脊髓性肌萎缩症基因诊断
SMN基因诊断小儿脊髓性肌萎缩症
ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｆ ｎｏ—ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｏｌｉｇｏｄｏｎｔｉａ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍ ，ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ｂｙ ｐａｎｏｒａｍｉｃ ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈ ｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈａｄ ａｌｌ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ．Ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ｈａｄ ｆａｍｉｌｙ ｈｉｓｔｏｒｙ，ｗｈｉｌｅ ｏｔｈｅｒｓ ｄｉｄｎ ｔ ｈａｖｅ．Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ，ｓｏｍｅ ａｇｅｎｅｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ａｂｎｏｒｍｉｔｙ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｔｅｅｔｈ．Ｔｈ ｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ａｓ ａｎ ａｕｔｏｓｏｍｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｉｎｌｙ ａｎｄ ａ ａｎｃｅｓｔｒｙ ｗｉｔｈ ａｎ— ｔｏｓｏｍｅ—ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｔｅｅｔｈ ａｇｅｎｅｓｉｓ ｍａｉｌｙ ｉｓ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔ ｈ ｅ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｔ ａｐｐｅａｒａｎｃｅｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ｔｈｅ ｄｅｌｅｔｅｄ ｔｏｏｔｈ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｃｒｏｗｎ ｓｈａｐｅ． Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｔｅｅｔｈ ａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｒａ ｌ ｈｅａＪｔｈ ａｎｄ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ． Ｍ ｅＳＨ ｔｏｏｔｈ ｌｏｓｓ／ｌｏｎｇｅｎｉｔａｌ；ｔｏ ｔｈ ｌｏｓｓ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｐｅｄｉｇｒｅｅ
脊肌萎缩症SMA的临床、发病机制、诊断及治疗
▪ 出生时身高体重均正常，随后生长发育较正常儿缓慢。 ▪ 肌张力低下，肌无力以四肢近端肌群受累为主，躯干肌亦无力。患儿吸吮及吞咽力弱，
哭声低微，呼吸浅，可出现胸廓反常活动。翻身及抬头困难。腱反射消失。触诊可发 ▪ 出现生四后肢第肌一萎年缩的，生但长常曲被线皮低下于脂正肪常掩，盖身。材10矮%小病。例可有关节畸形或挛缩。
▪ 约95%的患者在出生后18个月内死于呼吸衰竭。
分类 根据起病年龄和病变程度可大致分为4型：
SSMMAA--ⅠⅠ型型
SMA-Ⅱ型
SMA-Ⅲ型
SMA-Ⅳ型 其他类型SMA
▪ 发病较SMA-Ⅰ型稍迟，通常于1岁内起病，极少于1～2岁起病。发病率与SMA-Ⅰ型 ▪ 约相1似/3。病例在宫内发病，其母亲可注意到胎动变弱。
，此几乎均见于男性患者。半数患者早期可见肌束颤动。弓形足亦可见到。腱反射减 弱或消失。 ▪ 出生后第一年的生长曲线低于正常，身材矮小。
▪ 本型预后良好，尤其是女性患者。生存期通常能达到成年，许多患者能有正常寿命。 表现较严重病例往往为男性患者。
分类 根据起病年龄和病变程度可大致分为4型：
SSMMAA--ⅠⅠ型型
