分子生物学第三章基因和基因组

第三章基因和基因组第一节基因组的大小与C值矛盾一、相关概念☆基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列．一个典型的真核基因包括①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5‘-端和3’-端非翻译区(UTR)④调控序列(可位于上述三种序列中)基因平均由1000个碱基对组成，一个DNA分子可能包含几个或几千个基因。

☆基因组（genome）：一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，即生物体维持配子或配子体正常功能的全套染色体所含的全部基因（DNA）。

基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。

比如人基因组的全长为大约3×109对碱基，编码3-4万个蛋白分子。

细菌或噬菌体、病毒－－－单个染色体中所含的全部基因（DNA）。

人类基因组计划（human genome project HGP）基因组学（genomics）结构基因组学（structural genomics）功能基因组学（functional genomics）☆C值（C-value）：在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA总量总是恒定的，称为C-值低等真核生物中与形态学复杂程度相关，但高等真核生物中变化很大所谓C值(C value)即单倍体基因组的DNA总量。

它是每一种活生物的一个性质。

C 值大小有着巨大差异。

小到象支原体那样的不足106bp，大到一些植物及两栖类的1011bp。

进化中不同门的C值范围。

随着复杂度的增加，基因组大小的最小值是增加的。

但是随着高等真核生物DNA绝对量的增长，有些门的基因组大小出现了很大的变化。

每门的一种生物DNA的最小量要使原核生物比低等真核生物更复杂，增加基因组大小是必要的。

盐沼核菌(pyrenomas salina)是现已证明的含有最小基因组的真核生物，它有6.6×105bp，（然而这些生物可能并不是真正的真核生物，但可能是进化的中间阶段，代表了细胞核与叶绿体的原始存在形式。

）支原体是最小的原核生物，它的基因组大小只是一个大噬菌体的3倍（T4基因组为1.7×105bp）。

细菌基因组大小至少为2×106bp。

单细胞真核生物（其生命周期可能包含原核时期）的基因组大小也是这么小，尽管它比细菌基因组稍大些。

作为真核细胞per se并不意味着需要基因组大小有很大的增加。

酵母的基因组大小可以只有约1.3×107bp，仅仅是最大的细菌基因组大小的两倍。

黏菌D. Discoideum的基因组比酵母大了两倍，它可以以单细胞或多细胞的形式存在。

为了第一个完全的多细胞生物，复杂度增长是十分必要的。

线虫（c. elegans）的DNA 容量为8×107bp。

沿着进化树上行，我们可以看出，尽管基因组大小的增长对于昆虫、鸟类或是两栖动物与哺乳动物这些物种的产生是非常重要的，但复杂度与DNA的关系变得模糊了。

二、C值矛盾与表现C值矛盾（C-value paradox C-悖理）：形态学的复杂程度与C-值的不一致称为C－矛盾。

主要有以下几方面的体现之一：物种之间－－形态学的复杂性和C－值的复杂性不成正相关a、生物进化程度与C－值的矛盾。

两栖类与哺乳类之间b、亲缘关系相近的生物C-值相差较大例1：两栖类的C-值范围例2：一种普通果蝇的基因组为1.4 X108，而一种普通家蝇的为8.6 X 108之二：与预期的编码蛋白质的基因的数量相比，基因组的DNA含量过多。

例：人类与E.coli编码基因数目的比较研究。

E.coli. 4 X 106bp DN A约编码3000种基因。

人类29 X 108 bp 的DNA 是大肠杆菌的700多倍。

有上百万个基因？？？此外：根据不同细胞中的mRNA数目来估算表达基因的方法。

◘持家基因（housekeeping gene）：有些基因是在所有的细胞类型中都表达的，即这些基因的功能为所有细胞所必须（或称组成型基因constitutive gene）。

◘奢侈基因（luxury gene）:仅在某种特定类型的细胞中表达的基因。

哺乳动物的每种表型的细胞表达的基因约为1 X 104个，这样整个哺乳动物的基因数目要多于每种细胞的表达数，估计应该有1 X 105个（不同书上有一定偏差），约为大肠杆菌的30倍，那么90％以上的DNA功能何在？？第二节细菌和病毒基因组一、大肠杆菌（Escherichia coli E.coli ）1、大肠杆菌在实际工作中的重要性经常被当作是所有生物的原型（archetype）：a、在实验室中容易操作b、生长迅速，要求营养物质简单，能进行很多生理生化过程c、其有性生殖的存在使得遗传学的研究成为可能(遗传杂交、遗传性状、存在性状）d、能够供应细菌病毒的生长，使病毒的本性即病毒扩增的深入研究成为可能。

2、大肠杆菌的遗传物质（1）染色体DNA需要基因组DNA的一些相关操作一般选择对数生长期的E.coli （2～4个类核）以获得丰富的基因组DNA◙类核中，染色体DNA成分占80％，其余为RNA和蛋白质◙ 4.6 x 106bp的基因组DNA 与多种DNA结合蛋白质组装成E.coli的染色体◙基因组DNA为双链环状，总长度为1100～1400μm，1400个基因都已定位小心地将大肠杆菌的DNA与它的大多数结合蛋白分离开，在电子显微镜下就可观察到拟核的组构，其DNA由50~100个环或结构域组成，这些环或结构域的末端被与细胞膜的一部分相连的蛋白固定。

