厌氧菌及检验
临床检验主管技师 微生物检验 第十七章 厌氧性细菌及检验
第十七章厌氧性细菌及检验本章内容一、概述厌氧菌的分类厌氧菌的临床意义厌氧菌感染厌氧菌标本的采集与送检厌氧菌的分离与鉴定厌氧环境的指示二、常见厌氧菌破伤风杆菌产气荚膜梭菌肉毒梭菌艰难梭菌厌氧球菌无芽胞厌氧菌厌氧菌概述一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。
G+有芽胞的梭菌：有芽胞，抵抗力强，广泛存在，可出芽繁殖，产生多种外毒素，引起严重疾病。
G+/G-无芽胞的球菌与杆菌：人体正常菌群，可存在于口腔、肠道、上呼吸道、泌尿生殖道等。
致病性属条件致病性的内源性感染。
厌氧菌概述——分类《伯杰系统细菌学手册》分类标准：无芽胞厌氧菌有40多个菌属，300多个菌种和亚种；而有芽胞的厌氧菌只有梭菌属，包括130个种。
据耐氧性分类（1）专性厌氧菌：是指在降低氧分压的条件下才能生长的细菌。
又分为极度厌氧菌（氧分压＜0.5%，空气中暴露10min致死，如丁酸弧菌）和中度厌氧菌（氧分压为2%～8%，空气中暴露60～90min能生存，如大多数人类致病厌氧菌）。
（2）微需氧菌：能在含5%～10%CO2空气中的固体培养基表面生长的细菌，如弯曲菌属。
（3）耐氧菌：其耐氧程度刚好能在新鲜配制的固体培养基表面生长。
一旦生长，暴露数小时仍不死亡，如第三梭菌、溶组织梭菌。
厌氧菌概述——临床意义及感染感染类型外源性感染：梭状芽胞杆菌属引起的感染。
内源性感染：无芽胞厌氧菌大多数是人体正常菌群，属于条件致病菌，在一定条件下可引起感染，一般不在人群中传播。
感染的危险因素：组织缺氧缺血；机体免疫功能下降；某些手术及创伤易发生厌氧菌感染；长期应用某些抗菌药物；深部需氧菌感染。
感染的临床指征：感染局部产生大量气体；多发生在黏膜附近；深部外伤后继发感染；分泌物有恶臭或为暗红色；常见于长期应用氨基糖苷类抗生素治疗无效的病例；镜检有细菌，常规培养阴性。
厌氧菌概述——标本的采集与送检重要原则：标本绝对不能被正常菌群所污染；应尽量避免接触空气。
适宜标本血液、骨髓、脑脊液、关节液、心包液、胸腔积液、腹腔液、胆汁、由活检或尸体解剖获得的组织标本、深部脓肿抽取物、经环甲膜以下或肺穿刺抽取的肺渗出物、后穹窿穿刺抽取的盆腔渗出液及无菌套管抽取的宫腔内容物、膀胱穿刺液及其它组织穿刺液等不宜标本鼻咽拭子、齿龈拭子、直肠拭子、喀出的痰液、自然排出的尿液和导出的尿液、流出的脓液、接近皮肤或黏膜的分泌物、阴道分泌物、胃和小肠内容物、粪便（艰难梭菌除外）等厌氧菌概述——标本的采集与送检采集多采用针筒抽取、穿刺等，应严格无菌操作，严禁接触空气。
谈厌氧菌检验的重要性及注意事项
谈厌氧菌检验的重要性及注意事项目的：研究厌氧菌检验的重要性及注意事项。
方法：结合临床经验，回顾性阐述厌氧菌检验的注意事项。
结果：厌氧菌在感染性疾病中的致病作用日益受到临床重视。
临床感染的很多实例证明开展厌氧菌检验极为必要。
结论：不同地区和不同医院厌氧菌的耐药谱不同，经验用药时要根据本地区和本实验室的药敏谱选药。
因此，为提高疗效，减少抗生素的毒副作用，最好根据药敏试验选择药物治疗。
标签：厌氧菌；无氧；培养；检验厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行。
它能引起人体不同部位的感染，包括阑尾炎、胆囊炎、中耳炎、口腔感染、心内膜炎、子宫内膜炎、脑脓肿、心肌坏死、骨髓炎、腹膜炎、脓胸、输卵管炎、脓毒性关节炎、肝脓肿、鼻窦炎、肠道手术或创伤后伤口感染、盆腔炎以及菌血症等。
厌氧菌在感染性疾病中的致病作用日益受到临床重视，临床感染的很多实例证明开展厌氧菌检验极为必要。
1 厌氧菌检验概况过去我国厌氧菌培养在实验室检验中开展的并不理想，临床医生重视程度不够，大多数实验室没有将厌氧菌培养作为常规检验开展，加上厌氧菌培养方法学落后，且受培养基的配制和保存的限制，制约了厌氧菌培养在实验室中的正常开展，造成厌氧菌的漏检率很高。