SMN基因在一条染色体上具有两个拷贝，二者间有5个碱基的差别，在端粒侧称SMNt （SMN1），着丝粒侧称SMNc（SMN2）。
SMN1： 选择性剪接生成90%的全长转录产物，另外10%缺少5号外
显子. SMN1基因是运动神经元生存的关键基因。
SMN2：全长转录产物仅占20%-30%。 外显子7中840C（SMN1）→T（SMN2）的差异，使SMN2 mRNA中外
SMA-Ⅱ型
SMA-Ⅲ型
SMA-Ⅳ型 其他类型SMA
▪ 统称成年型SMA。发病年龄为15～60岁，多见于35岁左右。 ▪ 约1/3病例在宫内发病，其母亲可注意到胎动变弱。 ▪ 起病和进展均较隐袭，但亦有呈进行性加重或相对静止的病例报道。发病率小于 ▪ 出0.生5/时10身万高。体重均正常，随后生长发育较正常儿缓慢。
脊肌萎缩症家系SMN1基因异常产前诊断一例
脊肌萎缩症家系SMN1基因异常产前诊断一例发布时间：2022-06-05T12:09:28.889Z 来源：《医师在线》2022年1月1期作者：麻玲玲付小雁李玮徐秀华何桂元[导读]麻玲玲付小雁李玮徐秀华何桂元通讯作者（大连市妇女儿童医疗中心（集团）体育新城院区产前诊断中心；辽宁大连116037）摘要：脊肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy或SMA)，又称为脊髓性肌萎缩症，是一种遗传性神经肌肉疾病，其病因是位于染色体5号的SMN1基因出现致病变异而导致运动神经元生存蛋白1的数量和/或功能缺失。
在这些患者中，脑干和脊髓的下运动神经细胞出现进行性和不可逆的退化，病情随着年龄而越发严重。
该疾病的主要临床表型为左右对称的肌肉无力和萎缩，而且会首先影响近端肌肉群（例如颈、肩、上臂和大腿），进而影响远程肌肉群（例如下臂、手指，小腿和脚指）[1]。
其他的并发症包括体重增加缓慢、生长迟缓、限制性肺病、脊柱侧弯、关节挛缩和睡眠困难。
脊肌萎缩症在亚洲的发病率估计为1:8000[2]。
而在中国人群中，大约百分之二是有相关致病变异的携带者[3]。
关键词：脊肌萎缩症；基因；诊断1 病例介绍咨询者，王某，女性，32岁，2021年4月以“停经12周余，次女脊肌萎缩症，要求遗传咨询”为主诉就诊。
末次月经：2021年1月18日，预产期：2021年10月25日，自然受孕，NT：0.9mm。
既往体健。
孕产史：孕3产2，2010年山东省日照市足月分娩长女，体重3100g，现健，2015年山东省日照市足月分娩次女，体重3100g，即先证者蓉蓉（化名）。
蓉蓉出生时未见异常，1岁左右发现其四肢无力、坐立翻身困难，当时诊断疑似脊肌萎缩症患者，16月龄进行脊肌萎缩症基因检测，提示蓉蓉携带SMN1基因7-8号外显子的纯合缺失突变（2个SMN1的等位基因都出现了缺失突变）。
王某夫妇行SMN1基因检测，分别携带SMN1基因7-8号外显子的杂合缺失突变（只有1个SMN1的等位基因都出现了缺失突变）。
【专题】脊髓型肌萎缩（SMA）检测方法-MLPA
【专题】脊髓型肌萎缩（SMA）检测⽅法-MLPA前⾯两期介绍了SMA疾病和基因，这⼀期我们来谈谈SMA的检测⽅法-MLPA。
MLPA原理多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)于2002年由Schouten等⾸先报道，是近⼏年发展起来的⼀种针对待检DNA序列进⾏定性和半定量分析的新技术。
该技术⾼效、特异，在⼀次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，⽬前已经应⽤于多个领域、多种疾病的研究。
MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进⾏杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过⽑细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进⾏分析最后得出结论。
每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸⽚段，⼀个由化学合成，⼀个由M13噬菌体衍⽣法制备;每个探针都包括⼀段引物序列和⼀段特异性序列。
在MLPA反应中，两个寡核苷酸⽚段都与靶序列进⾏杂交，之后使⽤连接酶连接两部分探针。
连接反应⾼度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成⼀条完整的核酸单链;反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有⼀个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应⽆法进⾏。
