微生物平板划线试验法
平板划线法分离菌种
实验六平板划线法分离菌种一、实验目的1、了解平板划线法分离菌种的基本原理2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。
一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。
通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。
实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。
平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。
具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。
由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。
鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。
这样的培养基称之为鉴别培养基。
例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。
（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数）其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。
伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。
在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。
微生物平板划线试验
2、常见培养基
选择培养基
亚硒酸盐增菌液：作为沙门氏菌属及某些志贺氏菌属 增菌用
伊红－美蓝琼脂：分离沙门氏及志贺氏菌属细菌 Baird-Parker培养基：用于金黄色葡萄球菌的培养分
离
2、常见培养基
鉴别培养基
三糖铁琼脂：供鉴定肠道细菌用 双糖含铁琼脂：供鉴定肠道细菌用 葡萄糖枸橼酸盐琼脂：共作鉴别大肠杆菌与产气杆菌
4、平板划线接种法
图2-4 灭菌接种环
4、平板划线接种法
（3）取菌种 左手持装有金黄色葡萄球菌或大肠杆菌菌液的
试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管塞， 将试管管口迅速通过火焰2~3次进行灭菌。
将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取 一接种环的菌液，然后退出菌种管，将菌种管管口 再次通过火焰2~3次灭菌，塞好试管塞，放至原来 的位置。
3、实验用品
（1）菌液：金黄色葡萄球菌和普通大肠杆菌 菌液各一管。
（2）实验器械：酒精灯一个、血平板一个、 伊红美蓝平板一个、接种环一支。
4、实验步骤
参照前面介绍的四区划线法的操作步骤操作， 一定要在无菌条件下，养成无菌意识。
（1）标记 （2）灭菌接种环 （3）取菌种 （4）分离划线接种细菌 （5）划线完毕，送进37℃温箱培养 （6）培养18~24h ，观察结果
2、液体培养基接种方法
步骤:（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。 （2）如斜面培养基的接种方法一样，握持菌种管及 接种的肉汤管。 （3）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再 伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻轻研磨， 蘸取少量肉汤调和，使菌混于肉汤中。塞好试 管塞后，摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。 （4）接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。肉 汤管放37℃温箱培养，18～24小时后观察生长 情况。
《平板划线试验》课件
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接种细菌：用无菌接种环蘸取细菌 培养物，在平板上均匀涂抹
观察结果：培养结束后，观察细菌 的生长情况，记录结果
划线分离
