单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素
重组人胰岛素和重和生长激素的生产工艺
由于结构和性质的差异，胰岛素和生长激素的分离纯化过程有所不同，
涉及的步骤和技术也有所区别。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
要点一
酵母表达系统
要点二
低成本、高产出
酵母作为宿主细胞具有高表达、易培养、易发酵等优点， 有助于提高胰岛素的生产效率。
通过大规模发酵和分离纯化，可以实现低成本、高产出， 降低治疗费用。
使用哺乳动物细胞作为宿主细胞，能够实现更接近人体 生理状态的糖基化过程，提高生长激素的生物活性。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
更接近人体天然结构
哺乳动物细胞表达的生长激素更接近 人体天然结构，降低了免疫排斥的风 险。
临床效果更佳
由于结构和性质的优化，重组人生长 激素在治疗某些疾病方面具有更好的 临床效果。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的异同点
01 02
原料与培养基
胰岛素生产主要使用酵母作为宿主细胞，而生长激素则更倾向于使用哺 乳动物细胞作为宿主。此外，培养基的成分也有所不同，以满足不同细 胞的需求。
蛋白质修饰
胰岛素和生长激素在蛋白质修饰方面存在差异，以适应其特定的生理功 能和药理作用。
03
分离纯化过程
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
生产成本高
哺乳动物细胞培养成本较高，导致生长激素的生产成本增加。
生产周期长
哺乳动物细胞生长缓慢，培养周期长，影响了生产效率。
潜在的病毒污染风险
虽然采用了各种病毒消除技术，但仍存在病毒污染的风险。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的发展趋势与展望
基因编辑技术应用
通过控制培养条件，如温度、pH、营养物 质等，优化细胞代谢，提高目标蛋白质的产 量。
[doc] 亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体
![[doc] 亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体](https://img.taocdn.com/s3/m/0fed02adf12d2af90242e6b2.png)
亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体嚷克休通讯1989年第一(譬苹26朝J:6一亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体玉芳范春荣黄劲松(一胃药.I1,生物一硷童所,七京)本文夼绍j用免抗鼠IgM血清制备的亲知层沂柱从小鼠腹水中一步提纯单克隆抗体IgM的方法提纯的IgM压用琼脂糖电泳检测为一个区带应用迁碌条件下的SDS—PAGE拴测分离为分子量～80K的重链和～25K的轻篷两条医带,几未见其他鲁带;应用免疫印米法鉴引.进一步确证IgM,不合常见的鲁质IgG.实验过程还发现提她的IgMT-够稳定,在贮存过程有降解现象.另外厘用同一亲和柱从吸附IgG后的小鼠血清中提取多克隆抗体IgM的砬襄也是良好的,经用还原条件下的SDS—PAGE检测,同样也只分离为轻童链两睾匡带,未见混有其他奈蛋白.随着单克隆抗体(McAb)的广泛应用.对其研究也日益深入,但含McAb的细胞培养上清腹水和血清中含有大量的杂蛋白和其他犬分子物质使McAb的研究和应用受到一定的限制,固而常需进行纯化各实验室制备的McAb最常见的为IgG类和1gM类抗体,一般来说,提纯IgG类抗体的方法较多,操作较简易,而igM类抗体的纯化就较困难,常用的方法是凝胶过滤法如Nicholas等(1982)”?和B&livet等(1984)报道的方法,撵作都较繁锁,提取的IgM纯度也不高;亲和层折法虽是提取IgM的简易有效法,又常受难于得到理想免疫吸附荆的限制而无法采用我们于1986年采用一个简易微量法研制成功了兔抗鼠IgM血清:,为采用亲和层析法提取IgM创造了必要的条件,用该法一步提纯的IgM经琼脂糖电泳分析为一条区带SDS—PAGE(还原)分离为重链和轻链两条区带.