环的大小为50~100kb。

☻ E.coli的基因组的特点a、功能相关的几个结构基因以操纵元(operon)的形式存在其中包括共同的调节基因、启动子（promoter）、操作子(operator),在基因转录时协同动作。

b．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。

c．细菌DNA大部分为编码序列。

d、RNA基因往往多拷贝，蛋白质为单拷贝。

（2）质粒DNA（plasmid DNA）细菌中另一类遗传物质，环状DNA，存在于染色体之外，能自我复制，质粒也携带许多基因，如：抗生素抗性基因3、大肠杆菌的酶类细胞中含有核酸代谢所需的酶类，除了DNA聚合酶（DNA polymerase）、RNA聚合酶（RNA polymerase），还有多种限制性内切酶（restriction endonuclease）限制性内切酶是分子生物学实验操作中最基本的工具酶，在DNA测序、片段分离、克隆DNA的环节都要用到二、病毒基因组的特点1．每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA；2．病毒核酸大小差别很大，3X103一3X106bp；3．除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。

4．大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成．5．真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子．6．有重叠基因2、λ噬菌体* 双链DNA，长度48Kb，其DNA分子有三种存在形式a、两个粘性末端分离的线性分子COS位点(cohesive-end site)b、带有切刻的环状分子（开环的粘性末端互补后未连接的c、闭合环状分子（粘性末端互补，DNA连接酶连接）* 其基因均是按功能相近的聚集成簇的（两个正调节基因N和Q除外）其基因的组织形式，除两个正调节基因N和Q之外，均是按功能相近的聚集成簇的。

λ噬菌体的7个头部基因A~F占有相互邻接的位置，调控基因N、CI、CII、CIII、Cro也集中在一个区域。

此外，结构基因与它们所编码的蛋白质所作用的部位也在邻接的部位，例如整合基因int和切离基因xis处在附着点att的旁边；复制基因O和P处在复制起始点旁边。

* 存在形式在寄主体内有溶源生长周期（原噬菌体）和溶菌生长周期两种生活途径第四节真核生物的染色体与基因一、真核生物染色体结构回顾二、真核生物DNA的复性动力学(重新结合动力学Reassociation kinetics）●真核生物复性动力学研究真核生物基因组大小的范围产生了一个重要问题：是否较大的基因组含有较多的基因，或者只是含有与较小基因组相同的基因但更多的拷贝呢。

如果基因种类随基因组大小增长而增长，我们应该可以期望基因组中独特DNA序列将增长。

而如果只是简单拥有更多拷贝，这种事情将不会发生。

真核基因组的普遍性质可以通过变性DNA重组动力学去获得。

互补序列的重组是依靠碱基配对的原则发生的，是使双链分开的变性过程的反过程。

这种技术可以被拓展到利用它们与特殊探针杂交的能力分离单个DNA或RNA。

重组反应动力学反映出了各种不同序列的存在。

因此这个反应可以被用来将基因以及它们的RNA产物定量化。

●复性动力学的研究方法一般我们可以通过以下两种方法检测在复性反应中单链已经合成双链:（1）减色效应（hyp0ochromic effect）和增色效应相反，由于双链逐渐增多，对260nm的紫外线吸收会相应减弱。

因此测定光密度，即OD值（optical density）即可。

DNA从单链变成双链，OD减少30%。

（2）羟基磷灰石层析羟基磷灰石的特点是对双链DNA吸附较牢，不宜吸附单链，我们将样品过柱，然后用不同浓度的缓冲夜洗脱，就可以收集单链和双链DNA，计算相的浓度。

●C0t曲线DNA复性依赖于互补链的自由碰撞，并且符合二级动力学方程。

单链消失的速度可用下面公式表示：-dC/dt=kC2其中C为单链DNA的浓度，单位是每开的核苷酸摩尔数；t是时间，单位为秒；k 是二级反应常数，单位是升／mol秒，k值取决于阳离子浓度、温度，片断大小和DNA 分子序列的复杂性(sequence complexity of the DNA population )。

上面公式可以重排为-dC/C2=kdt。

当t＝0时，C＝C0，将上式积分：-〔1/C0-1/C＝kt，即1/C-1/C0＝kt，可重排成C/C0 =1/(1+kCot)。

在上式中，当t=0时，C＝C0，表明所有的DNA都是单链。

C0为DNA的总浓度。

复性的分数C／C0是起始浓度和经过时间的乘积Cot的函数，这样的函数可以绘成下面的左图，称为Cot曲线。

当C/ C0=1/2时的Cot值定义为Cot1/2,因此Cot1/2=1/k。

任何DNA的反应可以用其半复性条件表示。

即C0×t1/2之乘积，称为Cot1/2。

Cot1/2等于浓度与达到最大数度一半所需时间之积，与速率成反比，Cot1/2增大意味着反应速度变慢的。

Cot1/2代表了基因组的大小和DNA顺序的复杂程度。

在一个指定的实验里，C0是已知的，C可以测定，如以C/C0对C0t作图，可得如图所示的曲线。

在曲线的中点，即C/C0=1/2时，C0t=1/K。