据报道[1]，我国从未开展过厌氧菌培养的实验室占77%之多，有90%的实验室没有鉴定厌氧菌的设备，几乎所有临床细菌室均不开展厌氧菌药敏试验。
近年来，国内从临床感染病例中分离出厌氧菌的报道日益增多，临床医生已认识到厌氧菌在感染性疾病中的重要性，并能识别厌氧菌的重要特征，能认真、正确地采样、送检，且随着厌氧菌培养技术的不断进步，厌氧菌检验已成为临床细菌学检验的重要组成部分。
为提高感染性疾病的病原学诊断水平，开展厌氧菌培养是非常必要的。
据资料显示，如仅做需氧菌培养，在23份漏检标本中检出9株厌氧菌，这说明在做细菌需氧菌培养的同时应做厌氧菌培养[2]，否则将会造成大量病原菌漏检，它不仅关系到疾病诊断的正确性，且影响治疗效果或导致治疗不彻底。
厌氧菌检验(实验)
芽胞染色法（spore stain）
方法： 涂片→干燥→固定→5%孔雀绿加温染 3～ 5min →水洗→0.5%沙黄1min→水洗、晾 干、油镜检
结果： 菌体呈红色，芽胞呈绿色。
破伤风梭菌形态特点
破伤风梭菌菌落特点
产气荚膜梭菌形态特点
外环不完全溶血由α毒素引起
内环完全溶血由θ毒素引起
厌氧菌检验
王频佳 检验医学院
实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的
1．掌握产气荚膜梭菌和破伤风梭菌的形态特 点和培养特性。 2．熟悉厌氧菌的常用培养方法、一般鉴定原 则和鉴别要点。
第二次
1.观察细菌在庖肉基中的生长现象 2.观察厌氧菌的生长情况及菌落特点 3.革兰染色镜检：产气荚膜梭菌、破伤风梭
菌
4.芽胞染色：破伤风梭菌 5.汹涌发酵现象观察（示教）
厌氧性细菌及检验
厌氧性细菌及检验● 考点概念及分类分布与临床意义厌氧菌标本的采集与送检分离与鉴定常见厌氧性细菌【内容讲解】一、厌氧菌概述概念：一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。
分类：二、厌氧菌感染（一）厌氧菌在正常人体的分布及感染类型1.厌氧菌在正常人体的分布正常人的肠道、口腔、阴道等处均有大量的厌氧菌寄居。
厌氧菌与需氧菌和兼性厌氧菌共同组成人体的正常菌群，其中绝大多数为无芽胞厌氧菌。
其中肠道中的厌氧菌数量是大肠埃希菌的1000～10000倍。
表5-22-2 重要的厌氧菌种类及其在正常人体内的分布--------------------------------------------------------------------------厌氧菌皮肤上呼吸道口腔肠道尿道阴道--------------------------------------------------------------------------一、芽胞菌革兰阳性杆菌梭状芽胞杆菌属0 0 ±＋＋±±二、无芽胞菌（一）革兰阳性杆菌乳杆菌属0 0 ＋＋＋±＋＋双歧杆菌属0 0 ＋＋＋0 ±优杆菌属±±＋＋＋0 ±丙酸杆菌属＋＋＋＋＋＋？±放线菌属0 ±＋＋＋ 0 0（二）革兰阴性杆菌类杆菌属0 ＋＋＋＋＋梭杆菌属0 ＋＋＋＋＋±普雷沃菌属0 ＋＋＋＋＋＋＋紫单胞菌属0 ＋＋＋＋＋＋＋（三）革兰阳性球菌消化球菌属＋＋＋＋＋＋±＋＋消化链球菌属＋＋＋＋＋＋±＋＋（四）革兰阴性球菌韦荣菌属 0 ＋＋＋±＋--------------------------------------------------------------------------2.外源性感染梭状芽胞杆菌属引起的感染，其细菌及芽胞来源于土壤、粪便和其他外界环境。
厌氧菌检验 微生物学实验
实验六、厌氧菌检验一、厌氧培养1、刨肉基法方法：将破伤风梭菌、产气荚膜梭菌分别接种在庖肉培养基中，35℃48h，观察结果。
2、厌氧罐法方法：将破伤风梭菌接种在高渗芽孢培养基中并放置于厌氧罐中；将破伤风梭菌、产气荚膜梭菌分别接种在血平板中并置于厌氧罐中，放厌氧袋，密闭，置35℃48h观察结果。
