小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介-推荐下载
小鼠骨髓多染红细胞微核实验
小鼠骨髓多染红细胞微核实验目的和意义微核试验用于检测受试物在哺乳动物所引起的染色体或原红细胞有丝分裂器损伤，以确定该受试物有无诱变性。
通过本次实验学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞微核测定方法。
原理正常细胞的有丝分裂的分裂中期，染色体均匀地排列在赤道板附近，到分裂后期便分成两份，分别向两极移动，并在末期分别形成两个子细胞的核。
如果由于某种化学物质的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤，在中期就会观察到染色体断裂，在进入分裂后期时，这种断片落后于向两极移动的染色体而滞留在赤道板附近，当其它染色体分别形成子细胞核时，这些落后的断片便独立形成微核，如果纺锤体功能受损，也可产生微核。
由上可见，微核的出现和染色体畸变有密切相关性，同时微核的观察是在细胞的间期，不必分析中期相，这比分析染色体畸变要方便一些。
进行骨髓细胞微核分析一般观察红细胞，记数嗜多染红细脑中微核出现率。
器材与试剂1、器材载玻片、推片、血细胞计数器、滴管、注射器、解剖剪、镊子、止血钳、晾片架、滤纸、电吹风机、染色缸、研钵、恒温水浴箱、光学生物显微镜（或荧光显微镜）。
2、试剂小牛血清；甲醇；吉姆萨储备液：将1g 吉姆萨倒入研钵内，加入少许甘油混合研细，分次倒入剩余的甘油至66ml，转移到烧杯内（或试剂瓶内）。
放入55~60℃水浴中并不断搅动至2h。
取出冷却后加入60ml甲醇，混匀后置室温，2~3周后过滤，保存于棕色瓶内备用（存放时间越长染色效果越好）。
吉姆萨染色液：实验前取吉姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀。
磷酸盐缓冲液（pH 6.8）阳性对照物：环磷酰胺。
操作步骤一、试验动物及处理1、动物的选择：选用小鼠，每组10只动物，雌雄各半。
小鼠体重在18~20g，7~12w。
2、染毒途径：采用腹腔注射给药。
3、剂量选择：环磷酰胺按50mg/kg剂量染毒，同时设立阴性对照（空白对照）。
4、染毒次数和取样时间：采用30h给药法，即两次给药间隔24h，在第二次给药后6h处死动物采集骨髓。
小鼠骨髓细胞微核试验
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4.3 固定
将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇 溶液固定15分钟，取出，晾干。不能及时 染色的涂片也应固定好保存。
4.4 染色
将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的 Giemsa (Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐 缓冲液9份) 染色10~15分钟，冲洗，晾干。
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MN NCE
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红细胞
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电镜
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单个微核
多个微核
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Hale Waihona Puke 16医学ppt17
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3 器材与试剂
3.1 器材 解剖器械，生物显微镜，载玻片 等。
3.2 试剂 甲醇（分析纯）、甘油（分析 纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa 储备 液、 pH 6.8磷酸盐缓冲液
3.3 阳性对照物 环磷酰胺
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4 操作步骤
4.1 试验动物及处理
动物选择 小鼠是微核试验的常规动物，通常用7～12
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4.5 观察计数
低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀， 着色适当的区域，再在油镜下观察计数。
多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞 （NCE）呈橘黄色。典型的微核多为单个、 圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致， 呈紫红色或蓝紫色 。
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计 数200个细胞中PCE与NCE的比值。
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化学致突变物
染色体
作用于纺锤丝
无着丝点,片或环
