人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用

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抗酒石酸酸性磷酸酶

抗酒石酸酸性磷酸酶

30-40岁2型糖尿病患者血清TRACP-5b及BALP临床分析目的:分析30-40岁糖尿病患者血清骨形成指标TRACP-5b及BALP 骨吸收指标水平与骨重建失衡的机理,为糖尿病骨质疏松的早期诊断提供可能的依据。

方法:选择30-40岁2型糖尿病患者23例及对照组病例21例,分别对其血清TRACP-5b及BALP进行测量,并做统计分析。

结果:T2DM患者组血清TRACP-5b水平高于对照组(P<0.05)具有统计学差异,T2DM患者组血清BALP水平低于对照组(P<0.05)具有统计学差异。

结论:1. 2型糖尿病患者较健康对照组患者血清骨吸收指标TRACP-5b水平升高,骨形成指标BALP 水平降低,成骨作用小于破骨作用,骨质疏松的风险有增加的可能性。

(2型糖尿病患者骨质疏松风险的增加可能与BALP及TRACP-5b 存在一定的关系)。

2.骨形成标记物BALP及骨吸收标记TRACP-5b可能是2型糖尿病骨质疏松早期预测的敏感指标。

引言:2型糖尿病是一种严重威胁人类健康的慢性疾病,在造成起心、脑、肾损伤的同时,还极易引起骨重建负平衡,导致骨质疏松。

有研究明,TRACP-5b是骨吸收的特异性标志物,可反映破骨细胞的活性及骨吸收的状态;BALP是骨形成的特异性标志物,可反映成骨细胞的活性及骨形成的状态。

本课题通过对40岁以下T2DM患者观察组和健康人对照组的血清TRCAP-5b及BALP水平测量,分析骨重建失衡的机理,为糖尿病骨质疏松的早期诊断提供可能的理论依据。

1.对象和方法1.1研究对象观察组:选取23例为我院2015年3月~2015年6月住院病人,按WHO标准确诊为T2DM 患者,其中男10例,女13例,年龄30-40岁,平均年龄(65. 5 ±1 0. 7)岁, 体质量指数[ BMI=体重( kg) /身高2( m2)] 平均为24. 4 ±3. 1, 病程6月~21 年, 均为口服降糖药及通过饮食控制血糖健康对照组:同期我院健康体检者21例,其中男10例,女11例,年龄30-40岁,平均年龄xx岁,体重指数xx.且经口服葡萄糖耐量试验排除糖尿病。

抗洒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)定量测定

抗洒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)定量测定

抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)定量测定一、简介和用途、适用范围大量的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)是由骨吸收的破骨细胞和有活力的巨噬细胞所释放的。

在血液循环中的TRACP有TRACP 5b 和TRACP 5a二种形式, TRACP 5b 来源于破骨细胞,而TRACP 5a来源于巨噬细胞。

由破骨细胞刚分泌到血液中的TRACP 5b是有活性的酶,但当TRACP 5b在血液循环中被清除之前已无活性,并被降解为碎片。

这样TRACP 5b不会因肝、肾功能受损而在血液中积蓄。

血清中TRACP 5b均来源于破骨细胞,此酶在昼夜的活性水平变化不明显,且不受进食的影响,故可在一天的任何时候都可以采集标本进行检验。

此试剂盒依据测定由破骨细胞释放的TRACP 5b的特异性测定方法。

它可以用于测定骨吸收亢进的病人,如原发性骨质疏松和肾性骨病,也可以预测骨折的危险性,并便于了解抗骨吸收治疗的效果。

在肿瘤病人中,当TRACP 5b 的活力增高提示肿瘤骨转移。

在体外,培养基中TRACP 5b的活力大小代表了破骨细胞数量的多少,因此应用于此试剂盒在进行人的破骨细胞培养时,可用于检测破骨细胞的数量。

二、试验原理测试孔内已包被抗TRACP单克隆抗体→加入校准液、质控品和样品→加入释放剂→有活性的TRACP 5b从结合蛋白质上离解→TRACP 5b与孔内包被的抗TRACP单克隆抗体结合→加入底物pNPP孵育→加入终止液终止反应→在酶标仪上检测结果。