连接反应完成后，⽤⼀对通⽤引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯⼀的，范围在130~480bp。
最后，通过⽑细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。
只有当连接反应完成，才能进⾏随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发⽣点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
检测SMA最常⽤的MLPA试剂盒共有两款，P060和P021。
MLPA-P060P060含有21个MLPA探针，其扩增产物在154和342nt之间，包括17个参考探针和4个检测探针，分别⽤于SMN1和SMN2的检测。
MLPA和PCR-RFLP技术用于脊髓性肌萎缩症的基因诊断
６ 王江 ， 丽琳 ， 沈 侯庆 昌 ， 复方 凝胶剂 的急毒和阴道刺激 性试验． 等． 中国药房 ， Ｏ ， （ ２ ： ９ —１９ ． ２ ７ １ ２ ） １ ３ ６４ ０ ８ ６ ［ 责任编辑 ： 琳 ］ 董
ＭＰ Ｌ Ａ和 Ｐ Ｒ— Ｆ Ｐ技术 用 于脊髓 性肌萎缩症 的基 因诊 断 Ｃ ＲＬ
讨
论
凝胶剂具有使药物与阴道粘膜有 良好 的生物相
容性 ， 同时还 具有 黏 附 时 间 长 、 着 力强 、 易 流 失 、 粘 不 保持 有效 时 间长等 特点 ， 合使 用天 然材 料 和合成 材 联
兔 阴道 刺激 性 在 可接 受 范 围 内， 物安 全 性 比较 生 好【， ６ 预计经过进一步深人的试 验工作 ， Ｊ 该凝胶剂有
安徽省计划生 育科学技 术研究所
变 的效果 。方法 ： 应用 ＴＡ Ｇ Ｎ西血 液基 因组 Ｄ Ａ提 ＩＮ Ｅ Ｎ 取 试剂盒抽提 ３ Ｓ Ａ家系成员 的外周血样 品 Ｄ Ａ 电 个 Ｍ Ｎ ， 泳检测 ， 定量 ， 规 Ｐ Ｒ法 扩 增 Ｓ Ｎ基 因 的 ７号 外 显 常 Ｃ Ｍ 子 ，ｒ Ｉ Ｄａ 酶切 Ｐ Ｒ产物 ， Ｃ 常规聚 丙烯胺 凝胶 电泳 法分 离 酶切后 Ｐ Ｒ产物 ， 染检测 。同时应用 Ｍ Ｐ Ｃ 银 Ｌ Ａ检 测试剂
中国计划生育学杂志 ２０ ０ ８年第 ９期总第 １５期 ５
的患儿均纯合缺失 Ｓ Ｎ１ Ｍ 的第 ７号外显 子， Ｌ Ａ检测结果与之完全相符 ， 同时还 检测 出这 ３个 Ｓ ＭＰ 但 ＭＡ家系 中的患儿 均纯合缺失 Ｓ ＮＩ的第 ８号外 显子 。结论 ：与 Ｐ Ｒ—Ｒ Ｌ Ｍ Ｃ Ｆ Ｐ相 比， Ｌ Ａ更加简便 、 ＭＰ 快捷 、 可靠 ， 是一种高效的遗传病 基
脊髓性肌萎缩症SMN基因检测和其表达的研究
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二、材料 １．试剂：
（１）基因组ＤＮＡ提取试剂：１．５％ＥＤＴＡ，低渗ＲＢＣ裂解液（０．７％ＮＨ。 ＣＬ，７．１２％ＮＨ。ＨＣ０３），ＤＮＡ提取缓冲液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｔＯｍｍｏＬ／Ｌ ｎａＣＬ，１０ｉｎｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＣＬ，０．５％ｓｏｓ），２０ｍｇ／ｍｌ蛋白选择： 基因诊断确诊为ＳＭＮＩ外显子７纯合缺失的ＳＭＡ患者５７例（Ｉ型２１ 例，Ⅱ型２５例，Ⅲ型１１例）。患者父母１１４例；正常对照４０例，均为本院检 验科职工，个体问无亲缘关系。 ２．标本留取： （１）分离白细胞：受试者外周静脉血５ｍｌ，用１．５％ＥＤＴＡ ０．５～１．０ｍｌ抗
．２·
和酚（上海生工公司），氯仿，异戊醇，无水乙醇。 （２）电泳试剂：琼脂糖（ＴａＫａＲａ公司），１００ ｌａｄｄｅｒ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ（ＴａＫａＲａ
公司），载样缓冲液（９８％甲酰胺，０．０５％澳酚兰，０．０５％二甲苯氰，ｌＯＭｍ ＥＤＴＡ）、冰乙酸、０．２％ＡｇＮ０３，３％Ｎａ２Ｃ０３，０．４％甲醛。聚丙烯酰胺，甲叉双 丙烯酰胺（上海生工公司），过硫酸铵，ＴＥＭＥＤ，超纯尿素（Ｓｉｇｍａ公司）
凝，３０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，１０ｒａｉｎ，弃去血浆，剩余ＲＢＣ加２倍体积的低渗ＲＢＣ裂攥 液，震荡，放置４０ｒａｉｎ，离心（操作同上），弃去上清，重复一次，提取的ＷＢＣ
进行性脊髓性肌萎缩症的鉴别诊断