整条染色体 带着丝粒的环和断片
形成微核
小鼠骨髓多染红细胞微核试验(氟化钠)
若微核发生在雌雄间有明显差异时，需按照性别分别进行统计分 析。 PCE/(PCE+NCE)不低于对照值的20%
PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCE值与阴性对照组比较有统 计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重 抑制；如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
小鼠骨髓多染红细胞微核实验中
3. 微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以与正常核的分 叶及核突出物区分，故常计数PCE细胞中的微核，因为成红细 胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜 碱性约24小时，然后成为NCE,并进入外周血。 4. 在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。因此，这些在细 胞中没有主核，便于观察。观察并计数多染红细胞中的微核， 可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。本试验的测试终点为染 色体损伤。
?再计数200个红细胞记录pce在总红细胞pcence中的比例作为对细胞毒性的指标多染红细胞pce正染红细胞nce微粒浅兰色胞浆呈颗粒状油画淡红色胞浆呈均质状水彩画圆形或椭圆形边缘光滑染色与有核细胞的核一致紫红色大小约为红细胞的12015文档仅供参考不能作为科学依据请勿模仿
小鼠骨髓多染红细胞微核试验
• 本次实习采用一次染毒， 24小时后取样测定
操作步骤
24小时后 染毒 取材 制片 染色 镜检
取骨
擦净血污、剔去肌肉
பைடு நூலகம்
pH=6.4 Giemsa染色液染色10-15min
冲洗、晾干
剪去骨骺端 小 牛 pH=6.4 血 清 甲醇中固定2min 吹 干 混匀、推片 镜检、细胞计数
镜检
实验三小鼠骨髓细胞微核试验
实验三小鼠骨髓细胞微核试验实验三：小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的本实验旨在通过观察小鼠骨髓细胞微核率的变化，了解并评估骨髓细胞受到的损伤程度，为进一步研究生物样品中的毒性物质及其潜在危害提供依据。
二、实验原理微核试验是一种检测染色体畸变的快速、敏感的方法，常用于评价各种因素对机体的遗传毒性。
微核是由染色体的片段或整个染色体在细胞分裂后期或末期未能进入子代细胞核而形成的，因此微核率的高低可反映细胞染色体受损的程度。
骨髓细胞微核试验常用于检测体内外接触毒物的程度及检测药物的遗传毒性。
三、实验步骤1.选取健康的成年小鼠，进行试验前处理，包括脱毛、称重等。
2.对小鼠进行腹腔注射或口服给予不同剂量的待测毒物。
3.分别于24小时、48小时和72小时三个时间段采集小鼠骨髓细胞，制备骨髓细胞涂片。
4.对涂片进行染色处理，以便观察和计数。
5.在显微镜下观察每个涂片，记录微核数并计算微核率。
6.统计分析数据，对比不同剂量组与对照组的微核率差异。
7.根据实验结果，评估待测毒物的遗传毒性及对骨髓细胞的损伤程度。
四、实验结果与数据分析经过对小鼠骨髓细胞微核率的观察和计数，我们得到了不同剂量组与对照组的微核率数据。
通过对比分析，我们发现随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
这表明待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致骨髓细胞的损伤。
为了更直观地展示实验结果，我们可以使用柱状图或折线图来表示不同剂量组与对照组之间的微核率差异。
通过观察图表，可以清楚地看到随着毒物剂量的增加，微核率也逐渐升高。
这进一步证实了待测毒物的遗传毒性和对骨髓细胞的损伤作用。
五、实验结论通过本实验，我们得出以下结论：1.待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致小鼠骨髓细胞的损伤。
2.随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
3.实验结果提示，待测毒物可能对机体产生一定的危害作用，需要进一步研究其对人体健康的潜在影响。
4.微核试验作为一种快速、敏感的检测方法，可用于评估生物样品中的毒性物质及其潜在危害。
实验3-小鼠骨髓细胞微核试验-20121101
3.染毒次数及取样时间： 一般采用多次染毒方法，常用的 比较合理、方便的方法是 4 次染毒，即 每天染毒一次，连续 4 天，第 5 天（即 最 末 一 次 染 毒 后 24 小 时 ） 取 样 。 这 样 ， 仅 仅 取 样 一 次 就 能 复 盖 24~72 小 时，而且如果高峰在96小时，也不会漏 掉。（2次染毒，末一次染毒后6小时） 取样）
４.染毒剂量选择： 如有受试化学物的LD50资料，通常选 1/2 LD50作为高剂量，1/20 LD50为低剂 量，中间再安排两个剂量，并同时设立 阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组 一般用环磷酰胺（小鼠按50～100 mg/kg )，按0.1ml/10g的体积，腹腔注 射一次或二次；阴性对照使用等体积的 溶剂注射.