几乎未樯出其他杂蛋白区带材料和方法～材料来源McAbJgM系兰州生物制品研究所赠送的HBsAgMcab小鼠腹水正常小鼠血清为昆明}1小鼠血清:SF2/0瘤株小鼠腹水,本所茁苗二室制备;免抗鼠IgM血清,本实验室研制:辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG血清丹麦Kern—En—Tee产品:硝酸纤维膜(卜C)浙江黄岩化工厂产品;其他化学试剂为分析纯级.=,抗鼠IgM亲和屡折柱的制备免抗鼠IgM血清8m{经50饱和度硫酸胺粗提后,用 D.1MNe,HCO3—0.5MNaCI透析平衡,J52.5gCNBr活化Se!ab;arose4B(瑞典Pha—illarcia产品)偶联,操作参照其使用说明书进行,然后装柱(1×11CEl1),用流洗缓冲渡(o.01MTris—HC】_0.001MEDTA一0.1MNaCIpH7.6)平衡待用三,蛋白含量测定分光光度法,280rim波长测光密度值(oD)四HBsAg抗体活性测定血凝法,血球诊断试剂系北京生物制品研究所生产.五,琼脂糖电泳用0.06MpH8.6巴比妥缓冲液配制l琼脂糖凝胶,按常规浇板打孔电泳染色脱色.67六,sDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(还原)参照fJeamm(A(1970)”方法进行?分离胶浓度为10或l3%.七,免疫印染参照Towbi(1979):方法进行,先将抗原采用SDS—PAGE(还原)分离,再应用LKB2005Transphor电转移仪将聚丙烯酰胺凝胶上己分离的抗原区带转移至硝酸纤维素膜(NC)上,用2吐温20封闭,加相应的第一抗体(适当稀释)冰箱过夜次日洗涤后,加辣根过氧化物酶标记第二抗体(5O0~IOOU倍稀释)室温培育l一2小时.再加二氨基联苯胺底物液显色,换蒸馏水终止反应,观察结果结果和讨论一,IgM类McAb的提取将HBsAgMcAbIgM小鼠蝮水2ml加于抗鼠IgM亲和柱上,待样品完全进胶后置冰箱过夜,使其充分吸附,次日取出用0.01MTris-HC1—0001MEDTA一01MNaCIpH7,6缓冲液充分流冼,除去未结合的蛋白,换用01M甘氨酸一HC1pH24缓冲液洗脱吸附蛋白,分管收集,每管约4m1,并立即用lNNaOH调pH至6.0L右,测OD及HBsAB 抗体活性,由图l看出冼脱液中含单一蛋白锐峰,经活性测定为HBsAg抗体.1?3?号4.图lMcAbIgM的洗脱蟑=.提纯IgM的琼脂糖电泳图2提纯McAbIgM的琼脂电泳由于TgM的分子量比较大,故提igVJ后的标本采用无分}筛效应的琼脂糖电泳进行.并同时用HBsAgMcAhIgM/]~鼠腹水,正常小鼠血清及鼠血清IgG作对照分析结果见图2.可看出提纯的IgM除加样孔左侧呈现一条区带外,未检出对照媛水中的其他蛋白医带,以及与主要泳动在加样孔周围的鼠血清IgG也完全不同,表明经亲和星析提取出单一.的IgM类McAb舳M愎叫地嘴椽三,提纯ticAbIgti的SDS-PAGE(还原)将图l中亲和层析纯化MeAbIgM洗脱的第3,4,5管与提纯前的HBsAhMcAbtJ~鼠腹水,正常小鼠血清,小鼠血清IgG同时进行SDS—PAGE(还原)分析,并以己知分子量标志物作对照,结果见图3,可看出第3,4,5管样品皆解离为分子量一80K(相当髓)和一2sK(相当轻链)的两个区带,除长二区带外未见其他蛋白医带.而小鼠血清IgG重链(Y链)一55K.轻链也一25K,以上结果再次汪明经亲和层析一步纯化的McAbIgM,除去了原腹水中各黎蛋白达到了电泳纯:1.正常小鼠『血清2.HBAgMcAb/j,裂膛求3.挺缝的McAbIgM第3管4.提纯的McAbIgM第4管5.提纯的McAbIgM第5管6.小鼠血清IgG7.巳知蛋白分子量标志(从上到下)rrk,681~,k,45k,25k,11.rk图3提纯McAbIgM的SDS—PAGE(还原)四,用兔瘦印染法鉴定提纯的M~AbIgM按照免疫印染法先采用SDS—PAGE(还原)将提纯的McAbIgM进行分离,同时以McAbIgG(IgG)及小鼠血清IgG作对照(图4A).然后电转移至NC膜上,一式三份,一份考马斯亮监染色后作对照(图4B):一份加抗鼠IgM血清与之作用,显色(图4C);一份加抗鼠IgG血清与之作弼,显色(图4D),结果如下:(一)由图4C看出三}样品与抗鼠IgM血清作用后,待检IgM的链和轻链显色很深,确证该样品为IgM娄,但除此尚有非重轻链的两条区带(因含量较低,图4A和B皆未染出)也显色,是否杂蛋白.