进行性脊髓性肌萎缩症的鉴别诊断一、什么是进行性脊髓性肌萎缩症？进行性脊髓性肌萎缩症（Progressive Spinal Muscular Atrophy，简称PSMA）是一种罕见的神经系统疾病。
该疾病主要影响脊髓前角神经元和脊髓神经元，导致进行性肌肉萎缩和无力。
PSMA通常出现在婴幼儿期或儿童期，对患者的生活造成严重影响。
二、进行性脊髓性肌萎缩症的症状1.肌肉无力和萎缩，特别是下肢和躯干肌肉；2.运动障碍，包括走路困难和动作笨拙；3.脊椎畸形；4.失去大小便和性功能障碍；5.骨关节变形；6.呼吸困难。
三、针对PSMA的鉴别诊断方法进行性脊髓性肌萎缩症的确诊需要排除其他具有相似症状的疾病。
以下是一些常用的鉴别诊断方法：1.临床症状：观察患者的肌肉症状、运动障碍和神经功能，与其他疾病做对比；2.神经肌肉电生理学检查：进行脊髓前角神经元检查以确定是否受损；3.肌肉活检：观察肌肉组织的结构和功能，有助于排除其他肌肉疾病；4.DNA检测：进行基因检测，确定与PSMA相关的突变。
四、进行性脊髓性肌萎缩症的鉴别诊断要点1.注意出现肌肉无力和萎缩的患者，特别是婴幼儿期和儿童期；2.进行彻底的临床检查，包括神经系统检查和肌肉症状观察；3.组合多种诊断方法，进行综合分析，并排除其他可能性的疾病；4.对病例进行追踪和监测，了解病情的发展和变化。
结语通过本文的介绍，我们了解了进行性脊髓性肌萎缩症的症状和诊断方法。
针对这一疾病，及时的鉴别诊断对患者的治疗和康复至关重要。
医务人员和家庭成员应加强对PSMA的认识，早期干预和治疗能够显著提高患者的生活质量。
希望本文能为相关医护人员和患者家属提供一些帮助。
脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数变异分析
脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数变异分析SMN1基因位于人类染色体5号上，它编码蛋白质Survival Motor Neuron（SMN）。
SMN蛋白在神经元细胞中起到维持运动神经元正常功能的重要作用。
SMN1基因缺失或发生突变会导致SMN蛋白的表达减少或功能异常，从而导致脊髓前角神经元的退化和变性。
SMN2基因也位于人类染色体5号上，它与SMN1基因非常相似。
然而，SMN2基因产生的SMN蛋白比SMN1基因少，且其中一部分SMN2基因剪接产物具有缺失的外显子7、这些缺失的外显子7使得这些剪接产物不能产生功能完整的SMN蛋白。
由于SMN2基因的存在，即使SMN1基因发生突变或缺失，仍有可能产生少量的功能性SMN蛋白，从而减轻患者的症状。
因此，SMN2基因的拷贝数也对脊髓性肌萎缩症的发生和病情严重程度起到重要的影响。
一般来说，人类的SMN1基因拷贝数为2个，而SMN2基因拷贝数则在1到6个之间变化。
SMN2基因拷贝数越多，产生功能完整的SMN蛋白的数量也越多，相应地病情也较为轻重。
根据SMN2基因的拷贝数，脊髓性肌萎缩症可分为不同的类型，包括SMA1、SMA2、SMA3和SMA4等。
为了进行SMN1和SMN2基因拷贝数变异的分析，可以采用多种方法，包括基因测序、多重聚合酶链反应（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA）等。
基因测序可以对SMN1和SMN2基因进行全面的测序分析，以确定它们是否存在突变或缺失。
通过测序分析，还可以鉴定SMN1基因和SMN2基因之间的跳跃事件（Gene Conversion），这些跳跃事件可能导致SMN1基因的缺失或复制而形成多余的SMN2基因。
MLPA是一种高效、准确的检测基因拷贝数变异的方法。
它利用引物特异性结合目标序列进行扩增，然后通过电泳分离扩增产物，并通过比较目标序列与参比序列的相对信号强度来确定基因拷贝数。
脊髓性肌无力是怎么样检查的？
脊髓性肌无力是怎么样检查的？脊髓性肌无力是比较常见的一种疾病，可能会导致患者的运动神经出现障碍，甚至可能会引起一些并发症的问题发生。
做这项检查确诊的时候，需要通过基因和血清的诊断，包括对肌肉进行扫描，来判断一下病情的具体问题，来进行一个系统的确诊。
1.血清CPK SMA-Ⅰ型血清CPK均为正常。
Ⅱ型偶见增高，其CPK同工酶MB常有升高。
Ⅲ型CPK水平常增高，有时可达到正常值10倍以上，且同工酶变化以MM为主；一般CPK常随着肌肉损害的发展而增加，至晚期肌肉严重萎缩时，CPK水平才开始下降。
2.基因诊断 对于儿童型SMA，一般可通过PCR方法扩增SMNt基因的7、8号外显子并结合单链构象多态分析(SSCP)或应用：DraI、DdeI作SMNt基因7、8号外显子酶切图谱分析进行诊断。