准备平板：选择合 适的平板，如琼脂 平板、培养基平板 等
划线：使用无菌操 作，将菌液或菌落 均匀地涂布在平板 上
干燥：将涂布好的 平板放在干燥箱中 干燥，使菌液或菌 落干燥
划线深度过浅或过深都会影响实验结 果，应保持适中的深度
划线角度过大或过小都会影响实验结 果，应保持适中的角度
划线过程中应避免划破平板，以免影 响实验结果
划线过程中应避免划破平板，以免影 响实验结果
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平板划线试验
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平板划线试验简介
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平板划线试验的步 骤
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平板划线试验的注 意事项
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平板划线试验的应 用
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平板划线试验简介
平板划线试验的定义
平板划线试验是一 种微生物分离和纯 化的方法
实验结束后，应及时清理实 验台和设备，保持实验室整 洁
实验结果应及时分析，包括 菌落形态、生长情况、抗药
性等
实验报告应及时撰写，包括 实验目的、方法、结果、讨
论等
影响实验结果的因素及解决方法
平板划线试验的准确性受划线速度、 划线深度、划线角度等因素的影响
划线速度过快或过慢都会影响实验结 果，应保持适中的速度
特性
菌落计数：通 过平板划线试 验，可以计算 细菌的数量和
微生物接种方法
微生物接种方法微生物接种是生物实验中的一项基本技术，也是各种微生物检测和研究中不可缺少的步骤。
本文将介绍一些常见的微生物接种方法，包括平板划线法、斜面接种法、液体培养基接种法和穿刺接种法等。
平板划线法是一种常用的微生物接种方法，其目的是将菌种纯化，得到单一的菌落。
该方法通过在固体培养基上划线，使菌种在培养基上繁殖并形成菌落。
具体步骤如下：(1)将固体培养基灭菌后倒入培养皿中，待凝固后加入适量菌液。
(2)用接种环取适量菌液，在培养皿表面划线。
(3)将培养皿放入适宜的温度下培养，观察菌落的生长情况。
(4)根据需要重复划线操作，直至得到单一的菌落。
斜面接种法是一种常用的微生物接种方法，其目的是将菌种接种到斜面培养基上，以便于观察和保存。
该方法通过将菌液加入到灭菌后的斜面培养基中，使菌种在斜面上繁殖并形成菌落。
具体步骤如下：(1)将斜面培养基灭菌后放置在实验台上，用无菌操作法加入适量菌液。
(2)将接种环放入菌液中沾取少量菌种，然后在斜面培养基上划线接种。
(3)将培养皿放入适宜的温度下培养，观察菌落的生长情况。
(4)根据需要重复划线操作，直至得到单一的菌落。
液体培养基接种法是一种常用的微生物接种方法，其目的是将菌种接种到液体培养基中，以便于微生物的生长和繁殖。
该方法通过将菌液加入到灭菌后的液体培养基中，使菌种在液体培养基中繁殖并形成微生物。
具体步骤如下：(1)将液体培养基灭菌后倒入试管中，加入适量菌液。
(2)用摇床或其他设备将试管中的培养基混合均匀。
(3)将试管放入适宜的温度下培养，观察微生物的生长情况。
微生物接种技术是生物工程中一项重要的技术，广泛应用于生物制品制造、环境生物治理、医学诊断等领域。
本文将介绍微生物接种技术的基本原理、应用场景以及发展前景。
微生物接种技术是指将目的微生物通过一定的方式引入到培养基或发酵系统中，使其在特定的环境下生长繁殖，以达到特定的生物制品或环境治理的目的。
该技术的主要环节包括菌种选择、接种量确定、接种方法选择和培养条件控制等。
平板划线法操作要点docx
平板划线法操作要点 .docx 平板划线法是一种常用的微生物分离纯化方法，用于将一个菌种的单个菌落进行分离、纯化和繁殖。
下面是平板划线法的操作要点：
1.准备所需材料：平皿、接种环、酒精灯、无菌棉签、镊子、培养基等。
2.将培养基倒入平皿中，用无菌棉签均匀涂布在培养基表面。
3.用镊子取出一块无菌滤纸，将其在酒精灯上灼烧后冷却，然后将其放置在培
养基表面。
4.用接种环取少量待分离的菌液，在滤纸上划线，注意不要将线划得过细或过
粗，以避免影响分离效果。
5.将平皿放置在适宜的温度下培养，观察菌落的生长情况。
如果需要，可以进