此试验的优点1、所测定的TRACP 5b是由破骨细胞专一释放的。

2、此试验对TRACP 5a或其它磷酸酶没有干扰。

3、溶血不影响结果。

4、不受昼夜变化的影响。

5、不受肝脏、肾脏疾病的影响。

6、不受进食的影响。

7、酶标板容易拆卸,方便检测。

三、试剂盒(一)组成1、酶标板:96孔,已包被抗—TRACP抗体。

2、质控液:3×0.5ml。

3、校准液:3×0.5ml(3×1U/L,3×5U/L,3×10U/L)。

类风湿关节炎患者肌骨超声半定量分级与疾病活动度及骨代谢平衡的关系

类风湿关节炎患者肌骨超声半定量分级与疾病活动度及骨代谢平衡的关系

类风湿关节炎患者肌骨超声半定量分级与疾病活动度及骨代谢平衡的关系陈美西;刘秉彦;林坚平;杨炳昂;刘安;廖卫【摘要】目的探讨类风湿关节炎(RA)患者肌骨超声半定量分级与疾病活动度及骨代谢的关系.方法选取RA患者73例,根据28处关节疾病活动度评分进行分组,其中缓解期组11例、低活动期组23例、中活动期组26例、高活动期组14例.采用彩色多普勒超声诊断仪分别对患者7个手足关节的滑膜增生、血流信号、骨侵蚀和关节积液进行半定量评分;检测骨吸收血清标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)、Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ),骨形成血清标志物骨保护素(OPG)、骨碱性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型前胶原羧基端前肽(PⅠCP)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PⅠNP);采用简单直线相关分析法分析肌骨超声半定量评分与骨吸收、骨形成血清标志物的相关性.结果缓解期组、低活动期组、中活动期组和高活动期组的滑膜增生、血流信号、骨侵蚀、关节积液评分及总分均呈逐渐上升趋势,血清TRACP5b、CTX-Ⅰ水平呈逐渐上升趋势,血清OPG、BALP、PⅠCP和PⅠNP水平呈逐渐下降趋势,组间比较P均<0.05.肌骨超声定量评分与血清TRACP5b、CTX-Ⅰ水平呈正相关性(R2分别为0.706 1、0.623 0,P均<0.05),与血清OPG、BALP、PⅠCP 和PⅠNP水平呈负相关性(R2分别为0.754 7、0.794 1、0.827 4、0.664 4,P均<0.05).结论 RA患者肌骨超声半定量分级与疾病活动度密切相关,并能反映骨代谢状态.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2017(057)032【总页数】3页(P62-64)【关键词】类风湿关节炎;肌骨超声;骨吸收;骨重建;骨代谢【作者】陈美西;刘秉彦;林坚平;杨炳昂;刘安;廖卫【作者单位】海南省人民医院,海口 570311;海南省人民医院,海口 570311;海南省人民医院,海口 570311;海南省人民医院,海口 570311;海南省人民医院,海口570311;海南省人民医院,海口 570311【正文语种】中文【中图分类】R684.3类风湿关节炎(RA)是一种以慢性、对称性、多滑膜关节炎为主要临床表现的全身性炎性疾病,属于自身免疫性疾病,其发病机制尚未完全明确。

中医不同治法对骨质疏松症大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶含量影响的比较研究

中医不同治法对骨质疏松症大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶含量影响的比较研究

中医不同治法对骨质疏松症大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶含量影响的比较研究杨芳;朱辉;郑洪新;王剑;林庶茹【摘要】目的观察中医不同治法对糖皮质激素诱导骨质疏松症大鼠骨抗酒石酸酸性磷酸酶含量的影响,探讨中医防治骨质疏松症的作用机制.方法将120只雌雄各半的大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、补肾中药组、健脾中药组、活血化瘀中药组和骨疏康中药组6个组,用地塞米松肌注造模.实验结束后,腹主动脉取血处死大鼠,用酶联免疫法检测各组大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶的含量.结果与正常组比较,模型组大鼠血清TRACP含量升高极为显著(P<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠血清TRACP含量均明显降低,其中以补肾组和骨疏康组降低最为明显,与其他各组比较具有极显著差异(P<0.01).结论补肾方法通过降低抗酒石酸酸性磷酸酶含量对骨质疏松症具有一定的防治作用.【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》【年(卷),期】2016(022)004【总页数】3页(P393-395)【关键词】骨质疏松症;抗酒石酸酸性磷酸酶;补肾方法;中医【作者】杨芳;朱辉;郑洪新;王剑;林庶茹【作者单位】辽宁中医药大学,沈阳110847;辽宁中医药大学,沈阳110847;辽宁中医药大学,沈阳110847;辽宁中医药大学,沈阳110847;辽宁中医药大学,沈阳110847【正文语种】中文【中图分类】R-332骨质疏松(osteoporosis,OP)是以骨量减少、骨微观结构退化为特征,致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。

