RT-PCR实验步骤
RT-PCR步骤
RT-PCR实验步骤佚名一、组织抽提：1.取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2.移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆3.移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打4.冰上孵育5分钟5.离心12,000g 4℃ 5分钟取上清液移入1.5ml新离心管6.加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7.离心<12,000g 4℃ 10分钟取上层液相移入1.5ml新离心管8.加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9.离心<12,000g 4℃ 5分钟弃去上清液10.加入1 ml 75%乙醇，震荡11.离心<7,500g 4℃ 5分钟弃去上清液12.室温下使之变透明13.加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：约20分钟1.65℃ 15分钟2.立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时1.37℃ 1.5小时2.94℃ 5-10分钟3.反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：约4.5小时1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环2.94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步30个循环3.72℃ 10分钟4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环2.94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步40个循环3.72℃ 10分钟4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳四、电泳：约1.25小时1.配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml2.胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶）3.微波炉中火2分钟溶解胶4.冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）5.放入梳子，浇板，待凝固6.加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰7.电泳50-80V（每㎝ 5V）。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
RT-PCR的具体步骤
RT-PCR的具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常见的分子生物学技术，用于检测RNA分子。
在本文中，我们将介绍RT-PCR的具体步骤，以便您更加全面地了解这种技术。
1.总RNA提取首先需要从细胞中提取RNA。
这可以通过商用试剂盒或手工方法实现。
如果使用试剂盒，则遵循其说明书中的步骤。
如果手工提取RNA，则需要使用三个基本试剂：细胞裂解缓冲液、氯仿和异丙醇。
步骤如下：•将细胞收集在管中，加入裂解缓冲液。
•冷冻-解冻样品3次，使细胞壁破裂并释放RNA。
•加入氯仿并混合。
•离心样品，使沉淀分离出来。
•将上层溶液转移到另一个管中，加入异丙醇。
•冷藏或冷冻，然后离心。
•去除上层液体，并在无水酒精中对RNA进行洗涤和沉淀。
2.反转录在提取出RNA后，需要将其转录为DNA，即逆转录。
这可以通过使用反转录酶（RT）实现。
在反转录步骤中，会加入反转录引物和其他试剂来增强逆转录效果。
这些引物是由需要扩增的RNA序列的反向互补核酸序列构成的。
这些步骤如下：•将RNA加入反转录反应混合物中，该混合物包含反转录酶、引物和其他必要试剂。
•反转录混合物通常通过加热来促进逆转录引物结合到RNA模板上，并形成RNA-DNA杂交链。
随后，反转录酶在杂交链上寻找RNA模板，并通过降低杂交链的熔点来将反转录引物延伸为cDNA链。
3.PCR扩增完成逆转录后，需要进行PCR扩增以增加cDNA的数量。
PCR是一种将 DNA 扩增到数以百万计的技术，能够扩增非常小的DNA模板。
PCR的步骤如下：•在PCR反应混合物中加入适当的引物和其他必要试剂。
•该反应混合物包括DNA聚合酶、模板DNA、引物和核苷酸。
•反应混合物被放入PCR机器中，按照特定的程序进行加热和冷却，使DNA链复制为两条新的DNA链。
•扩增程度由PCR反应的周期数决定。
4.分析最后，将扩增的DNA分离并分析它们的大小、类型和量。
这可以通过游离电泳或毛细管电泳等技术实现。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RTPCR实验步骤
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random9mers；b：OligodT-AdaptorPrimer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b 方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
RT-PCR操作步骤
RT-PCR步骤
一、总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃冰箱冻存
三、PCR反应
混匀快速离心一次
反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
RT-PCR步骤