行第二次划线，以进一步纯化菌落。
6.当菌落长成后，用镊子将单个菌落取出，并将其接种到新的培养基上，以进
行下一步的实验或保存。
注意事项：
1.整个操作过程中，必须保证无菌操作，以避免污染。
2.在划线时，要注意力度和角度，以避免菌液过多或过少。
3.在培养过程中，要保持适宜的温度和湿度，以促进菌落的生长。
4.在取出单个菌落时，要用镊子轻轻夹住菌落，避免将其周围的培养基弄碎。
5.在进行下一步实验或保存之前，要对菌落进行最后的检查，以确保其纯度和
质量。
平板划线法是一种简单而有效的微生物分离纯化方法，但需要一定的操作技巧和经验。
通过不断实践和总结经验，可以逐步提高操作水平和实验效果。
微生物平板划线试验
在液体培养基中加入一定量凝固 剂，使其成为固体状态，琼脂含 量一般为1.5%-2.0%
按 物 理 状 态 不 同 划 分
固体培养基 半固体培养基
固体培养基常用来进行微生物的分 离、鉴定、活菌计数及菌种保藏
琼脂含量一般为0.2%-0.7%
观察微生物的运动特征、分类鉴 定及噬菌体效价滴定
液体培养基
不加任何凝固剂 大规模工业生产及在实验室进行 微生物的基础理论和应用方面的 研究
平板划线实验实习
一、相关基础理论－－细菌的培养
一般细菌均可用人工方法进行培养，使其生长繁殖， 以便进一步观察和研究他们的各种生物学特征。为 了获得良好的细菌培养物，在分离培养细菌时，除 采用适宜的培养基，并考虑到其他的培养条件之外， 掌握各种分离培养和接种的基本技术，也是重要环 节。
1、培养基
圆形、突起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽， 不透明菌落，直径1～2mm
4、平板划线接种法
图2-4 灭菌接种环
4、平板划线接种法
（3）取菌种 左手持装有金黄色葡萄球菌或大肠杆菌菌液的 试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管塞， 将试管管口迅速通过火焰2~3次进行灭菌。 将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取 一接种环的菌液，然后退出菌种管，将菌种管管口 再次通过火焰2~3次灭菌，塞好试管塞，放至原来 的位置。
2、液体培养基接种方法
步骤:（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。 （2）如斜面培养基的接种方法一样，握持菌种管及 接种的肉汤管。 （3）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再 伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻轻研磨， 蘸取少量肉汤调和，使菌混于肉汤中。塞好试 管塞后，摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。 （4）接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。肉 汤管放37℃温箱培养，18～24小时后观察生长 情况。
低浓度平板划线方法
低浓度平板划线方法首先，准备所需材料和试剂。
主要包括平板培养基、可溶性抗生素、试验菌株、移液器、涂布棒、平板计数器、酒精棉球和铬合金划线钩等。
其次，开始进行实验前，应充分消毒实验台和器材。
使用75%的酒精对台面和瓶盖进行消毒，消毒时间为3-5分钟。
然后使用酒精棉球擦拭移液器、涂布棒和铬合金划线钩等工具。
接下来，取出平板培养基，将瓶盖松开，放入微波炉加热至瓶内液体呈均匀沸腾状态。
同时，将可溶性抗生素溶解于适量的生理盐水中，制备不同浓度的抗生素溶液。
然后，取出瓶盖，将平板培养基倒入岩藻糖平板。
将盖子盖好，轻轻晃动，使液体均匀覆盖整个平板表面。
接着，将涂布棒靠近岩藻糖平板的表面，涂抹菌株液体。
然后，将涂布棒沿着平板表面做S形运动，使菌株均匀分布在岩藻糖平板上。
然后，将涂布棒反复沾取抗生素溶液，再沿着平板表面做S形运动，划线形成抗生素浓度梯度。
每划一条线，涂布棒都要在抗生素溶液中反复沾取和涂布，以确保线上抗生素浓度一致。
最后，将平板倒置，放入恒温培养箱中，在适当的温度和时间下进行培养。
培养箱温度根据菌株要求而不同，通常为37°C。
时间一般为18-24小时。
完成实验后，使用平板计数器计数每一条抗生素划线上的菌落，以确定菌株的抗药性。
同时，也可以观察菌株在不同抗生素浓度下的生长情况。