其他辅助检查：1.CT肌肉扫描 此有助于SMA与各型肌营养不良的鉴别。
SMA呈现不完整轮廓的弥散性低密度改变，肌组织反射丧失；而肌营养不良则表现大量低密度损害，全部肌肉均受累。
一般假性肥大在SMA患者中很少见。
2.电生理检查 EMG可反映4种主要类型SMA的严重程度和进展情况。
但其异常改变相似，包括纤颤电位和复合运动单位动作电位(MUAPs)的波幅和时限增加以及干扰相减少。
在SMA-Ⅲ、Ⅳ型病例中，有时可见神经源性和肌源性电位，混杂存在于同一肌肉。
在CPK水平增高者肌源性MUAPs可更明显。
某些SMA-Ⅲ型病例，肌活检呈神经源性损害，而EMG却表现肌源性损害，提示EMG与临床特征可不一致。
各型SMA均见纤颤电位及正锐波，但在SMA-Ⅰ型更明显，见于所有患者，而SMA-Ⅲ型仅见60%。
束颤电位在SMA-Ⅰ型约20%阳性，而Ⅲ型则有50%阳性。
SMA-Ⅰ型的一个独特表现，即在肢体放松时，可见到5～15 Hz 的MUAPs自发性发放。
随意运动时，各型SMA均见干扰相减少，尤其在SMA-Ⅰ型，仅呈单纯相，这是运动单位丧失的证据。
脊髓性肌萎缩症临床实践指南
脊髓性肌萎缩症临床实践指南脊髓性肌萎缩症临床实践指南引言：脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，简称SMA）是一种常见的遗传性神经系统疾病，特征是运动神经元的丧失导致肌肉弱化和萎缩。
SMA是由一个缺乏或异常表达蛋白质SMN1（survival motor neuron 1）基因引起的。
本文将介绍脊髓性肌萎缩症的一般概述、临床特征、诊断和治疗方面的指南。
一、一般概述：脊髓性肌萎缩症是一种常见的儿童期神经系统疾病，在全球范围内的发病率约为1/6000-1/10000。
疾病主要影响儿童，尤其是婴儿和幼儿，但也会在成人中出现。
该疾病通过遗传方式传递，主要有4个亚型：SMA类型I、SMA类型II、SMA类型III和SMA类型IV。
SMA类型I是最严重的亚型，通常在婴儿期出现严重的肌无力和肌肉松弛。
SMA类型II在幼儿期出现，患者能坐但不能站立或行走。
SMA类型III和SMA类型IV在儿童期或成年期出现，患者能行走但存在不同程度的肌肉无力。
二、临床特征：脊髓性肌萎缩症的临床特征主要与运动神经元的丧失有关。
患者常出现骨骼肌无力和运动障碍。
初期症状通常是婴幼儿的运动发育延迟，如不能抬头、不能翻身等。
随着疾病的进展，肌肉弱化和萎缩将导致运动功能受限，如不能坐立、不能行走等。
三、诊断：脊髓性肌萎缩症的诊断主要依据患者的临床表现、肌肉病理改变和SMN1基因异常。
临床表现是最常见的诊断依据，如肌肉无力、肌肉痉挛和运动功能障碍。
肌肉病理改变通常通过肌肉活检进行，特征是神经元丧失和肌纤维变性。
最后，SMN1基因异常通常通过基因检测来诊断，常见的异常是SMN1基因缺失或基因重排。
四、治疗：目前尚无治愈脊髓性肌萎缩症的方法，但有一些治疗手段可以减轻疾病症状和延缓其进展。
物理疗法是必不可少的治疗手段之一，如物理训练、按摩和理疗等。
药物治疗方面，目前批准使用的药物有纳武平（nusinersen）和曲美曲全（onasemnogene abeparvovec）。
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Correspond ing au thor: D IN G X in2sheng, Em a il: xsd ing@ public11ptt1 js1cn
【Abstract】 O bjective To study g of gene deletion of childhood2 onset sp inal muscular atrophy ( SMA ) in China, and the value of the m ismatching polymerase chain reaction2 restriction fragment length polymorphism ( PCR 2RFLP) in gene diagnosis on SMA1 M ethods PCR 2RFLP
发病 。1995年 , Lefebvre等 [ 1 ]克隆到 SMA 的致病基 因 运 动 神 经 元 存 活 基 因 ( survival motor neuronalgene, SMN ) ,并发现 9817% ( 226 /229 )的儿 童型患者存在 SMN t基因缺失或中断 ,自此通过检 测 SMN t基因缺失情况的基因诊断成为本病主要的 确诊方法 。我们于 1997 年起就在国内率先应用错 配聚合 酶 链 反 应 2限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 ( PCR 2 RFLP) 分析进行该病的基因诊断 , 2003 年 7 月至