留持下面讨论:对照McAbIgG仅轻链显色,显示未检出IgM,但轻链与待槛IgM的轻链有交义反应:小鼠血清lgG无显色区带,表明不含igMf二)由图4D看出三珊样品与抗鼠lgG血清作用后,待橙IgM仅轻链显色,证明不含IgG.只是一次证叼其轻链与IgG的轻链出现交义反应;对照McAbI§G 因为IBG亚类.所链和轻链显色都很深,陈此尚有分子量小于链的8—9条医带显色,我们分析是由于该抗体不姑稳定,在保存过程IgG分子形成碎片,故也显色小鼠血清IgG,因JgG仅为其69成分之一其余为其他亚类,因而虽然其加样量NMcAbIgG相近(皆约1.5fig),但链的显色远~McAhI§G浅,轻链未显色就可能是NMcAhIEG的轻链非同种,图4提纯McAblgM的免疫印染图5(A)SDS—PAGE(还原)1.小鼠皿清IgG2.提纯的McAbIgM3.McAbIgGl贮存McAbIgM的sDs—PAGE(还原)1.正常小鼠皿清2.,鼠请IgG3.贮存2个多月~MeAbIgM(B)转咎有A中二种样品的NC(,芎马斯亮蓝染色)(C)转移有A中三种洋品的NC与抗鼠IgM结台船显色图谱(D)转移有A巾三种样品的NC与抗鼠IgG结台的显色图谱综上结果即本实验提纯的IgM进一步确证为IgM类,且不含血清中的主要成分IgGl,至于图4C中尚拉出非链和轻链的区带问题,我们认为并非杂蛋白,而是IgM分子的降解产物,不仅其能与抗IgM血清作用,显色,而且在我们以前的实验中曾发现新提取的该抗体,采用SDS—PAGE(还原)分析仅解离成链和弪链两条区带,但同一标本在冰箱贮存一段时间后,再次分析,就可出现上述解离为4条区带的现象,见图5,只是这钟不稳定现象是个别MeAbIgM的特点,还是IgM分子的通性,就有待进一步观察了; 五,鼠血清多克隆IgM的提取在应用抗IgM亲和层析拄提~McAbIgM之后,叉应用同一亲和柱从经SPA一4B柱吸附IgG后的小鼠血清中提取了鼠多克隆IgM.结果经用SDS—PAGE(还原)证明,提取的效果也是良好的同样只梭出IgM的重链和轻链两条区带,未见混有其他杂蛋白成分见图6.7O】.已知蛋白分子量标志(上到下)7rk86k,5,45k,11.7k2.小鼠血清IgG3.Se2/0瘤株小鼠腹水4.HBAgMcAb小鼠腹.提纯的McAbIgM6.犍纯的McAbIgM27.提取McAbIgM.c~的小鼠疆瘩8.正常小鼠血清9.拄纯的小鼠血谪IgM10.提取IgG’TnIgM后的小鼠血清固6提纯小鼠血清Ig_’vl的SDS—PAGE(还原)参考文献1.Kicholas,J.eEa1.:j.ImmItI101.Meth.53(2).150,1982. .BouvetJ.P.eta1:J.Imrattno].Meth.66,209,1984.范舂荣等《i…疫学泶》待发裘..Leamm1I,U.R.,NatrifeLondon),227,680,1970.5.Towbin,H.eta1:A.6,4350,1979. 鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立乔忠詹丽娥枥静赵秋成孙世兴指导史振马丛林刘玎(i西省发科院畜牧兽医研究所土臣)(长春军事兽医大学军事兽医研宄所)鸡传染睫法氏囊病(IBD)又称甘博罗病,这是鸡的一种高度接触性传染病该病毒可引起免疫抑制,使新城疫苗的免疫效果降低或失败.使鸡对各种病原体的易感性增强,病死率增高,给养鸡业造成严重的经济损失.本文用经硫酸铵沉淀,高速度离心并经蔗糖密度梯度离心提纯的鸡传染性法氏囊病病毒免疫BALB/c小鼠取免疫鼠脾细胞与NS-l小鼠骨髓瘤细胞融台,共获儿株阳性杂交瘤细胞系,搔一次克隆化和ELISA检测,筛选出三三株(113-,5D,6D)能保持分泌IBD病毒单克隆抗体的杂炎瘤细胞系.培养上清液的ELISA效价为6.4>-il0,免疫脱水效价1.6×lEl..三株杂交瘤细胞系的染色体数为85—105条,证实为杂交细胞.本单克隆抗体的研制给鸡传染性法氏囊病的诊断和免疫提供r制剂=7l。
一种重组人生长激素蛋白的纯化方法[发明专利]
![一种重组人生长激素蛋白的纯化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/08bd511df61fb7360a4c6567.png)
