第五章 双水相萃取
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《双水相萃取技术》课件
影响因素
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
第5章 双水相萃取
27
双水相系统的相图可由实验测定： 双水相系统的相图可由实验测定
以此类推， 以此类推，由实验测定一系列双节线上 的系统组成点，以高聚物P浓度对高聚物 的系统组成点，以高聚物 浓度对高聚物 Q浓度作图，即可得到双节线 浓度作图， 浓度作图
28
2.3 常用的双水相体系
29
常用体系
双水相萃取中常采用的双聚合物系 统为PEG/Dex，该双水相的上相富 ， 统为 含PEG，下相富含 ，下相富含Dex。 。
4
概述: §1. 概述
问题的提出： 问题的提出：常规的分离方法 1． 过滤和离心技术 ． 已被广泛地应用于固液分离工程中， 已被广泛地应用于固液分离工程中， 但这两种单元操作依赖于被分离颗粒的 尺寸或密度的差异， 尺寸或密度的差异，因此当希望收集微 生物的细胞器、分离去除细胞碎片、 生物的细胞器、分离去除细胞碎片、提 取和浓缩胞内物质时，普通的过滤和离 取和浓缩胞内物质时， 心技术就不合适。 心技术就不合适。
36
(1)高聚物的分子量 高聚物的分子量
在高聚物浓度保持不变的前提下， 在高聚物浓度保持不变的前提下，降 低该高聚物的分子量， 低该高聚物的分子量，被分配的可溶性 生物大分子如蛋白质或核酸， 生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如 细胞或细胞碎片和细胞器， 细胞或细胞碎片和细胞器，将更多的分 配于该相。 体系而言， 配于该相。对PEG – Dcxtran体系而言， 体系而言 Dextran分子量减小，分配系数会减小； 分子量减小， 分子量减小 分配系数会减小； PEG 的分于量减小，物质的分配系数会 的分于量减小， 增大(见表 见表2-13)，这是一条普遍规律。 增大 见表 ，这是一条普遍规律。
7
双水相萃取技术的优点： 双水相萃取技术的优点：
双水相系统的相图可由实验测定： 双水相系统的相图可由实验测定
以此类推， 以此类推，由实验测定一系列双节线上 的系统组成点，以高聚物P浓度对高聚物 的系统组成点，以高聚物 浓度对高聚物 Q浓度作图，即可得到双节线 浓度作图， 浓度作图
28
2.3 常用的双水相体系
29
常用体系
双水相萃取中常采用的双聚合物系 统为PEG/Dex，该双水相的上相富 ， 统为 含PEG，下相富含 ，下相富含Dex。 。
4
概述: §1. 概述
问题的提出： 问题的提出：常规的分离方法 1． 过滤和离心技术 ． 已被广泛地应用于固液分离工程中， 已被广泛地应用于固液分离工程中， 但这两种单元操作依赖于被分离颗粒的 尺寸或密度的差异， 尺寸或密度的差异，因此当希望收集微 生物的细胞器、分离去除细胞碎片、 生物的细胞器、分离去除细胞碎片、提 取和浓缩胞内物质时，普通的过滤和离 取和浓缩胞内物质时， 心技术就不合适。 心技术就不合适。
36
(1)高聚物的分子量 高聚物的分子量
在高聚物浓度保持不变的前提下， 在高聚物浓度保持不变的前提下，降 低该高聚物的分子量， 低该高聚物的分子量，被分配的可溶性 生物大分子如蛋白质或核酸， 生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如 细胞或细胞碎片和细胞器， 细胞或细胞碎片和细胞器，将更多的分 配于该相。 体系而言， 配于该相。对PEG – Dcxtran体系而言， 体系而言 Dextran分子量减小，分配系数会减小； 分子量减小， 分子量减小 分配系数会减小； PEG 的分于量减小，物质的分配系数会 的分于量减小， 增大(见表 见表2-13)，这是一条普遍规律。 增大 见表 ，这是一条普遍规律。
7
双水相萃取技术的优点： 双水相萃取技术的优点：
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
第五章萃取技术.课件
有机溶剂中胶束 的表面活性剂分子的 疏水尾部向外，而亲 水头部向内，称为反 胶束。
当表面活性剂在有机溶剂中形成 反胶束时，水在有机溶剂中的溶解 度随表面活性剂浓度线性增大。
通过测定有机相中平衡水浓度的 变化，可以确定形成反胶束的最低 表面活性剂浓度。
反胶束的形成是表面活性剂分子 自发形成的纳米尺度的聚集体，是热 力学稳定的体系。
K a AH
（5-3）
其中，Ka为弱酸的解离常数；
[AH]和[A-]分别为游离酸和其酸根离 子的浓度。
如果在有机相中溶质不发生缔和， 仅以单分子形式存在，则游离的单分 子溶质符合分配定律，其分配常数为
Aa
AH
AH
（5-4）
其中，AH 表示有机相中游离酸的
浓度，Aa为游离酸的分配常数。
利用一般的分析方法测得的水 相浓度为游离酸和酸根离子的总 浓度，故为方便起见，用水相总
3．物理萃取和化学萃取
物理萃取
定义：溶质根据相似相溶原理在两相间 达到分配平衡，萃取剂与溶质间不发生 化学反应。
应用：广泛应用于抗生素及天然植物中 有效成分的提取。如利用乙酸丁酯萃取 青霉素。
化学萃取
定义：利用脂溶性萃取剂与溶质的化 学反应生成脂溶性复合分子，使溶质 向有机相分配。
应用：用于氨基酸、抗生素和有机酸 等生物产物的分离回收。
液体
双水相萃取
萃取剂
液固萃取（浸取）
固体原料 超临界流体
液体原料
2．反 萃 取
定义：调节水相条件，将目标产物从有机相 转入水相的操作。
作用：为了进一步纯化目标产物或便于后续 分离操作。
洗涤：常常加在萃取与反萃取操作之间，目 的是除去与目标产物同时萃取到有机相的杂 质，提高反萃取液中目标产物纯度。
当表面活性剂在有机溶剂中形成 反胶束时，水在有机溶剂中的溶解 度随表面活性剂浓度线性增大。
通过测定有机相中平衡水浓度的 变化，可以确定形成反胶束的最低 表面活性剂浓度。
反胶束的形成是表面活性剂分子 自发形成的纳米尺度的聚集体，是热 力学稳定的体系。
K a AH
（5-3）
其中，Ka为弱酸的解离常数；
[AH]和[A-]分别为游离酸和其酸根离 子的浓度。