4. 电泳 :配制 2%琼脂糖凝胶 ( agrose∶nusieve = 2∶1) ,以 015 ×TBE缓冲液电泳观察结果 。加样量
为每孔 18μl(包括酶切后的产物 15μl和 10 ×加样 缓冲液 3μl) ,相对分子质量标准为 PGEM ( Promega 公司 ) 。电压 70～100 V ,时间约 1 h, 015 μg /m l溴 化乙锭 ( EB )染色后 ,紫外灯下观察结果 ,照相 。
the exon 7 of telomeric and centromeric SMN gene were both 187 bp , and there was only one nucleotide difference between the two sequences ( T→C) , which was identical to foreign reports1Conclusion s The gene sequence of Chinese patients w ith childhood2onset SMA was coincident to foreigners, the percentage of homozygous deletion of the exon 7 of the SMN gene was high in type Ⅰ and Ⅱ SMA patients, yet the percentage was low in type Ⅲ SMA patients. M ismatching PCR 2RFLP m ight be recommended as an effective diagnosis for typeⅠand Ⅱ SMA patients1
·426·
中华神经科杂志 2005年 7月第 38卷第 7期 Chin J Neurol, July 2005, Vol 38, No. 7
·论著 ·
脊髓性肌萎缩症基因诊断
李文磊 丁新生 吴婷 姚娟 邓晓萱
【摘要 】 目的 探讨中国人儿童型脊髓性肌萎缩症 ( SMA )的基因序列 、基因缺失情况及错配
method was used to detect the homozygous deletion of the exon 7 of SMN gene in 34 p resumed SMA patients ( 18 w ith type Ⅰ, 11 w ith type Ⅱ, 5 w ith type Ⅲ) and 20 normal fam ilial members of these patients and 20
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中华神经科杂志 2005年 7月第 38卷第 7期 Chin J Neurol, July 2005, Vol 38, No. 7
聚合酶链反应 2限制性片段长度多态性分析 ( PCR2RFLP)技术在儿童型 SMA 基因诊断中的价值 。方 法 应用错配 PCR2RFLP分析对 34例拟诊为儿童型 SMA ( Ⅰ型 18例 , Ⅱ型 11例 , Ⅲ 型 5 例 )的患 者 、20名 SMA 患者的健康家系成员及 20名健康人进行运动神经元存活基因 ( SMN ) 7号外显子缺失 检测 ,并选择 1例 SMA 患者的 SMNc和 1例健康人的 SMN t基因 7号外显子进行基因测序 。结果 34 例拟诊 SMA 患者 31例 (9112% )有 SMN t7号外显子缺失 ,其中 Ⅰ型 18例 , Ⅱ型 10例 , Ⅲ 型 3例 ,所 有健康人均无 SMN7号外显子缺失 。 SMNc和 SMN t基因 7号外显子测序长度均为 187 bp, 两者的序 列只有 1个碱基的差异 ( T→C) ,与国外报道一致 。结论 中国人儿童型 SMA 基因序列与国外报道 一致 , Ⅰ～Ⅱ型基因缺失频率高 , Ⅲ型缺失频率较低 ,错配 PCR2RFLP可作为诊断 Ⅰ、Ⅱ型 SMA 的有 效手段 。
【关键词 】 肌萎缩症 ,脊髓性 ; 碱基错配 ; 聚合酶链反应 ; 染色体 ,人 , 7对
Genetic d iagnosis and gene sequenc ing of sp ina l m uscular a trophy L I W en2lei, D IN G X in2sheng, WU T ing, YAO J uan, D EN G X iao2xuan1D epa rtm en t of N eu rology, the F irst A ffilia ted Hospita l of N an jing