专利名称：一种重组人生长激素蛋白的纯化方法专利类型：发明专利
发明人：陈剑清,盖其静,王可盈
申请号：CN202011200459.8
申请日：20201102
公开号：CN112250756A
公开日：
20210122
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种重组人生长激素蛋白的纯化方法。
本发明提供一种重组hGH蛋白的纯化方法，具体方法如下：通过构建酵母重组子pPICZαA‑hGH‑SMD1168，重组子在适当条件下发酵，利用甲醇诱导分泌表达与人hGH蛋白完全氨基酸序列一致的重组hGH蛋白。
将发酵液上清用300 kD膜包过滤，表达的重组hGH蛋白被截留，截留液过分子筛Sephadex G200，可高效分离目的蛋白，可得到纯度95%以上的重组hGH蛋白。
解决了没有标签重组蛋白纯化困难的问题。
申请人：浙江清肽生物科技有限公司
地址：312366 浙江省绍兴市滨海新城沥海镇马欢路398号科技创业中心C号楼5楼505室
国籍：CN
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McAb(单克隆抗体)亲和层析柱纯化
McAb(单克隆抗体)亲和层析柱纯化重组人α干扰素作为一种具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞生长及免疫调节作用的细胞因子新型药物，已在国内外广泛投入临床应用，并取得了显著的疗效。
国际上对用于临床的重组干扰素的纯度要求很高，美国NIH规定必须在90%以上，因此生产者普遍采用亲和层析纯化法。
我们研制了rHuIFN-α2a的 McAb 3F1，与CNBr活化的Se pharose 4B交联制成亲和层析柱，经1年60余次较大规模试用表明具有较理想的亲和层析纯化rHuIFN-α2a的性能，达到了国内外同类McAb的水平。
由于 McAb 3F1也能和rHuIFN-α2b结合，故极有可能亦适用于rHuIFN-α2b的亲和层析纯化。
一、性能指标1.McAb的特性：IgG1，间接ELISA效价10-7，对rHuIFN-α2a具中和活性。
2.洗脱的rHuIFN-α2a纯度：>90%。
3.洗脱的rHuIFN-α2a比活性：≥1×109IU/mg。
4.rHuIFN-α2a的回收率：≥95%。
5.亲和柱的稳定性：4℃操作和保存情况下，使用60余次1年时间性能无明显下降。
6.与国外McAb比较：各项指标绝不亚于英国Celltech公司生产的McAb NK2。
二、操作方法1.rHuIFN-α2a的粗提：表达rHuIFN-α2a的工程菌用盐酸胍裂解，过DEAE凝胶柱粗提，收集活性峰。
2.亲和层析：rHuIFN-α2a粗提物用pH7.2，0.15mol/L PBS透析过夜，上样于经pH7. 2，0.15mol/L PBS平衡的亲和层析柱，流速0.5ml/分，然后用大量PBS流洗至流出液OD280≤0.02，再用pH2.4，0.1mol/L甘氨酸-HC1洗脱，洗脱液立即转至pH7.2，0. 15mol/LPBS中透析过夜，测定蛋白浓度、纯度和活性。
三、保存方法1.亲和柱的再生：先后用10个柱床体积、含0.5mol/L NaCl的pH8.5，0.1mol/L Tri s-HCl和pH4.5，0.1mol/L醋酸钠缓冲液流洗亲和柱，再用pH7.2，0.15mol/L PBS充分平衡。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
重组人生长激素生产工艺流程
重组人生长激素生产工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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抗体纯化的方法有哪些
抗体纯化的方法有哪些1. 亲和层析法这可是个挺厉害的法子。
它就是利用抗原和抗体之间特异性的亲和力来纯化抗体的。
就像是一把精准的钥匙开一把锁一样，只有特定的抗体才能和这个抗原结合。
比如说，把抗原固定在一个柱子上，然后让含有抗体的混合液流过这个柱子，那抗体就会被抗原抓住，留在柱子上，而其他杂质就流走啦。
然后再用一些特殊的溶液把抗体从柱子上洗脱下来，就得到比较纯的抗体了。
