量标本（ 到大量标本（ ），进样量 到大量标本（4X109），进样量 0.5ml-50ml • 8种全血微珠，可以做常见细胞的 种全血微珠， 种全血微珠 全血分选， 全血分选，省去了费时的提取单个 核细胞过程
• 去除分选是磁性标记非目的细胞，并将其从细胞混合物中去 去除分选是磁性标记非目的细胞，
除，即未磁性标记的细胞为目的细胞。 即未磁性标记的细胞为目的细胞。
• 去除分选策略适用范围： 去除分选策略适用范围：
》去除不需要的细胞 缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞） 》缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞） 》不需要抗体和目的细胞结合 》需进一步通过阳性选择分选细胞亚群
MD0347.01
MACS® 磁性分选
MACS微珠进行 微珠进行 磁性标记
洗脱阳性分 选的细胞
未标记的细胞 先行流出
MD0651.01
分选前标本制备： 分选前标本制备：过滤
.02
MACS 技术
设备与试剂
» MACS微珠 微珠 » MACS分选柱 MACS分选柱 » MACS 分选器 » 详细分选方案 详细分选方案*
MD0197.02
MACS技术 技术
设备与试剂
• MACS微珠： 微珠： 微珠
MACS 微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺 磁化微粒，可用于目的细胞的磁性标记。 磁化微粒，可用于目的细胞的磁性标记。
磁珠分选与流式分选该如何选择？
磁珠分选与流式分选该如何选择？目前常见的分选方法有两种，一种是流式分选，一种是磁珠分选，两种方案各有优势，下面我们分别来了解一下。
1、什么是MACS 磁性分选？答：首先使用磁珠偶联的抗体去标记细胞，然后把标记好的细胞过分选柱（分选柱周围会有磁铁），带磁珠的细胞就留在柱子上，不带磁珠的细胞就流走了，从而实现分选，需要搭配分选器。
2、什么是FCS流式分选？答：流式分选一般都是电荷式分选，即对感兴趣的目标细胞所在的液滴充上电荷，液滴经过电极板，通过电场作用发生偏转，从而实现分选，需要搭配流式分选仪。
3、MACS磁性分选的优势？（1）对细胞的刺激。
磁珠分选最大的优势就是对细胞的刺激要小一点。
因为流式分选细胞首先要经过几十微米的喷嘴，然后要被充电，还要经过几千伏的电场，最后以几十米每秒的速度落到收集管里面，有些原代细胞就受不了，分选免疫细胞也要考虑细胞活化的影响；而磁珠分选相对来说就对细胞没什么刺激。
（2）设备要求。
磁珠分选小的实验室就能做，买一些专用的磁铁和柱子就可以了，而流式分选就需要分选型的流式细胞仪，都是几百万以上的。
对操作员的要求来说，流式分选也要高一点，需要专门培训，需要注意的细节也要多很多。
如果你周围有什么流式平台的话，磁珠分选和流式分选的成本应该是差不多的，流式分选一次大约1-2千（各地方不同），磁珠分选的柱子磁珠差不多也要烧这么多钱。
（3）试剂不同。
这个最好理解，流式分选用的是荧光素偶联的抗体，磁珠分选用的是磁珠结合的抗体。
4、FACS流式分选的优势？（4）多参数分选。
流式细胞术很大的优势就是多参数，比如我可以分选CD4+CD25+CD127low的Treg，三色的一次就能分选。
磁珠分选就必须先分CD4，再分CD25，更多参数的就没法进行。
（5）低表达群细胞分选。
比如有些干细胞它的表达比例只有百分之零点几，比例太少磁珠分选无法操作，流式就可以把这些细胞富集起来。
（6）胞内荧光分选。
流式分选在分子生物学中很大一部分应用就是分选GFP、YFP等阳性细胞，还有可以用Hoechst染精子的单倍体进行分选，这些针对胞内成分的分选也是磁珠分选无法实现的。
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MACS磁珠分选
免疫磁珠法分离细胞原理
免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
一、磁性细胞标记方式
应用MACS技术进行磁性细胞分选最重要的一点是高质量的标记。
要尽可能地增强阳性细胞的标记，并减弱背景染色。
有两种基本的磁性标记方式：直接标记和间接标记。
1、直接磁性细胞标记（Direct magnetic cell labeling）
（磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞）直接标记是最快速、最特异的磁性标记方法。
目前有多种分选人、小鼠、大鼠以及非人类灵长类细胞的MACS直标微珠可供选用。
2、间接磁性细胞标记（Indirect magnetic cell labeling）
（磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞）间接磁性细胞标记需要联合使用单克隆或者多克隆抗体和MACS间标微珠。
未结合抗体、生物素化抗体或者荧光素标记抗体均可作为一抗标记细胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。
几乎针对任何种系任何细胞的任何一种单抗或多抗，均可用于间接标记。
间接标记主要在如下情况时选用：当没有直标磁珠时；需要用几种抗体的混合物同时分选或去除多种类型的细胞；间接标记有放大作用，因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用；使用自备抗体或者配体的磁珠分选中。
（一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。