如果在有机相中溶质不发生缔和， 仅以单分子形式存在，则游离的单分 子溶质符合分配定律，其分配常数为
Aa
AH
AH
（5-4）
其中，AH 表示有机相中游离酸的
浓度，Aa为游离酸的分配常数。
利用一般的分析方法测得的水 相浓度为游离酸和酸根离子的总 浓度，故为方便起见，用水相总
3．物理萃取和化学萃取
物理萃取
定义：溶质根据相似相溶原理在两相间 达到分配平衡，萃取剂与溶质间不发生 化学反应。
应用：广泛应用于抗生素及天然植物中 有效成分的提取。如利用乙酸丁酯萃取 青霉素。
化学萃取
定义：利用脂溶性萃取剂与溶质的化 学反应生成脂溶性复合分子，使溶质 向有机相分配。
应用：用于氨基酸、抗生素和有机酸 等生物产物的分离回收。
液体
双水相萃取
萃取剂
液固萃取（浸取）
固体原料 超临界流体
液体原料
2．反 萃 取
定义：调节水相条件，将目标产物从有机相 转入水相的操作。
作用：为了进一步纯化目标产物或便于后续 分离操作。
洗涤：常常加在萃取与反萃取操作之间，目 的是除去与目标产物同时萃取到有机相的杂 质，提高反萃取液中目标产物纯度。
双水相萃取详细资料
三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水 相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度 分散的系统，分散相液滴在10μm一下，有很大的表面积，有利于 底物和产物的传递。
PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可 加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多 糖和核酸，它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中， 而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使 蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体 PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体 PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残 余的PEG以提高产品的纯度。
第五节_双水相萃取
二、双水相萃取的原理
• 双水相萃取的原理 • 是生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物 质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用 和各种作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的 存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不 同，即分配系数不同。
三、影响分配系数因素
１、聚合物：不同聚合物的水相系统显示出不同 的疏水性，同一聚合物的疏水性随分子量的增加 而增加。 ２、pH：主要针对蛋白质及酶的稳定性。 ３、无机盐：离子环境影响溶质（蛋白质）在两 相系统中的分配。 ４、温度：分配系数对温度的变化不敏感，所以 室温操作即可。
双水相的形成
将两种不同的水溶到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这
就是双水相体系。这种含有不同聚合物分子的溶液发生分 相的现象叫聚合物的不相容性。
形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子 的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而 具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。
常用的双水相体系
高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简 称Dextran) 高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机 盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。
PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖(dextran)
第五节 双水相萃取
(Aqueous two-phase extraction, ATPE)
定义：利用物质在互不相溶的两水相间分配系 数的差异来进行萃取的方法。
一、双水相的形成 二、双水相萃取的原理 三、影响分配系数因素 四、双水相萃取的优点 五、 双水相萃取的应用
一、双水相的形成
1896年Beijerinck发现， 当明胶与琼脂或明胶与可 溶性淀粉溶液相混时，得 到一个混浊不透明的溶液， 随之分为两相，上相富含 明胶，下相富含琼脂（或 淀粉）。
第五章 双水相萃取
多项选择题
4.双水相系统的性质主要取决于下列物理化学多 数中的（ ABCDE ） A.密度 B.两相间的密度差 C.黏度 D.两相间的黏 度差 E.表面张力 5.大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不 需冷却。这是基于以下原因：（ ABC ） A.成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下 蛋白质一般不会发生失活或变性 B.常温下溶液黏度较低，容易相分离 C.常温操作节省冷却费用 D.常温下溶液的表面张力比较小，反应易于进行
单项选择题
4.下列盐析效应强弱次序正确的是（ A ） A. Al3+＞Mg2+ B. Mg2+＞Al3+ C. Na+＞Mg2+ D. K+＞Na+ 5.不同有机溶剂分相效果不同，下列正确的是（ B ） A.异丙醇＞乙醇＞丙酮 B. 异丙醇＞丙酮＞乙醇 C. 乙醇＞异丙醇＞丙酮 D. 丙酮＞异丙醇＞乙醇 6.下列双水相体系中那种的分相能力强（ B ） A. 异丙醇/硫酸铵 B. 异丙醇/磷酸氢二钾 C. 乙醇/硫酸铵 D. 乙醇/磷酸氢二钾
