微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法
微生物培养方法
微生物培养方法微生物培养是一种用于研究微生物生理生化特性、生长繁殖规律及其与环境条件的关系等的重要技术手段。
以下是一些常见的微生物培养方法：1、固体培养基培养法固体培养基是在培养液中加入凝固剂，使培养基成为凝固状态的培养基。
这种培养基具有良好的稳定性，可以防止培养液中的微生物在培养过程中流失，同时也可以使微生物在固体表面生长繁殖，方便观察和检测。
固体培养基一般用于细菌、放线菌、酵母菌等微生物的培养。
2、液体培养基培养法液体培养基是一种不添加凝固剂的培养基，使培养基呈液体状态。
液体培养基中，微生物在培养液中自由悬浮生长繁殖，可以充分接触培养液中的营养物质，有利于微生物的生长繁殖。
液体培养基一般用于工业生产中的微生物培养，如发酵工业中制备各种发酵产品。
3、半固体培养基培养法半固体培养基是在液体培养基中加入少量凝固剂，使培养基成为半凝固状态的培养基。
这种培养基可以固定培养液中的微生物，同时也可以使微生物在半固体表面生长繁殖。
半固体培养基一般用于观察微生物的运动和生长情况。
4、厌氧培养法有些微生物需要在无氧或低氧分压条件下生长繁殖，因此需要采用厌氧培养法。
厌氧培养法一般采用密闭容器或厌氧手套箱中进行，可以提供无氧或低氧环境。
在厌氧培养法中，需要使用专门的厌氧培养基和厌氧菌株，以保证微生物的生长繁殖。
5、富集培养法富集培养法是一种常用的分离高浓度微生物的方法。
该方法是通过在培养基中添加一些特殊成分，如高浓度营养物质、抑制剂等，以抑制其他微生物的生长繁殖，从而增加目标微生物的数量和浓度。
富集培养法一般用于从自然界或工业生产中分离特定种类的微生物。
微生物培养方法有很多种，每种方法都有其特定的适用范围和特点。
在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的培养方法，以达到最佳的培养效果。
还需要注意无菌操作、环境控制等方面的技术细节，以保证微生物生长繁殖的良好环境和条件。
微生物的分离培养方法微生物的分离培养是微生物研究中常用的技术之一，它能够将目标微生物从复杂的微生物群体中分离出来，并进行纯培养。
2.微生物的分离培养
一、微生物接种
1．琼脂斜面接种法
主要用于菌落的移种，以获得纯种进 行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑 取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部 向上划一条直线，然后再从底部沿直线向 上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。
2．穿刺接种法
此法多用于半固体培养基或双糖铁、明 胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基 的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时 用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入 至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。
4．衰亡期
稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐 增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活 菌数目急剧下降，出现了“负生长”--叫衰亡 期。其中有一段时间，活菌数按几何级数下降， 故有人称之为“对数死亡阶段”，这一阶段的 细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物， 菌体细胞也呈现多种形态，大小悬殊，有的细 胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴 性反应等 。
（5）比浊法
原理是悬液中细胞浓度与混浊度成正比，
与透光度成反比。细菌越多，透光量越低。 此法比较简便。 但样品颜色不宜太深；样品中不要混杂其 他物质；同时菌悬液浓度必须在107／毫升以上 才能显示可信的混浊度。
2．间接计数法
是基于每个分散的有机体在适宜的培 养基中具有生长繁殖的能力，并且一个活 细胞能形成一个菌落。菌落数就是待测样 品所含的活菌数。
3．稳定期
又称恒定期或最高生长期。长短与菌种和
外界环境条件有关。
处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与 老细胞的死亡数几乎相等，培养物中细胞总数 达到最高水平，此时生长速度逐渐趋向零。接
着死亡细胞数大大超过新增殖细胞数，曲线出
现下降趋势。
3．稳定期
稳定期产生的原因：由于对数期细菌活跃
微生物的计数及分离纯化
微生物的计数
一、目的要求
1、了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握 显微镜下直接计数的技能。
2、学习平板菌落计数的基本原理和方法
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微 镜直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液， 如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢 子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫· 霍泽 （Petrof Hausser）细菌计数板。
血球计数板