）
二、MACS分选策略
有两种基本的分选策略
阳性分选和去除分选。
复合分选策略是将两种基本分选策略相结合或者联合使用多选微珠，从而实现细胞亚群的分选。
1、阳性分选策略（Positive selection strategy）
阳性分选中，目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。
分选后的细胞不必去除MACS微珠，可立即用于培养
2、去除分选策略（Depletion strategy）
去除分选是把非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除的方法，即未磁性标记的细胞为目的细胞。
MACS分选柱技术加上强磁性标记可以去除高达4个对数级的细胞。
去除分选策略适用范围：去除不需要的细胞；缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）；不需要抗体和目的细胞结合，即细胞不被激惹（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分析）；复合分选的一部分。
3、复合分选策略
联合使用两种以上分选策略，主要用于细胞亚群的分选或者得到高纯度非常稀有的细胞。
（1）去除后再阳性分选（Depletion followed by positive selection）
细胞亚群的分选，可以先磁性标记非目的细胞，去除分选后对阴性组分再行磁性标记和阳性分选。
适用范围：在细胞悬液中，
去除非目的细胞，在富集细胞的基础上，进行阳性分选，可获得高纯度目的细胞。
（2）多重分选策略（MultiSort Strategy）
MACS多重分选是一种根据多种表面标志磁性分选细胞的技术。
多重分选中，首先用MACS多选微珠标记目的细胞，进行第一参数阳性分选。
然后细胞与多选解离试剂共同孵育，后者可以将微珠从抗体上酶性解离下来。
接着使用针对另一细胞表面标志的抗体－微珠复合物磁性标记阳性分选细胞。
二次标记的细胞可以再次进行阳性分选或者去除分选。
三、磁分离细胞的重要指标
纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性，也无法直接上流式。
四、目前市场上有2种磁性细胞分离系统
1、Small particles (≈50 nm) －MACS
2、Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）
五、小磁珠
（2）可直接上流式检测，不影响散射光。
2、缺点
（1）需要很强的磁场来分离细胞。
（2）分离速度很慢，得率不高。
（3）一次性的分离柱，不能在普通试管进行。
（4）成本昂贵。
六、大磁珠
1、优点
（1）技术简单，分离可在试管中完成。
（2）易于增减细胞用量。
（3）速度快，得率高
（4）成本低
2、缺点
（1）对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养。
（2）纯度低。
（3）容易阻塞FCM的喷嘴。
磁珠分选细胞注意事项
磁珠分选细胞注意事项
1、待分选细胞中如有贴壁细胞，建议在分选前先贴壁培养去除，或者提高EDTA浓度。
2、抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合。
因而分选前去除死细胞。
3、新鲜分离骨髓细胞，先用胶原酶、DNA酶、胰酶联合消化，可使细胞团块解聚，从而提高分离效率。
4、上分离柱前，充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块。
5、用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞。
6、细胞悬液加入分离柱中时，应将滴管伸至底壁后加入，避免将细悬液沿管壁流入，使管壁残流末分选细胞，以致后继洗柱过程中，因疏忽末被洗下，最后导致纯度不高。
洗柱时，应在前次液体充分流尽后，再加洗液。
7、分选细胞量应根据说明书控制，不超量。
8、孵育时间和温度应按说明书进行，延长孵育时间、提高温度会增加非特异结合。
9、先用抗体阻断Fc受体，可降低非特异性结合。
免疫磁珠分离法用的分离柱
不同的厂家生产的磁珠的大小，性能有可能不同。
比如MACS的磁珠小，用分离柱分离。
而BD产的磁珠是中号的，磁力大，不用分离柱，普通小试管加上分离器就可以分离细胞。
如果都是用分离柱，厂商不同的话，最好看看说明，磁珠大小，磁力等性状如何，是否相似。
当然，最好还是试一下就知道了。
（除了美天旎的是小磁珠，别的几乎都是大磁珠）
我曾经清洗后重复利用的分离柱，感觉死的细胞会增加。
看实验需要了，最好用新的。
MACS 的根Dynal的不一样，MACS 是一個磁性column，而Dynal 只是外面依個磁性的eppendorf 座而已。
Miltenyi的柱子回收方法
准备使用回收的柱子时，抗体孵育始，即将柱子置于新鲜的75%酒精中，柱的容器内盛满酒精，自动流下，既消毒，又de-gas，去除气泡十分关键。
洗抗体时，即开始洗柱子，将回收柱架于消毒过的长试管口上。
换新的酒精自然滴下，换PBS+0.1%FBS冲洗之，最后用MACS Buffer冲洗。
柱子准备完毕，准备上柱的细胞也就同时准备好了。
回收方法
将长试管注满PBS，回抽柱子的活塞，倒出回抽液。
倒入新的PBS，打出之；重复两次---此时基本上将柱子内的杂细胞除尽。
再抽、打两三次无水酒精或95%酒精，然后置于50-60度烘箱，过夜，即能防止生锈。
此法回收的柱子可用2-5次。
本人用回收的柱子分离血CD4细胞，纯度>90%。