二、观察厌氧菌培养结果：1、庖肉基1）破伤风梭菌：肉汤混浊，部分消化，微变黑，有少量气体，有腐败性恶臭味。
2）产气荚膜梭菌：产生气体，肉渣呈粉红色，不被消化。
2、血平板1）破伤风梭菌：呈薄膜状生长，菌落半透明、灰白色、边缘疏松呈羽毛状，伴β溶血。
2）产气荚膜梭菌：多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。
3、梭菌平板破伤风梭菌：形成直径1mm 以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状。
三、涂片、革兰染色镜检：破伤风梭菌产气荚膜梭菌G-，细长，芽胞圆形，比菌体大，G+，粗短大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列。
位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体四、芽孢染色：制片①5%孔雀绿加热3~5min，水洗甩干；②0.5%沙黄水溶液染色0.5~1.0min，水洗甩干干后镜检，如图所示：菌体呈红色，芽孢呈淡绿色。
破伤风梭菌产气荚膜梭菌五、汹涌发酵试验（试教）产气荚膜梭菌：分解乳糖产酸，使酪蛋白变性，同时产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，并将液面上的凡土林层向上推挤，甚至冲开管口棉塞，气势凶猛，为“汹涌发酵”。
六、讨论：1、做生化试验时，有些细菌为致病菌，故实验时要保护好自己，且实验废弃物要妥善处理，以免发生有害菌的感染。
2、所有接种的菌株暴露于有氧环境中不得超过20min3、厌氧菌检验：可据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。
最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查。
4、破伤风梭菌微生物检验：根据破伤风的典型临床表现即可作出诊断，故一般不作细菌学检查。
厌氧菌检验实验报告
一、实验目的1. 了解厌氧菌的生长特性及其检验方法。
2. 掌握厌氧菌分离纯化的基本操作。
3. 学会运用生化反应和显微镜观察等方法对厌氧菌进行鉴定。
二、实验原理厌氧菌是一类在无氧或低氧环境下生长繁殖的微生物。
在实验室条件下，通过厌氧技术模拟厌氧环境，可以使厌氧菌生长繁殖，从而进行分离、纯化和鉴定。
三、实验材料1. 厌氧菌培养箱2. 厌氧菌培养基：庖肉培养基、疱肉消化汤、疱肉琼脂平板等3. 实验器材：无菌接种环、无菌试管、无菌吸管、显微镜、酒精灯、培养皿等4. 实验试剂：5%氢氧化钠、95%乙醇、1%结晶紫溶液、革兰氏染色液等四、实验步骤1. 培养基制备a. 将庖肉培养基、疱肉消化汤和疱肉琼脂平板按照说明书进行制备。
b. 将制备好的培养基在厌氧条件下进行高压灭菌。
2. 样品接种a. 将待检样品接种于疱肉消化汤中，进行初步培养。
b. 将培养后的疱肉消化汤接种于庖肉琼脂平板上，进行分离纯化。
3. 厌氧培养a. 将接种好的庖肉琼脂平板放入厌氧培养箱中，在37℃条件下培养48小时。
b. 观察菌落生长情况，记录菌落特征。
4. 菌落形态观察a. 取少量菌落涂片，进行革兰氏染色。
b. 在显微镜下观察菌落形态、革兰氏染色结果，初步判断菌属。
5. 生化反应鉴定a. 对分离纯化的厌氧菌进行糖发酵试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验等生化反应。
b. 根据生化反应结果，进一步鉴定菌属。
6. 显微镜观察a. 对分离纯化的厌氧菌进行涂片、染色和显微镜观察。
b. 观察菌体形态、排列方式等特征，辅助鉴定菌属。
五、实验结果1. 厌氧菌在庖肉琼脂平板上生长良好，形成灰白色、湿润、边缘不整齐的菌落。
2. 革兰氏染色结果显示，部分菌落为革兰氏阳性，部分菌落为革兰氏阴性。