这种方法纯化出来的抗体纯度那是相当高的，就像从一群杂七杂八的东西里挑出了最想要的宝贝一样。
2. 离子交换层析法这个方法也挺有趣的。
它是根据抗体和杂质离子电荷的不同来分离的。
离子交换剂有阴离子交换剂和阳离子交换剂。
如果抗体带正电荷，就可以用阴离子交换剂。
把混合液加到柱子里，带负电荷的离子交换剂就会和带正电荷的抗体相互作用。
不同的抗体和杂质离子与交换剂的结合能力不一样，通过调整溶液的pH 值或者离子强度，就可以把抗体和杂质分离开来。
就像是按照大家不同的脾气秉性来把它们分开，有点像在一群小伙伴里按照不同的性格特点把他们分组一样。
3. 凝胶过滤层析法这个方法就像是给抗体和杂质过筛子。
凝胶过滤的介质有很多小孔，小分子的杂质就会进入这些小孔里，在柱子里走的路程就长。
而大分子的抗体呢，进不去这些小孔，就直接从柱子里流出来了，这样就把抗体和小分子杂质分开了。
就好像是在一个有很多小房间（小孔）的大房子里，小个头的东西会在小房间里乱窜，大个头的东西就直接从大房子里走出去了，很容易就分开了呢。
4. 疏水作用层析法这个是利用抗体表面的疏水基团和层析介质上的疏水基团相互作用来纯化的。
在高盐浓度下，抗体的疏水基团会暴露出来，然后就会和层析介质结合。
之后再降低盐浓度，抗体就会从介质上被洗脱下来。
就像是在一种特殊的环境下（高盐浓度），让抗体和介质互相认识（结合），然后改变环境（降低盐浓度），又让它们分开，有点像在不同的天气（盐浓度变化就像天气变化）下让小伙伴们先聚在一起再分开的感觉。
生长激素的分离纯化工艺
生长激素的分离纯化工艺生长激素是一种重要的蛋白质激素，对人体的生长发育起着重要的调节作用。
为了获得高纯度的生长激素，需要进行分离纯化工艺。
本文将介绍生长激素的分离纯化工艺步骤及其原理。
一、细胞培养及生长激素的提取生长激素通常通过基因工程技术在大肠杆菌等微生物中进行表达。
首先，将携带生长激素基因的重组质粒导入到宿主细胞中，然后进行培养。
在培养过程中，通过调节培养基成分、温度、pH值等条件，促进细胞的生长和生长激素的表达。
当细胞达到适当的生长程度后，通过破碎细胞壁的方法将细胞内的生长激素释放出来。
二、固相萃取固相萃取是生长激素分离纯化的关键步骤之一。
通常使用离子交换树脂进行固相萃取。
离子交换树脂上具有固定的功能基团，可以选择性地吸附目标物质。
将提取得到的细胞培养液经过预处理后，加入离子交换树脂固相柱中，利用生长激素与树脂上的功能基团之间的静电作用力进行吸附。
然后，通过洗脱的方式将生长激素从固相柱上洗脱下来。
三、层析分离层析分离是一种常用的生物分离技术，可以根据分子的物理化学性质实现对混合物的分离纯化。
在生长激素的分离纯化中，通常采用凝胶过滤层析和亲和层析两种方法。
1. 凝胶过滤层析凝胶过滤层析是根据生长激素与凝胶的孔径大小之间的差异进行分离的。
将洗脱得到的生长激素溶液加入到凝胶柱中，较小的生长激素分子能够进入凝胶内部，而较大的杂质分子则无法进入，从而实现了对生长激素的分离。
2. 亲和层析亲和层析是利用生物分子之间的特异性相互作用进行分离纯化的方法。
通常，将具有亲和标记的配体固定在凝胶上，然后将洗脱得到的生长激素溶液加入到凝胶柱中。
生长激素与配体之间的特异性结合使得生长激素被固定在凝胶上，而其他杂质则被洗脱出来。
四、再结晶通过层析分离得到的生长激素溶液通常含有一定的杂质。
为了获得更高纯度的生长激素，需要进行再结晶。
再结晶是通过溶剂的加入和控制温度来促使生长激素结晶，从而实现对杂质的去除。
重复结晶过程可以逐步提高生长激素的纯度。
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单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素陈登鸿 严 鼎 (中国科学院上海生物工程研究中心,上海200233) 中国图书分类号 R393233
单克隆抗体亲和层析技术可用来从体液、组织抽提液、细胞培养液中,特别是从基因工程菌体破碎液等复杂组成物中分离出微量蛋白质和多肽。
由于其特异性高,操作简便而迅速,在高价值蛋白质和治疗用多肽的下游处理过程中,作为一种良好的分离纯化工具,有较广泛的适用性。
本文运用该技术从人生长激素(hGH)基因工程菌发酵破碎液中一步分离制备高纯度并具有生物活性的重组hGH。
1 材料与方法