是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成 3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分 隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的 刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格 用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另 一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双 线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不 管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即 计数区都由400个小方格组成。
(2)点燃酒精灯。 (3)接种 用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面 上。操作必须按无菌操作法进行。
接种的步骤
1)手持试管 将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其 他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向 操作者，并使它们位于水平位置，如图。 2)旋松管塞 先用有于松动棉塞或塑料 管盖，以便接种时拔出。 3)取接种环 右手拿接种环(如握钢笔 一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然 后将有可能伸入试管的其余部分均灼 烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。
微生物的分离纯化2掌握微生物斜面接种培养的方法和微生物无菌操作计数1平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞通过在分区的平板表面做多次划线稀释形成较多的独立分布的单个细胞经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落通常认为这种单菌落就是某个微生物的纯种2平板划线分离对细菌酵母菌较为适宜而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化
环境中微生物的检测和分离纯化
环境中微生物的检测和分离纯化一、实验目的：1.熟悉常用微生物培养基的配制方法。
2.学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。
3.用平板划线法和稀释法分离微生物。
4.认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。
二、实验原理：（一）微生物的分离与纯化：土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此，土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离和纯化。
常用的是平板分离法。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂，造成抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物。
再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌种。
（二）平板菌落计数法：平板菌落计数法是将样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。
此法缺陷：操作繁琐，结果需要培养一段时间才能取得，测定结果易受多种因素的影响。
此法优点：可以获得活菌的信息，被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测。
三、实验材料和仪器：土样10g，未知菌变形杆菌单菌落平板和无菌水。
取液器（5000ul、1000ul各一支），培养箱，培养皿（20个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，5000ul、1000ul无菌吸头，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。
四、实验步骤：（一）培养基的制备（第二次实验时准备）：肉汤蛋白胨培养基：牛肉膏2g蛋白胨4gNaCl 2g蒸馏水400mL琼脂8g1. 称量：按上述配方称量各类物质。
土壤中的微生物分离纯化和菌相分析
（二）平板划线分离法
1.倒平板 2.划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环， 挑取待测菌悬液一环在平板上划线。划线的方法很 多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将 样品在平板上进行稀释，培养后能形成单个菌落。
划线方法 方法一：用接种环按无菌操作挑取土壤悬液一环， 先在平板培养基的一边作第一次平行线3-4次，再 转动平板约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷 却后挑取悬液穿过第一次划线部分进行第二次划线， 再用同样的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线 或再穿过第三次划线部分进行第四次划线。划线完毕 后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 方法二：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连 续划线，完毕后，盖上培养皿盖，温室培 养。
二、实验原理
三、实验器材