糖皮质激素(glucocorticoid,GC)是引起骨质疏松症的最常见的药物,长期接受GC治疗者都有发生骨质疏松的危险,而这种由GC治疗所导致的骨质疏松症即成为糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid induced osteoporosis,GIO)。

本实验研究以中医学整体观念为指导思想,采用分子生物学的技术,观察补肾、健脾、活血化瘀方法对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRACP)含量的影响。

酶联免疫分析试剂盒说明书

酶联免疫分析试剂盒说明书

人chemerin酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中chemerin含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中chemerin水平。

用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入chemerin抗原、生物素化的抗人chemerin抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的chemerin呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1.酶联板:一块(96孔)2.标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为20,000pg/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释10,000pg/ml,5,000pg/ml,2,500pg/ml,1,250pg/ml,625pg/ml,312.5pg/ml,156pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0pg/ml,临用前15分钟内配制。

如配制10,000pg/ml标准品:取0.5ml20,000pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

3.样品稀释液:1×20ml/瓶。

4.检测稀释液A:1×10ml/瓶。

5.检测稀释液B:1×10ml/瓶。

6.检测溶液A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

7.检测溶液B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。

C肽(C-P)测定试剂盒(酶联免疫法)产品技术要求beifang

C肽(C-P)测定试剂盒(酶联免疫法)产品技术要求beifang

C肽(C-P)测定试剂盒(酶联免疫法)适用范围:用于体外定量测定人血清中C肽(C-P)的含量。

1.1产品型号/规格试剂盒包装规格为48人份/盒、96人份/盒,具体组成见表1:表1 试剂盒主要组成成分2.1外观和物理检查液体组分应澄清,无沉淀或絮状物;所有组分应无包装破损。

各组分装量应不少于表1中要求。

2.2准确性试剂盒校准品与相应浓度的国家标准品同时进行分析测定,用双对数(Log-Log)数学模型拟合,要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行(t检验);以C-P国家标准品为对照品,试剂盒校准品的实测浓度与标定浓度的比应在0.90~1.10之间。

2.3线性用Log-log数学模型拟合,在0.5 ng/ml~8.0 ng/ml范围内,剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900。