论述题
1．PEG双水相萃取的工艺流程。
答： PEG双水相的工艺流程主要有三部分：目 双水相的工艺流程主要有三部分： 双水相的工艺流程主要有三部分 标产物的萃取； 的循环； 标产物的萃取；PEG的循环；无机盐的循环。 的循环 无机盐的循环。 （1）目标产物的萃取 细胞悬浮液经球磨机 ） 破碎细胞后， 破碎细胞后，与PEG和无机盐或葡聚糖在萃取 和无机盐或葡聚糖在萃取 器中混合，然后进入离心机分相。 器中混合，然后进入离心机分相。通过选择合适 的双水相组成， 的双水相组成，一般使目标蛋白质分配到上相 而细胞碎片、 （PEG相），而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋 相），而细胞碎片 核酸、 白质分配到下相（富盐相）。 白质分配到下相（富盐相）。
双水相萃取ppt
天然植物药用有效成分的分离与提取
中草药是我国医药宝库中的瑰宝 ,已有数千 年的历史 ,但由于天然植物中所含的化合物 众多 ,特别是中草药有效成分的确定和提取 技术发展缓慢 ,使我国传统中药难以进军国 际市场。因此 ,采用具有较高选择性和专一 性的双水相萃取技术对中草药有效成分的 提取是一项很有意义的工作。利用双水相 萃取中草药有效成分具有代表性的工作是 对黄岑甙和黄岑素的分离。
抗生素的分离与提取
数抗生素都存在于发酵液中 ,提取工艺路线复杂 ,能耗 高 ,提取过程易变性失活。而双水相萃取在抗生素中具 有较大的应用价值 ,萃取提取涉及到各类抗生素。β 内酰胺类抗生素是抗生素家族中应用最多的一类 ,主要 由青霉素类和头孢菌素类构成。对青霉素进行工业化意 义的双水相萃取是结合传统工艺溶媒萃取法进行的。先 以 PEG2000/ (NH4) 2SO4系统将青霉素从发酵液中提取 到 PEG相 ,后用醋酸丁酯(BA)进行反萃 ,再结晶 ,处理 1000ml 青霉素发酵液 ,得青霉素晶体 7. 228g ,纯度 84. 15 % ,三步操作总收率 76. 56 %。
酶工程药物的分离与提取
酶在医药方面的应用一是作为药用酶 ,二是用作化学合 成药物中的酶催化剂。迄今 ,双水相萃取技术已广泛应 用于生物大分子、细胞、细胞器、蛋白质、核酸、病毒、 细菌、蓝藻、叶绿素、线粒体、 菌体等的分离与提取 , 几乎所有的酶均可用此技术仅通过调节 pH、合物和盐的 种类或浓度 ,选择合适的分离条件就可进行理想的分离 纯化。目前双水相萃取技术已成功应用于已较大规模提 取纯化的酶有几十种 。其中成功地实现从微生物细胞碎 片中提取纯化甲酸脱氢酶 ,其分离经 4 次连续萃取 ,已 达处理 50kg 湿细胞规模 ,处理的酶蛋白含量已高达 150g ,收率为 90 %～100 % ,由于工艺简单 ,原材料成 本较低 ,产品的价格也有大幅度降低。
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• 盐离子 • pH值 • 温度
五、双水相萃取工艺流程
六、双水相萃取应用
1）蛋白酶的提取、纯化 2）核酸的提取、纯化 3）细胞调节生长因子的提取：β—干扰素、EPO等 4）病毒的提取、纯化 5）生物活性物质的分析检测
七、双水相萃取的研究进展
1. 2. 廉价双水相体系的研究开发 双水相萃取与其它分离技术的结合
5.Βιβλιοθήκη 6.第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction）
一、概述
1、定义——利用生物物质在
互不相溶的两水相间分配系数的 差异进行分离的过程
PEG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
2、双水相体系
1) 双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力
思考题
1. 2. 3. 4. 何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两 种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分 离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH 是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目 标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分 布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？
• 作用力为斥力：形成双水相体系 • 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高聚物相，一相 为水相 • 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相
2)双水相体系的种类
–
–
两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）
其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）
–
–
两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）
其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）
二、双水相系统的相图
三、双水相萃取的分配平衡公式
c1 1 A Z（U 1 U 2） exp c2 KT
四、影响双水相萃取分配平衡的因素
• 高聚物的种类与浓度 • 高聚物的分子量
一般规律：对于给定的双水相萃取系统，如果其中一种高 聚物被较低分子量同种高聚物所代替，则被萃取的生物大 分子物质将有利于在低分子量高聚物的一相富集。