3. 生化反应结果显示，部分菌落发酵葡萄糖，部分菌落不发酵葡萄糖；氧化酶试验和过氧化氢酶试验结果均为阳性。
4. 显微镜观察结果显示，部分菌落为革兰氏阳性球菌，部分菌落为革兰氏阴性杆菌。
厌氧菌检验的基本流程和注意事项
厌氧菌检验的基本流程和注意事项下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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厌氧菌的采集、送检、培养、分离鉴定及注意事项
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。
常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育（较为推荐）。
3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。
它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
焦性末食子酸与碱反应后耗氧。
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二、厌氧菌感染
（一）厌氧菌在正常人体的分布
厌氧菌与需氧菌一起组成了人体的 正常菌群。人体许多部位厌氧菌在种类 和数量上远多于需氧菌，如在结肠中 99%的细菌都是厌氧菌。 临床厌氧菌感染中，由正常菌群的 无芽胞厌氧菌的感染最为多见。
常见厌氧菌在正常人体的分布
主要菌属
芽胞厌氧菌 梭菌属 无芽胞厌氧菌 革兰阳性杆菌 丙酸杆菌属 双歧杆菌属 乳杆菌属 优杆菌属 放线菌属 革兰阴性杆菌 类杆菌属 普雷沃菌属 紫单胞菌属 梭杆菌属 革兰阳性球菌 消化球菌属 消化链球菌属 革兰阴性球菌 韦荣菌属 0 ＋ ＋ ＋ ＋－ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋－ ＋－ ＋＋ ＋＋ 0 0 0 0 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋－ ＋ ＋ ＋ ＋＋ 0 0 ＋＋ 0 ＋ 0 0 ＋－ ＋－ ＋＝ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋－ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋－ 0 ＋－ 0 0 ＋－ ＋－ ＋＋ ＋－ 0 0 0 ＋＋ ＋－ ＋－
5. 厌氧袋运送法
6. 棉拭运送法 （略） 应在20~30min内处理完毕，最迟 不超过2h，防止标本中兼性厌氧菌过 度生长，抑制厌氧菌的生长。如不能 及时接种，应将标本保存于室温（因 冷藏对厌氧菌有害气味 直接涂片 染色镜检
分离培养
（接种非选择性及选择性培养基）
（二）厌氧菌感染的原因 1. 局部组织的氧化还原电势降低 如血 管损伤、烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织 坏死等，可造成局部组织的缺血、缺氧，使 Eｈ降低；此外，大面积外伤伴有需氧菌感 染消耗了氧，为厌氧菌感染提供了条件。 2 . 机体免疫功能下降 如接受免疫抑制 剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、 肾疾病病人及老人、婴幼儿、早产儿等，因 免疫力下降易併发厌氧菌感染。
厌氧菌的初步鉴定
菌 名
脆弱类杆菌
具核酸杆菌 坏死梭杆菌 韦荣球菌 消化链球菌 乳酸杆菌 痤疮丙酸杆菌
革兰染色
G－
G－ G－ G－ G＋ G＋ G＋
形态及其他特征