111 试剂 Protein A2Sepharose C L4B,Sepharose4B 及C NBr(均系SIG M A产品),小鼠抗hGH、兔抗hGH IgG2HRP本室自制,重组hGH基因工程菌发酵破碎液由中心生化工程室提供。
112 方法
11211 抗单克隆抗体的纯化 用hGH的单抗细胞株3H3[1]制得的腹水,经(NH4)2S O4及Protein A2 Sepharose C L4B亲和柱纯化,制得小鼠抗hGH IgG。
11212 双层亲和层析柱的制备 将纯化的小鼠抗hGH IgG通过C NBr法偶联到Sepharose4B珠上,制成亲和层析柱。
在柱上层平面加入115cm高的Sephadex G75,成为纯化hGH的双层亲和层析柱。
11213 hGH的纯化 将离心后的hGH基因工程菌发酵破碎液加入到3×315cm免疫亲和层析柱上,在洗脱hGH前,先用30倍床体积的P BS(含有012% TRIT ON2100)洗取不吸附的杂蛋白和非特异性结合的蛋白质,再用20倍床体积的P BS洗涤,最后用甘氨酸2HCl洗脱hGH。
11214 hGH纯度的鉴定 亲和层析法纯化的重组hGH纯度由HP LC鉴定,Western Blot分析及与兔抗hGH血清免疫双扩散试验。
11215 hGH的生物活性测定 采用兔肝细胞受体结合的免疫酶标检测法[2]测定hGH的生物活性。
2 结果
211 单克隆抗体的纯化 收集到腹水105ml,纯化得到396mg抗体,用E LIS A法测定亲和常数为3×10-9,亚型试验为IgG1型。
作者简介:陈登鸿,男,59岁,副研究员,主要从事免疫化学、细胞免疫和单克隆抗体的研究212 hGH纯度鉴定 396mg的抗hGH IgG1单抗偶联到21ml Sepharose4B珠上,每毫升的Sepharose4B 连接有1817mg单抗蛋白,偶联率为9817%。
基因工程菌液325ml经Lowry法测定含741mg蛋白,用3B10和3H3二个单克隆抗体夹心E LIS A测定每ml 含01109mg hGH,总共35143mg。
经过亲和层析柱洗脱共得64170ml的hGH产物,共含32156mg hGH,回收率为9119%。
每层析1次可从基因工程菌液中纯化23mg左右的重组hGH。
经HP LC分析,描绘出一单峰;经Western Blot分析,图谱呈现分子量较接近的2条主带,其中1条实为裂解带,经与兔抗hGH血清的免疫双扩散试验呈现1条清晰的沉淀带。
表明获得高纯度的hGH产物。
213 hGH生物活性的测定 亲和层析纯化的hGH 经酶标兔肝细胞GH受体法测定(表1),
表明纯化
重组hGH能与兔肝细胞膜受体结合,生物活性较
好。
表1 纯化的hGH与受体结合反应结果
T ab11 Binding results of purified hGH with receptor
hG H(μg)101000510002150011250016250131201156C ontrol
OD4921118711038019480174201548014580138401330
3 讨论
本法制成的单克隆抗体免疫亲和层析柱,可以
直接从基因工程菌体破碎液中一步分离制备高纯度
的并具有生物活性的重组hGH,其特异性高,操作简
便,活性损失小,产物回收率高等特点。
同时本法针
对从发酵破碎液一步分离提取的特点,在亲和层析
方法上作了一点改进,用Shphadex G75(上层)/抗体2
Sepharose4B(下层)双层方法。
减小因大量、多次层
析而造成的污染,既增强了柱的使用效率,也延长了
柱的使用寿命,有较大的实用性。
4 参考文献
1 魏 欣,陈登鸿,金静芬et al.人血清生长激素单克隆抗体放射
免疫测定法1中华内分泌代谢杂志,1990;6(3):169
2 H itary F C1An investigation of sites that bind human s omatetropin in the
liver of the pregnant rabbit1Biochem J,1981;198:605
[收稿2000201211 修回2000206229]
(编辑 张 慧)
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陈登鸿等 单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素 第12期。