需要注意的是，在进行低浓度平板划线实验时，应控制好抗生素溶液的浓度，以避免抑菌率过高或过低，影响结果的准确性。
此外，还应注意避免实验台面和器材的污染，保持操作环境的无菌和洁净。
总结起来，低浓度平板划线方法是一种常用于微生物培养和抗菌药物敏感性试验等实验中的方法。
其步骤包括准备材料和试剂、消毒实验台和器材、制备抗生素溶液、涂布菌株、划线形成抗生素浓度梯度，最后进行培养和结果统计。
通过这种方法可以研究抗菌药物对菌株的抑菌效果和敏感性，为临床治疗提供参考依据。
用平板划线法进行纯种分离的原理
用平板划线法进行纯种分离的原理
平板划线法是一种常用的分离纯种细菌的方法，其基本原理是通过在寒热循环条件下，使同
一种细菌群落中的个体在营养物质和生长因子的限制下产生随机突变，然后利用平板划线的方法
将突变菌落分离出来。
具体实验步骤如下：
1. 准备含有寒热循环剂的琼脂平板，并在其中添加适量的营养物质和生长因子，使总体积达
到约20mL。
2. 将待分离的细菌样品加入琼脂平板中，并在表面均匀涂抹，然后将培养皿在温度适宜的培
养箱中进行寒热循环处理，如在37℃下孵育24小时，然后在4℃下静置24小时。
3. 在处理完寒热循环后，观察平板上的菌落情况，发现具有明显变异（或表型不同）的菌落，便可将其隔离出来。
4. 利用无菌的平板划线针，在菌落周围的琼脂平板上进行划线操作，目的是将不同的菌株分
离在不同的区域上。
5. 在分离后，将每个产生变异的菌落单独接种到新的琼脂平板中，并进行常规的细菌培养工作。
通过平板划线法分离纯种细菌，可以避免不同菌株的干扰和混杂，实现对某一种细菌的单独
培养和研究。
同时，该方法简便易行，不需要特殊设备和技术，因此在微生物学和生物工程领域
得到了广泛应用。
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1、斜面培养基接种法
图2-1 斜面培养基接种法
2、液体培养基接种方法
可用于观察细菌不同的生长状况，有的呈均匀混浊， 有的呈沉淀生长，还有的在液体表面形成菌膜；另 外还可以供测定细菌生化特性用。凡是肉汤、葡萄 糖蛋白胨水以及各种单糖发酵管等液体培养基均用 此法接种。
3、穿刺接种法
图2-3 穿刺接种法
4、平板划线接种法
常用于分离单个菌落，也可用于观察细菌的生长状 况和观察某些生化反应。沙门氏菌的各属在亚硫酸 铋琼脂平板上呈黑色，具有金属光泽；志贺氏菌属 在HE琼脂平板、SS琼脂平板、麦康凯琼脂平板上 呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
表3 常见的几种细菌的培养和基接种方法举例
平板划线接种法
斜面培养基 接种法
液体培养基 接种法
穿刺接种法
菌种
葡萄球菌和大肠 杆菌的混合菌液
大肠杆菌培养物
大肠杆菌培养物 枯草杆菌培养物
变形杆菌培养物 痢疾杆菌培养物
培养基 普通琼脂平板
脂 培养基
1、斜面培养基接种法
培养基按用途，分基础培养基、加富培养基、选择 培养基、鉴别培养基。
在液体培养基中加入一定量凝固 剂，使其成为固体状态，琼脂含 量一般为1.5%-2.0%
按 物
固体培养基
固体培养基常用来进行微生物的分 离、鉴定、活菌计数及菌种保藏
理
状
琼脂含量一般为0.2%-0.7%
态
半固体培养基
不 同 划 分
液体培养基
1、斜面培养基接种法
（6）以右手手掌及小指，小指及无名指分别拔取并 夹持两管试管塞，将两管管管口灭菌。
（7）将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管内，从 斜面上轻轻挑取少量菌苔退出菌种管。再伸进 待接种的培养基管，进行斜面培养基接种，从 斜面底部轻轻向顶端弯曲划线，不要触破培养 基表面。
1、斜面培养基接种法
之用
二、细菌的接种方法
将混合的细菌分离的方法有多种，平板划线法即是 其中之一，该方法主要是借划线而将混杂的细菌在 琼脂平板表面分散开，是单个细菌能固定在某一点， 生长繁殖后形成单个的菌落以达到分离纯种的目的。
当细菌分离成纯种后，一般还可用斜面、液体和半 固体培养基来检验细菌的培养特征，因此接种方法 可相应的分为四种。
在土壤、水、食品、空气以及人和动、植物中，不 同种类的细菌混杂地生活在一起。若要研究其中某 种细菌，就必须将各种细菌进行分离，以得到只含 有这一种细菌的纯培养。当细菌分离成纯种后，常 需要接种到有关的培养基中，以测试其各种生物学 性状，不同的细菌需要不同的培养基进行培养。
1、培养基
培养基按其物理性状，分为固体培养基、液体培养 基和半固体培养基。