2.4精密度2.4.1批内精密度(CV%)应不高于15.0%。

2.4.2批间精密度(CV%)应不高于15.0%。

2.4.3 冻干组分批内瓶间差异应不高于15.0%。

2.4.4 冻干组分批间差异应不高于15.0%。

2.5最低检出限试剂盒最低检出限应不大于0.25 ng/ml。

2.6质控血清测定值每次检测结果均应在允许范围之内。

2.7特异性与胰岛素原(pro-Insulin),胰岛素(INS)没有显著交叉反应。

配制高浓度pro-insulin,INS溶液,测量结果应符合下表。

表2 与其它激素的交叉反应数据2.8稳定性2.8.1 37℃放置7天,测定结果应符合上述2.1~2.7项要求。

2.8.2 2~8℃放置12个月后,测定结果应符合上述2.1~2.7项要求。

2.8.3 冻干品于复溶后2~8℃保存一个月或-20℃保存至失效期,冻融不超过两次,必要时分装冻存。

血清Tracp5b、CEA、CA15—3检测对乳腺癌骨转移的临床意义

血清Tracp5b、CEA、CA15—3检测对乳腺癌骨转移的临床意义
7 ae fb e s c n e ainswi otp rtv e u T a p 8 c sso rat a c rp te t t p so eaie sr m rc 5b,CEA,CA1 —3 lvl n ldigb n 9 c ss o h 5 e e ,icu n o e 3 a e ,n
go p P>0 0 .B n ru A1 ru ( . 5) o ego p C 5—3 lvlo rm df rn s nf a t i e a h t n te c nrl ru e l e e f eu iee t i ic nl hg r h n ta i h o t o p h at s f gi y h t og h
【 bt c】 O j t e Ep r Tapbs u C AadC 1 — vln r scne bn e ss t A s at r be i xle rc5 lm, E A 5 3l ead e tacroe t tio h cv o e n e b a m a as f e
转移 3 例 , 9 无骨转移 3 例 ( 9 含骨外转移 9例 ) 以及健 康女性 对照组 3 0例。结果
骨转移组 血清 T A P b R C 5 水平 为
(. 5 -. 7 , 6 2 2 3 ) 显著高于健 康对 照组 ( .9± . 5 、 4 32 1 1 ) 无骨转移组 ( . 9± .2 以及 骨外转移组 (. 8± .0 ( 3 9 10 ) 4 0 1 1 ) P< 0 0 ) 无骨转移组和骨外转移组 ( 0 0 ) 骨转移组血清 C 1 3水平为 (4 . ±13 5 , .5 , P> . 5 ; A 5— 18 3 7 . ) 显著 高于健康对照组
3、 E C A在乳腺 癌骨转移 时具有较高 的相关性 , 但不具备特异性 。

骨质疏松症

骨质疏松症

神经内科哪些病人需要做骨密度检查?
偏瘫患者 截瘫患者 肌营养不良患者 僵人综合症患者 肌强直综合症患者 长期使用抗癫痫药物患者
风湿科哪些病人需要做骨密度检查?
类风湿性关节炎 系统性红斑狼疮 强直性脊柱炎 皮肌炎 干燥综合症 混合性结缔组织病
呼吸内科哪些病人需要做骨密度检查?
• 骨密度的检测可以用于决定是否患者开始接受治疗, 因为显著骨丢失是治疗指征
• 骨密度的随访必须预计骨密度变化超过最小有意义 变化值(LSC)的时候进行
• 随访和监测只能在同一台机器和同一个技术员上进 行,即是同一厂家机器,横向间比较没有意义。
ISCD关于骨密度测量的主要规范
• 每个骨密度测量室必须有自己的精确度误差,并计 算LSC,不能单凭厂家提供的精确度误差。
险性=2.3)
髋部BMD测量对于髋部骨折风险的预测价值最高(相
对风险性=2.6)
前臂BMD测量对于前臂骨折风险的预测价值最高(相
对风险性=2.1)
为什么要同时测量腰椎、髋部、前臂三个部位?
便于增加药物疗效监测的灵活性
如果仅选择一个部位,当治疗持续一段时间后,可能由 于患者该部位出现骨性关节炎或骨折而不能继续监测
/FRAX/
FRAX评估治疗阀值
美国FRAX评估治疗阀值 10年内发生主要骨质疏松性骨折的概率≥20% 10年内发生髋部骨折的概率≥3%
我国尚未建立治疗阀值,可参照执行,但建 议每个地区建立自己的FRAX评估治疗阀值。
FRAX工具适合应用的人群
对于T值≤-2.5的人群,应用FRAX工具只能评估其 骨折风险,对于指导治疗价值不大,因为中华医学 会临床诊疗指南指出T值≤-2.5必须给予药物治疗。
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人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的:本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)的含量。

实验原理:本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)水平。

用纯化的TRACP5b抗原包被微孔板,制成固相抗原,往包被抗原的微孔中依次加入抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b),再与HRP标记的酒石酸酸性磷酸酶5b抗原结合,形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)浓度。

样本处理及要求:1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。

仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。

仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

3. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。

仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。

离心20分钟左右(2000-3000转/分)。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右(2000-3000转/分)。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

5. 组织标本:切割标本后,称取重量。

加入一定量的PBS,PH7.4。

用液氮迅速冷冻保存备用。

标本融化后仍然保持2-8℃的温度。

加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。

离心20分钟左右(2000-3000转/分)。

仔细收集上清。

分装后一份待检测,其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

操作步骤1.标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。

(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为2400pg/ L,1600pg/ L ,800pg/ L,400pg/ L,200pg/ L)。

2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。

在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。

加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。

5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

7.温育:操作同3。

8.洗涤:操作同5。

9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意事项:1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。

一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

4.请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。

如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。

5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

6.底物请避光保存。

7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9.本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。