1.土壤 2.培养基： 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（营养琼脂）（50μg/mL制霉菌素 乙醇溶液） 高氏一号琼脂培养基（10滴100g/L石碳酸和50μg/mL制霉菌 素乙醇溶液） 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（1000mL培养基中加入2mL氯霉素） 3.溶液与试剂： 9mL或4.5mL无菌水的试管，90mL无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。 但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各 种因素的影响。
二、实验步骤（方法一）
1.编号：取无菌培养皿6套，分别用记号笔表明 10-4、10-5、10-6各2套。另取6支4.5mL无菌水 的试管，依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。 2.稀释：用1mL无菌吸管准确吸取0.5mL已充分混匀 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液，加入标 有10-1字样的试管中，此为10倍稀释，吸管中多余的菌 液放回试管中。将10-1试管在手掌中或置于振荡器上振 荡，使菌液充分混匀。另取一支1mL吸管插入10-1试管 菌液中吸取1mL，精确的放0.5mL菌液于10-2试管中， 此为100倍稀释……其余依次类推直至所需倍 数。
微生物计数方法
微生物计数方法微生物计数是许多领域中重要的分析方法，包括环境科学、食品科学、医学和生物技术。
正确的计数方法能够准确地估计样品中微生物的数量，对于研究和工业应用都是至关重要的。
下面将介绍几种常用的微生物计数方法。
血细胞计数器法是一种使用显微镜进行微生物计数的经典方法。
该方法使用血细胞计数器对微生物样品进行计数，每个格子中的微生物数量被计算出来，然后进行统计分析。
此方法的优点是准确性高，但是耗时长，操作繁琐，需要熟练的操作人员。
流式细胞术是一种使用流式细胞仪进行微生物计数的现代方法。
该方法将微生物样品通过流式细胞仪进行计数和分析，能够快速准确地测定样品中的微生物数量和种类。
此方法的优点是速度快、精度高、可自动化操作，但是设备成本高，维护成本也较高。
自动细胞计数器法是一种使用自动细胞计数仪进行微生物计数的现代方法。
该方法使用自动细胞计数仪对微生物样品进行计数，能够快速准确地测定样品中的微生物数量和种类。
此方法的优点是速度快、精度高、可自动化操作，而且设备相对较为经济实惠，易于推广应用。
平板计数法是一种常用的细菌计数方法。
该方法将微生物样品涂布在平板上，培养后计算菌落数量，从而得出样品中的细菌数量。
此方法的优点是简单易行、成本低，但是结果受培养条件和操作者技能水平的影响，准确性相对较低。
不同的微生物计数方法具有不同的优缺点，应根据具体的研究目标和实际情况选择合适的方法。
为了提高计数的准确性，需要注意样品的采集、保存、制备和处理等方面的问题，确保样品的质量和代表性。
微生物的分离与计数是微生物学中重要的实验技术之一。
通过分离和计数，我们可以获得微生物群体的相关信息，如种类、数量、生长状况等，对于微生物学研究、应用以及工业生产等领域都具有重要的意义。
选择合适的培养基：根据目标微生物的种类和生长需求，选择适合的培养基。
培养基应具有营养丰富、透明度高、易于观察等特点。
制备样品：从目标环境中采集样品，如土壤、水、食品等，并进行预处理，以去除不需要的杂质和大型生物。
微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数
微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数关键词：微生物分离纯化计数实验原理稀释平板测数是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。
计数时，首先将待测样品制成均匀的繁殖稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使其成单个细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个细胞，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此记数方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。
一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品检定，生物制品检验，土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。
为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。
土壤中的微生物数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠土壤中少。
其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气、pH有关，例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。
本实验以菜园土为材料分离土壤中的好气性细菌，并进行数量测定。
分离微生物时，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其它菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。
分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单个菌落进一步分离纯化。
在用稀释平板分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。
第五章 微生物生长与培养
1.选择和配制培养基的原则和方法
（1）营养物质组成合理，浓度适当，满足菌体 生长需要； （2）在一定条件下，各原料之间不发生化学反 应，理化性质相对稳定； （3）粘度适中，具有适当渗透压； （4）生产中选用的原材料尽量因地制宜，以降 低成本； （5）理化性质适宜，pH、氧化还原电动势也要 满足一定的要求。