实 验 四 小鼠骨髓细胞微核试验
一．实验目的
1.了解遗传毒理学技术和方法 2.掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE） 微核测定方法
二. 实验原理
染色体 断裂
影响纺 缍丝
染色体 化学致突变物
无着丝点,片或环
作用于纺锤丝
整条染色体 带着丝粒的环和断片
形成微核
于细胞分裂末期细胞质中
微核成因
1. 正常细胞在有丝分裂后期其染色体 逐渐从赤道向两极移动并在末期成为 两个子细胞的核心，若染色体断裂或 损伤，则它们在有丝分裂后期不能正 常向两极移动而滞留形成微核，从而 在有丝分裂的间期看到微核。
四、注意事项
1.Giemsa染液pH6.8是细胞染色质量的 重要保证； 2.推制良好的骨髓涂片是本试验的关 键步骤； 3.正确区分PCE细胞、NCE细胞及白细 胞； 4.正确区分微核与染料颗粒。
成熟红细胞模式图
红细胞
电镜
MN NCE
Thanks!
微核试验
5．观察计数 先在低倍镜下观察，选择 分布均匀，染色较好的区域，再在油镜 下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，正染 红细胞（NCE）呈桔黄色。一个细胞内 可出现一个或多个微核。计数200个 PCE中含有微核的PCE数.
结果统计
本试验中只计数PCE中的微核。每一动 物为一观察单位，每组动物分别计算微 核PCE的均值。全班一起用t一检验统计。
什么是PCE?简单的说PCE就是一种刚 排核而未成熟的红细胞。红细胞是在骨 髓中生成的，骨髓中的红系祖细胞经过 数次分裂，最后脱核成为成熟的红细胞。 脱核后早期，红细胞内血红蛋白的主要 成分球蛋白的合成旺盛，因此胞质中存 在大量的核糖体，Giemsa染色呈灰蓝色， 这就是PCE。随着球蛋白合成完毕，核 糖体完全分解，PCE逐渐形成成熟的正 染红细胞。
注意事项
操作时推制良好的骨髓涂片及良好的染 色，是本实验的关键步骤。
熟悉并正确区分各种骨髓细胞。
MN NCE
பைடு நூலகம்细胞
电镜
单个微核
多个微核
（二）器材 晾片架， 1ml注射器及针头，载玻片及 推片，止血钳，显微镜（油镜头），细 胞计数器。
（三）动物 昆明种小鼠，体重24-28g，雄性。
实验方法
1．染毒：每组取小鼠4只，称重随机分 成二组，一组生理盐水组，腹腔注射生 理盐水0.2ml/10g，一组为环磷酰胺组， 环磷酰胺接100mg/kg腹腔注射 （0.2ml/10g）。
2．涂片 给药24小时后用颈椎脱臼方法 处死动物，四肢固定于解剖板，剖开胸 腹部，取下胸骨，剔去肌肉。将胸骨骨 髓挤于有一滴小牛血清的载玻片上，推 片。
3．固定 将推好晾干的标本玻片放入甲醇 溶液固定15分钟，取出晾干。
4．染色 用新鲜配制的10%Giemsa染液染 色15分钟。冲洗后晾干。
小鼠骨髓多染红细胞微核试验
小鼠骨髓多染红细胞微核试验实验原理微核是由细胞分裂末期滞留的染色体片段或整条迟滞的染色体在分裂间期的子代细胞浆内形成的游离团块物质。
微核实验作为细胞遗传损伤的标志之一，可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测。
当骨髓成红细胞发展成为红细胞时，主核排除，成为多染红细胞，这些细胞保持其碱性约24小时，然后成为正染红细胞，并进入外周血中。
在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。
由于这些细胞没有主核，便于观察微核。
观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。
本次试验的检测终点为染色体损伤。
一、实验动物健康的成年ICR小鼠50只，体重18-22g，每组10只，雌雄各半，随机分组。
二、试剂与其器材40%工业久效磷，环磷酰胺，PH6.8的小牛血清，甲醇，PH6.8的磷酸缓冲液，Giemsa 染液；注射器、小鼠灌胃针头、动物秤、剪刀、镊子、纱布、载玻片、染色盘、染色架、固定用染色缸、显微镜。
三、试验方法1.实验动物：采用配伍组设计法对小鼠进行分组。
每组10只，共5组。
2.剂量分组：设置阳性对照及阴性对照组。
阳性对照物采用120mg/kg环磷酰胺，阴性对照物采用蒸馏水。
此外设计三个剂量组，分别为高中低剂量组。
通常取受试物LD50的1/2,1/4,1/8等剂量。
剂量分别为13.2mg/kg，6.6mg/kg，3.3mg/kg。
3.染毒途径：经口灌胃染毒。
4.染毒次数及骨髓采样时间：一次染毒，24小时后取样测定。
5.取材：按照上述步骤染毒24小时后，颈椎脱臼处死动物，仔细剥离并取下一侧后肢股骨。
用纱布擦净碎肉，减去股骨两端，露出骨髓腔，用注射器吸取少量小牛血清冲洗骨髓腔数次，冲洗物滴在玻片上。
6.制片：蘸取骨髓液，推片3张，干燥后取其中较好的两张用甲醇固定5分钟。
7.染色：用1:9的Giemsa-磷酸缓冲液（PH6.8）染色约10-15分钟，自来水冲洗后，自然干燥。
8.镜检：每只小鼠选择一张染色最成功的片子，在低倍镜下观察染色及分散情况。
(x)小鼠骨髓嗜多染红细胞微
结果评价