2、液体培养基接种方法
图2-2 液体培养基接种法
3、穿刺接种法
常用于半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基、双糖铁 培养基等的接种，前者用于测定细菌的动力，后二 者则用于观察细菌的生化反应。
3、穿刺接种法
步骤:（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。 （2）如斜面培养基接种法，握持菌种管及待接种 的半固体琼脂培养基。 （3）右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌 苔，垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，刺 达近管底部，但不必及于管底，然后循原路 退出。 （4）接种完毕，接种针重新灭菌后放至试管架 上，塞好试管塞，37℃培养18～24小时后取 出观察细菌的生长情况。
平板划线实验实习
一、相关基础理论－－细菌的培养
一般细菌均可用人工方法进行培养，使其生长繁殖， 以便进一步观察和研究他们的各种生物学特征。为 了获得良好的细菌培养物，在分离培养细菌时，除 采用适宜的培养基，并考虑到其他的培养条件之外， 掌握各种分离培养和接种的基本技术，也是重要环 节。
1、培养基
观察微生物的运动特征、分类鉴 定及噬菌体效价滴定
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行 微生物的基础理论和应用方面的 研究
牛膏蛋白胨培养基是最常用 的基础培养基
基础培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养
按
物质制成的一类营养丰富的培养基
用
途
加富培养基
不 同 划
选择培养基
用来将某种或某类微生物从混杂的 微生物群体中分离出来的培养基
2、液体培养基接种方法
步骤:（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。 （2）如斜面培养基的接种方法一样，握持菌种管及 接种的肉汤管。 （3）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再 伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻轻研磨， 蘸取少量肉汤调和，使菌混于肉汤中。塞好试 管塞后，摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。 （4）接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。肉 汤管放37℃温箱培养，18～24小时后观察生长 情况。
常用于细菌的大量繁殖，保存菌种，或观察其某些 生化特性。琼脂斜面、尿素培养基、双糖铁培养基、 柠檬酸盐培养基等具有斜面外形的固体培养基均可 用此法接种。
1、斜面培养基接种法
步骤：（1）用记号笔在待接种的培养管上写明标记。 （2）点燃酒精灯。 （3）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌 种与待接种的培养基管，使菌种管位于左侧， 斜面部均应向上。 （4）以右手拇指和食指捏持转动两管试管塞，以 便在接种是易于拔取。 （5）右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌。
分
鉴别培养基 用于鉴别不同类型微生物的培养基
微生物产生某种代谢产物，与培养 基中的特殊化学物质发生特定的化 学反应，产生明显的特征变化
2、常见培养基
基础培养基
肉浸液培养基：一般细菌都能在此培养基内生长 营养琼脂培养基：一般细菌培养使用 蛋白胨水培养基：靛基质实验
2、常见培养基
加富培养基
血琼脂培养基：可作为肺炎球菌、链球菌、葡萄球 菌、嗜血杆菌等的分离培养，还可用 于某些菌落的溶血作用
巧克力琼脂培养基：淋球菌及脑膜炎双球菌在此培养 基上生长较佳
2、常见培养基
选择培养基
亚硒酸盐增菌液：作为沙门氏菌属及某些志贺氏菌属 增菌用
伊红－美蓝琼脂：分离沙门氏及志贺氏菌属细菌 Baird-Parker培养基：用于金黄色葡萄球菌的培养分
离
2、常见培养基
鉴别培养基
三糖铁琼脂：供鉴定肠道细菌用 双糖含铁琼脂：供鉴定肠道细菌用 葡萄糖枸橼酸盐琼脂：共作鉴别大肠杆菌与产气杆菌