样。
在微生物培养和发酵研究中，也需要研究微生物
培养的最佳氮源
生理酸性盐:
微生物代谢后形成酸性物质的某些无
机氮源 如(NH4)2SO4
生理碱性盐: 微生物代谢后产生碱性物质的某些无 机氮源 如 KNO3 生理酸性盐和生理碱性盐具有稳定调节发酵过程中 PH的积极作用。
表 氮源对恶臭假单胞菌 NA-1 菌株生长和酶形成的影响 氮源 硫酸铵 氯化铵 蛋白胨 酵母粉 尿素 谷氨酸 肉汁 硝酸钠 生物量(mg/mL) 1.45 1.33 3.88 4.07 2.53 5.07 3.74 2.62 烟酸羟基化酶活性(unit/mL) 0.002 0.000 0.301 0.288 0.111 0.045 0.371 0.114
②液体好氧培养方法
a. 摇瓶震荡培养箱
b. 台式磁力搅拌不锈钢发酵罐
c. 工业通用型搅拌发酵罐
2.厌氧培养方法
微生物厌氧培养箱
（二）微生物纯培养与混合培养
含有一种以上微生物的培养称作混合培养。自 然环境如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微 生物混杂在一起的群体。 微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖得 到的后代称为纯培养。 研究微生物生长通常采用微生物纯培养。
成分中，可以满足微生物生长的需要，一般不需要 额外添加。
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微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法姓名摘要：纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。
本实验通过稀释涂布平板法和平板划线分离法分离纯化微生物以获得纯培养并进行平板菌落计数，旨在了解微生物的纯培养含义和意义、熟练掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术、了解利用平板菌落计数法测定微生物样品中活细胞的原理、学习平板菌落计数的操作步骤与方法。
实验结果表明，本实验达到了预期的目的。
关键词：微生物的纯培养、微生物的分离与纯化、平板菌落计数法1.引言自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。
人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
只有纯培养物才能提供可以重复的有意义的结果，纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
形状稳定的纯培养（菌种）是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。
稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。
后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。
常用的方法有：（1）简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。
简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。
它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。
将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。
再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。
（2）平板分离法：微生物的平板分离纯化技术自1880年Koch发明以来已有100多年的历史。
该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动植物细胞培养等方面的应用作出了巨大贡献。
由此可见，一项新的重大的微生物学实验技术的建立会对整个生命科学带来革命性的变化。
随着分子生物学的发展和学科的相互渗透，微生物的分离鉴定技术将获得新的突破。
目前发展的PCR、16S rRNA探针杂交技术、荧光抗体技术等已开始用于自然环境中某些特殊微生物的分离、鉴定，特别是对那些现在认为是非可培养的微生物。
平板分离纯化技术的基本原理包括两方面：第一，选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
第二，微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，适用于细菌、酵母等单细胞微生物以及放线菌和霉菌的孢子，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，我们常用菌落形成单位CFU来表示，由此得到的计数结果的单位是CFU/mL，而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。
2.材料和方法2.1材料和试剂实验菌种：大肠杆菌实验培养基：150mL LB固体培养基实验仪器：无菌玻璃涂棒、5支1mL无菌吸管、接种环、10套无菌培养皿、5支盛有4.5mL 无菌水的试管、试管架、恒温培养箱、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、火柴2.2方法2.2.1稀释涂布平板法（1）倒平板。
将150mL LB固体培养基用灭菌锅加热融化（溶解保温，温度100℃，时间30min），之后冷却至55～60℃（不烫手为宜）。
冷却后分别给6套无菌培养皿倒平板。
倒平板的方法是：右手持盛LB培养基的三角瓶置酒精灯火焰旁边，用左手将试管塞轻轻地拔出，试管口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住试管塞。