♦ 正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千
分之五以下，超过千分之五为异常 。
实验步骤（制片）
♦ (4)固定 放在甲醇液中固定5~1Omin，如
当日不染色，也需固定后保存。 ♦ (5)染色 在Giema应用液中染色10~l5min， 最后用蒸馏水冲洗。
观察计数
♦ 选择细胞分散均匀、形态完整、染色良好的区
域，在油镜下按一定顺序进行嗜多染红细胞 (PCE)及微核计数。嗜多染红细胞呈灰蓝色， 而成熟红细胞呈桔红色。PCE中微核的嗜色性 与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。典型的微核 呈圆形，边缘光滑、整齐，其直径通常为红细 胞的1/20~1/5。偶尔也可呈椭圆形、肾形、马 蹄形及环形。PCE中微核多数为一个，也可能 有两个或两个以上的微核，此时仍按一个有微 核的PCE计算。每只动物计数200O个PCE，观察 含有微核的PCE数，微核率以千分率表示。
实验原理
♦ 骨髓中PCE数量充足，微核容易辨认，
而且微核自发率低。由于这些优点，骨 髓的PCE细胞成为骨髓微核试验的首选 细胞群。故一般检查嗜多染红细胞中微 核的多少来鉴别是否异常;
试剂和材料
♦ 主要试剂 ♦ 胎牛血清 ♦ 材料： ♦ 小平皿、滤纸、载玻
片、离心机、显微镜 ♦ 成年小鼠，体重1822克。
实验步骤（制片）
♦ (2)离心 以10OOrpm离心5min，用毛细吸
管吸去上清液。如沉淀物较多，可留下 少许血清，否则应吸去全部上清液。最 后，用毛细吸管尖端把沉淀物混匀。 ♦ (3)涂片 吸取一小滴混悬液滴于玻片的 一端，按常规血涂片法涂片，约2·3cm长 度，在空气中晾干(若立即染色，可在酒 精灯上稍加烘烤)。
实验步骤
♦灌药 ♦制片
实验步骤（灌药）
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小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介
微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验目的
1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法
2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突
变剂的测定方法
3.进一步熟练制片和镜检操作
器材与试剂
1.器材
手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机
2.试剂
甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺
操作步骤
1.试验动物及处理
（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）
（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照
（溶剂组）
2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死
动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。
混匀后推片。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取
出晾干。
4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。
5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密
适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。
PCE细胞呈灰蓝色、成熟红细胞呈橘黄色。
微核多数为圆形，边缘整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。
PCE细胞中微核多为一个，也可有两个或以上微核，此时仍按有微核的PCE计算。
计算微核率即1000个细胞中含微核的PCE数。
同时考虑200
个细胞中PCE与NCE的比值。
（可作为细胞毒性指标：0.6-1.2正常；
<0.1表明PCE形成收到严重抑制；<0.05受试物剂量过大，结果不
可靠）
结果评价
1. 结果分析指标为微核率
2.评价：微核实验阳性的两个判断标准为：微核率有明显的剂量反
应关系；至少在某一剂量能显示出可重复的并与对照组比较具有统计学意义的阳性反应。
注意事项
1.防止小牛血清污染
2.胸骨须擦拭干净，以免影响结果。
3.涂片不要过厚或过薄。
4.选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染色好的区域镜检。
由
低倍镜到高倍镜，并按一定顺序镜检。
5.注意微核与颗粒异物的区分，PCE与其他骨髓细胞不同阶段血
细胞区分。