两端钝圆着色深，中间色浅不均匀，有空泡，长短不一，标本有琥珀味 球杆菌，可见多形性，长短不一，紫外线照射发红色荧光，标本有恶臭 菌体细长，两头尖，紫色颗粒沿菌体长轴成双排列，标本有丁酸味 菌体细长，高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形 极小的革兰阴性球菌 球形或卵圆形，呈链状的小球菌，易染成阴性 细长无芽胞，有时多形性，标本有乳酸气味 排列呈X、Y、V或栅状，标本有丙酸气味
厌氧性细菌及检验
第一节
概
述
厌氧性细菌(anaerobic bacteria)指一群必须在无氧条 件下才能生长繁殖的细菌。
一、厌氧菌的分类
分为两类：一类为有芽胞厌氧菌，只有一个属， 即梭菌属，共有130个种。以芽胞形式存于体外。 另一类为无芽胞厌氧菌， 包括40多个属，300 多个 菌种和亚种；多为体内正常菌 群，存在于皮肤、口 腔、上呼吸道、肠道和 泌 尿生殖道。易引起这些部 位的内源性感染，而不易诊断。
增菌培养
（接种液体培养基）
厌 氧培 养 2~7d 确定厌氧菌
每个平板挑5个以上菌落 每个菌落接种两个平板 经48ｈ培养
需氧培养
生 长 兼性厌氧菌 无生长 专性厌氧菌
厌氧培养
生 长
菌种保存 形态与染色
菌落
分类鉴定 生化反应
药物敏感试验 药敏性鉴定 气液相色谱
三、检验方法
（一）肉眼观察 应观察标本的性状， 如是否为脓性、带血，有无黑色坏死组织 或黑色分泌物，有无硫磺样颗粒或恶臭气 味等。这些有助于厌氧菌的鉴定和培养基 的选择。 （二）直接镜检 在接种前除血液外， 各种临床标本均需直接涂片染色、镜检， 以了解标本中细菌的数量、形态及染色性， 便于选择合适的培养基和培养方法，还可 验证培养结果的成功与失败。
皮肤
上呼吸道
口腔
肠道
尿道
阴道
3. 机体局部屏障破坏，使厌氧菌进入 周围组织和血液引起感染。
（三）厌氧菌感染的临床及细菌学指征 1 .局部有气体产生 为重要指征之一
2 .发生在粘膜附近的感染
3 .深部外伤
4 .有特殊的分泌物 如有恶臭，暗 红血色或在紫外光下发出红色荧光。如分 泌物或脓汁中有硫磺颗粒即为放线菌感染。
采集方法：采取深部的组织标本： 需经碘酒消毒皮肤后，用注射器插入病 变部位深部，抽取数毫升后，弃去一滴 于酒精棉球上。
不同部位标本采集法
标本来源 封闭性脓肿 妇女生殖道
下呼吸道分泌物
收集方法 针管抽取 后窟窿穿刺抽取
肺穿刺术
胸腔穿刺术
用静脉注射的塑料导管穿 入感染部位抽取
胸 腔
窦道 子宫腔 深部创伤
组 织 尿 道
无菌外科切开 膀胱穿刺
（二）标本的运送与处理
注意尽快送检，避免干燥，避免接触空气。
适宜液体标本。标本抽取 后排尽空气，并将针头插入无菌橡皮塞中即可送检。
1. 针筒运送法
2. 无氧小瓶运送法 常用于少量脓液标本的
运送。用无菌青霉素小瓶，瓶内装入0.5ｍｌ的心脑 浸液(含有0.0003%的刃天青---氧化还原指示剂）,加 橡皮塞后,铝盖密封，真空泵抽出瓶中空气，充入N2， 连续充抽3次，最后充以 CO2，高压灭菌备用。
5 . 某些抗生素治疗无效的感染 6 . 细菌形态培养有特征性变化 如革 兰染色着色不均、形态奇特、呈明显多形 性；或镜检查见细菌而需氧培养为阴性者。
第二节 厌氧菌的微生物学检验
一、标本的采集与运送 （一）标本采集 标本种类：血液、关节液、心包液、腹腔液、 膀胱穿刺液等体液；深部脓肿渗出液、肺部渗出 液、其他组织穿刺液。厌氧菌培养最好的标本是 组织标本，厌氧菌在其中更易生长。 采集注意事项：避免正常菌群污染，尽量避 免接触空气。有些标本如鼻咽拭子、痰液、流出 的脓液、阴道分泌物、粪便等因含大量的正常菌 群，故不宜作厌氧菌培养。
如有氧渗入小瓶，培养基则显粉红色， 应弃去。运送时挑选无色小瓶，将标本用无 菌注射器注入瓶中即可。 3. 标本充盈法送检 适宜于大量液体标 本运送。将液体标本装满标本瓶，加盖密封， 可驱除瓶中空气。
4. 组织块运送法 将组织块放在密封的 厌氧罐中运送。罐内放入经酸化硫酸铜浸泡 过的钢丝绒，其表面即有金属铜，具强还原 性，能迅速吸氧，造成厌氧罐中无氧状态。