计算:在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

(此图仅供参考)试剂盒性能:1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。

2.批内与批见应分别小于9%和15%检测范围:100pg/ L-3000pg/ L保存条件及有效期:1.试剂盒保存:;2-8℃。

2.有效期:6个月Human tartrate-resistant acid phosphatase 5bDrug NamesGeneric Name:Human tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP5b) ELISA Kit. PurposeThis kit allows for the determination of TRACP5b concentrations in Human serum, blood plasma, and other biological fluids.Principle of the assayT he kit assay Human TRACP5b level in the sample,use Purified Human TRACP5b antigen to coat microtiter plate wells, make solid-phase antigen, then add TRACP5b to wells, Combined TRACP5b antigen which With HRP labeled,become antigen - antibody - enzyme- antigen complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of TRACP5b in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.Materials provided with the kitSpecimen requirements1.serum- coagulation at room temperature 10-20 mins,centrifugation 20-min at the speed of2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.2.plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.3.Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.4.cell culture supernatant-detect secretory components, collect sue a sterile container,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the composition of cells, Dilut cell suspension with PBS(PH7.2-7.4), Cell concentration reached 1 million / ml, repeated freeze-thaw cycles, damage cells and release of intracellular components, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.5.Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add PBS(PH7.2-7.4), Rapidlyfrozen with liquid nitrogen, maintain samples at 2-8℃ after melting,add PBS(PH7.4),Homogenized by hand or Grinders, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.remove supernatant.6.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevantliterature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t, specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.7.Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active. Assay procedure1.Dilute and add sample to Standard: set 10 Standard wells on the ELISA plates coated, add Standard 100μl to the first and the second well, then add Standard dilution 50μl to the first and the second well, mix; take out 100μl form the first and the second well then add it to the third and the forth well separately. then add Standard dilution 50μl to the third and the forth well ,mix ; then ta ke out 50μl from the third and the forth well discard, add 50μl to the fifth and the sixth well ,then add Standard dilution 50μl to the fifth and the sixth well, mix ; take out 50μl from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well, then add Standard dilution 50μl to the seventh and the eighth well ,mix ; take out 50μl from the seventh and the eighth well and add to the ninth and the tenth well, add Standard dilution 50μl to the ninth and the tenth well, mix , take out 50μl fro m the ninth and the tenth well discard(add Sample 50μl to each well after Diluting ,(density: 2400pg/ L,1600pg/ L ,800pg/ L,400pg/ L,200pg/ L)2.add sample:Set blank wells separately (blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sample dilution 40μl to testing sample well, then add testing sample 10μl (sample final dilution is 5-fold), add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.4.Configurate liquid: 30-fold (or 20-fold)wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled water and reserve.5.washing:Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.6.add enzyme:Add HRP-Conjugate reagent 50μl to each well, except blank well.7.incubate:Operation with 3.8.washing:Operation with 5.9.color:Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the light preservation for 15 min at 37℃10.Stop the reaction:Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction(the blue color change to yellow color).11.assay:take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and within 15min.Important notes1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes inthe room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should be stored in Sealed bag.2.washing buffer will Crystallization separation, it can be heated the water helps dissolvewhen dilute . Washing does not affect the result.3.add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids theexperimental error. add sample within 5 mins, if the number of sample is much , recommend to use Volley .4.if the testing material content is excessively higher (The sample OD is bigger than the firststandard well ),please dilute Sample (n-fold), Please diluente and multiplied by the dilution factor.(×n×5).5.Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.6.The substrate evade the light preservation.7.Please according to use instruction strictly, The test result determination must take themicrotiter plate reader as a standard.8.All samples, washing buffer and each kind of reject should according to infective materialprocess.9.Do not mix reagents with those from other lots.CalculateAssay range100pg/ L-3000pg/ LStorage and validity1.Storage : 2-8℃. 2.validity : six months.Take the standard density as the horizontal, the OD value for the vertical ,draw the standard curve on graph paper, Find out the corresponding density according to the sample OD value by the Sample curve, multiplied by the dilution multiple, or calculate the straight line regression equation of the standard curve with the standard density and the OD value ,with the sample OD value in the equation, calculate the sample density, multiplied by the dilution factor, the result is the sample actual density.This chart for reference only。

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