normal individuals1 M eanwhile, centromeric SMN gene of one SMA patient and telomeric SMN gene of one normal member were selected to perform gene sequencing1Results Homozygous deletion of exon 7 of the SMN gene was detected in 31 of 34 ( 9112% ) cases of p resumed SMA , among which 18 in typeⅠ, 10 in type Ⅱ, 3 in type Ⅲ, and no homozygous deletion was found in the normal controls; the sequence lengths of
基金项目 :江苏省教委自然科学基金资助项目 ( JW970091 ) ; 江 苏省科委应用基金资助项目 (BJ980083) ;江苏省卫生厅重点资助项 目 ( H2011)
作者单位 : 210029 南京医科大学第一附属医院神经内科 通信作者 : 丁新生 , Email: xsding@public11p tt1 js1cn
2. DNA 提 取 及 引 物 合 成 : 用 乙 二 胺 四 乙 酸 ( EDTA )抗凝管各取实验对象外周血 015 m l,按照 美国 GENTRA 公司 DNA 提取试剂盒或北京帕弗瑞 生物技术有限公司的 PEL 2FREEZ试剂盒的操作步 骤提取 DNA ,并置于 TE缓冲液中 4℃保存待用 。
5. 基因测序 : 选择 1例凝胶电泳仅有 1条较短 片段条带的 SMA 患者 (诊断为阳性 )的 DNA 直接扩 增产物 ,另选 1例凝胶电泳出现 2条带的健康人 (诊 断为阴性 ) ,将其 1条长片段凝胶回收 ,两份标本送 上海博亚公司进行测序 。
6. 统计学方法 : 所有的数据均用 SPSS 1010软 件进行 χ2 检验分析处理 。
结果
1. 基因测序结果 : 根据选用参照文献的引物 , 我们选择测序的两份标本 , 1份是 SMN t基因纯和缺 失的 SMA 患者的 SMNc基因的 7 号外显子 , 1份是 健康人 SMN t基因的 7 号外显子 。 2 个片段测序结 果与国外报道 [ 1 ]一致 ,长度均为 187 bp ,两者的序 列只有 1个碱基的差异 ( T→C) ,见图 1;两者分别与 正常的 SMNc及 SMN t基因比较均有 1 个相同的碱 基差异 ( G→A ) ,此不同的碱基位点是由于引入的 错配引物产生的 ,从而也形成了 SMNc基因的 D ra I 酶切位点 。
【Key words】 M uscular atrophy, sp inal; Base pair m ismatch; Polymerase chain reaction;
Chromosomes, human, pair 7
脊髓性肌萎缩症 ( sp inal m uscular atrophy, SMA ) 是一组遗传性下运动神经元变性疾病 。其主要表现 为进行性 、对称性肌无力和肌萎缩 ,儿童和成人均可
引物参照相应文献 [ 2, 3 ]合成 ,由中国科学院 上海细 胞生 物所 合成 。外 显 子 7 引 物 : R111: 5′2 AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA 23′和 错 配 引 物 X72D ra: 5′2CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTTT23′。
31PCR 扩增及酶切反应 : 取 115 m l离心管 ,反 应体系为 50 μl, 按下列次序加样 : 5 ×Buffer 5μl, M g2 + 3μl (25 mmol/L ) , 4 ×dNTP 1μl (20μmol/L ) , 引物各 1μl (25 pmol/μl) , Taq聚合酶 2 U , DNA 模 板 5μl(100 ng /μl) ,置 PCR 扩增仪上 (中科院遗传 所产 PCR 290AD ) , 94℃预 变 性 7 m in, 然 后 94℃ 30 s, 55℃1 m in, 72℃ 1 m in,循环 35次后 , 72℃延伸 7 m in。取上述外显子 7的 PCR 扩增产物 15 μl,加 内切酶 D ra I和相应的缓冲液进行酶切反应 ,总量为 每例 25μl,含 D ra I 2 单位 。置于 37℃水浴中反应 3 h。