左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15 mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上10分钟以上，待凝后即为平板。
将平板标记分配（10-3、10-4、10-5的稀释度各两套培养皿）。
（2）系列稀释。
取5支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标记10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。
用1mL无菌吸管吸取0.5mL已充分混匀的大肠杆菌菌液（待测样品）至10-1的试管中，此即为10倍稀释。
将多余的菌液放回原菌液中。
将10-1的试管振荡使菌液充分混匀。
另取一支1mL无菌吸管插入10-1的试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。
用此吸管吸取10-1已充分混匀的菌液0.5mL于10-2的试管中，此即为100倍稀释。
该支无菌吸管放回封套中，并对应着10-1试管。
依次类推，直至最后用吸管吸取10-4菌液0.5mL已充分混匀的菌液于10-5的试管中，此即为105倍稀释。
（3）涂布。
取6套LB培养基已经凝固的无菌培养皿，分别用记号笔标明10-3、10-4、10-5（稀释度，每个稀释度各2套无菌培养皿），用刚才分别与10-3、10-4、10-5的试管对应的无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管稀释菌悬液中各吸取0.2mL，对号放入已写好稀释度的平板中。
用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，将培养皿平放于实验台上室温下静置10～15min，使菌液渗入培养基表层内。
平板涂布方法：将0.2 mL菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置（0.2mL的菌液要全部滴在培养基上，若吸管尖端有剩余的菌液，需将吸管在培养基表面上轻轻地按一下便可）。
右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。
（4）培养。
将LB培养基平板倒置于37℃温室中培养24～48h。
（5）计数、计算。
培养48h后，取出培养皿，首先确定培养皿合适的稀释倍数D（-3、-4、-5），然后统计出某个稀释度下几个平板菌数的平均值X，依据平板上加入菌液量Y mL，得到样品中菌数（CFU/mL）＝(X×D)/Y。
（6）挑取单菌落。
将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，置于37℃的温箱培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。
若发现有杂菌，需再一次进行分离及培养，直至确证纯培养。
最后选择合适的方法保存菌种。
2.2.2平板划线分离法（1）倒平板。
按稀释涂布平板法倒平板，得到3套LB固体培养基。
（2）划线。
在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌菌液一环在平板上划线。
划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
我们使用四分区划线法，其接种步骤是：用接种环以无菌操作挑取大肠杆菌菌液一环，先在平板培养基的一边作第一次平板划线3～4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分做第三次划线和通过第三次平行划线部分做第四次平行划线。
划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
（3）挑取单菌落。
同稀释涂布平板法，进一步划线分离及培养，检测菌落纯度，确证纯培养，选择合适的方法保存菌种。
2.2.3 阴性对照组取一个150mL LB固体培养基作为阴性对照组，不接种大肠杆菌菌悬液，培养方式等其他因素不变。
3.结果图1、图2：用稀释涂布平板法得到的10-3稀释度的两个大肠杆菌培养基图3、图4：用稀释涂布平板法得到的10-4稀释度的两个大肠杆菌培养基图5、图6：用稀释涂布平板法得到的10-5稀释度的两个大肠杆菌培养基图7、图8、图9：用平板划线分离法得到的大肠杆菌培养基图10：阴性对照组，没有接种大肠杆菌的LB固体培养基（1）用稀释涂布平板法系列稀释后可以得到单菌落（图5、图6），培养基涂布均匀，大肠杆菌菌落呈针尖状，达到分离纯化的目的，可以获得纯培养。
（2）用平板划线分离法得到的三个培养基（图7、图8、图9）均有单菌落，培养基涂布均匀，大肠杆菌菌落呈针尖状，达到分离纯化的目的，可以获得纯培养。
（3）用稀释涂布平板法得到的10-5稀释度的两个大肠杆菌菌落培养基中，菌落数分别是840和895。
由此计算得到样品中菌数（CFU/mL）＝（867.5×0.2）／10-5＝1.735×107。
4.讨论（1）用1mL无菌吸管吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。
（2）吸管尖在向盛有无菌水的试管里放菌液的时候不要碰到液面，而且每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液。
否则稀释不精确，结果误差较大。
（3）涂布平板用的菌液量一般以0.2mL较为适宜。
如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。
（4）稀释涂布平板法中利用试管稀释的菌液一定要摇匀使细胞分散。
（5）培养皿一般皿底标记，标记要简单明了。
需要标明操作者和组员、浓度、时间、菌样、添加物等。
（6）用无菌玻璃涂棒涂布培养基的顺序是由低浓度向高浓度，即先涂布10-5稀释度的培养基，再先涂布10-4稀释度的培养基，最后涂布10-3稀释度的培养基。