RT-PCR实验步骤1、引物设计2、 RNA提取1) 离心管中，取150ul的淋巴细胞，加入1ml Trizol试剂2) 静置5分钟或马上-70℃保存3) 12000 rpm 离心15分钟,分相为三层，取上清液至新管4) 加入200ul氯仿，振荡混均30秒5) 室温静置3-5分钟分层6) 12000rpm离心15分钟，取上清液至新管，中间层和红色下层4℃保存，便于提取DNA 和蛋白质7) 上清液加入约的异丙醇（预冷）,振荡混均30秒，室温下静置15分钟8) 12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉淀管底。
9) 如沉淀不明显，则再离心数秒吸出上清10) 加入1ml 75%乙醇（预冷），温和震荡悬浮沉淀11) 8000 rpm离心5 min,弃上清12) 短暂快速离心（5秒），吸弃上清13) 室温放置2分钟晾干14) 沉淀加入15ul DEPC处理水，轻弹管壁溶解15) 少量样品55-60℃孵育10～15分钟16) 测量OD A260/A280值后，样品放置－70℃保存。
(保存时间不应超过一星期)3、反转录用琼脂糖电泳抽样检测RNA的纯度，如果杂质较多，则需要加DNA酶进行去杂。
然后在进行反转录步骤（购买反转录试剂盒）。
反转录步骤初步定为：1）离心管加入1μl总RNA，1μl随机引物oligo(dt），10μlDEPC处理水。
2）混匀，瞬时离心5秒。
3）70℃水浴5min。
4）迅速冰浴2min。
5）瞬时离心，加入4 ul 5× Buffer, 2 ul DTT, 2 ul 10Mm dNTPs。
6）混匀，温浴2min。
7）加入1 ul 反转录酶，42℃温育50min。
8）70℃孵育10min灭活。
9）-70℃冰箱。
4、 PCR条件优化为了寻求PCR最适DNA模版浓度和引物浓度，采用交叉法分别对模版和引物进行梯度稀释，交叉进行PCR反映，确定最佳浓度搭配。
(1) 反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10μl PCR Forward Primer μlPCR Reverse Primer μl ROX Reference Dye μlDNA模板μl dH2O μlTotal 20μl(2) 反应条件Stage 1：预变性 Reps：195℃，30sStage 2：PCR反应 Reps：4095℃ 5s 60℃ 30s(3) 2块96孔板反应最佳条件，即模板（cDNA）浓度和不同目的基因引物浓度a：DNA模版浓度（稀释倍数）b：特异性引物浓度c：不同基因A、B、C、D：DNA模版浓度梯度A1、A2、。
rt pcr实验报告
rt pcr实验报告RT-PCR实验报告引言：RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量RNA的表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR方法分析目标基因在不同组织和条件下的表达情况，从而深入了解其功能和调控机制。
材料与方法：1. 细胞或组织样本：选择不同类型的细胞或组织样本，如肝脏、肺、肌肉等。
2. RNA提取试剂盒：使用RNA提取试剂盒提取样本中的总RNA。
3. 逆转录试剂盒：使用逆转录试剂盒将RNA转录为cDNA。
4. PCR试剂盒：使用PCR试剂盒进行聚合酶链式反应。
5. 热循环仪：使用热循环仪进行PCR反应。
实验步骤：1. 样本处理：将细胞或组织样本收集并保存在合适的条件下，以保持RNA的完整性。
2. RNA提取：按照RNA提取试剂盒的说明书进行操作，提取样本中的总RNA。
3. RNA浓度和纯度检测：使用紫外-可见光分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保提取到高质量的RNA。
4. 逆转录反应：按照逆转录试剂盒的说明书进行操作，将RNA转录为cDNA。
5. PCR反应：按照PCR试剂盒的说明书进行操作，设置合适的引物和反应条件，进行PCR反应。
6. 凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
7. 凝胶图像分析：使用凝胶图像分析软件测量PCR产物的带的强度，并进行定量分析。
结果与讨论：通过RT-PCR实验，我们成功地分析了目标基因在不同组织和条件下的表达情况。
以下是实验结果的一些典型示例：1. 基因在不同组织中的表达差异：我们选择了肝脏、肺和肌肉作为研究对象，分别提取了这些组织中的总RNA，并进行了RT-PCR分析。
结果显示，目标基因在肝脏中的表达水平最高，肺次之，肌肉最低。
这表明目标基因在不同组织中的表达存在差异，可能与其功能和组织特异性有关。
2. 基因在不同条件下的表达调控：我们进一步研究了目标基因在不同条件下的表达调控。
RTPCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
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(1)RNA提取
1、取出新鲜肝组织，放在液氮中冻存备用。
2、取匀浆器，加入lml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
3、取100mg新鲜肝组织，加入到匀浆器中。
4、充分研磨直至无可见组织块，转移到1.5ml EP管中。
(2)两相分离
每lml的Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4C下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的Trizol Reagent试剂的60％。
(3)RNA沉淀
将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
(4)RNA清洗
移去上清液，每lml Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入至少lml的75％乙醇(75％乙醇用DEPC H2O配制)，清洗RNA沉淀。
混匀后，4C下7000rpm离心5分钟。
(5)RNA干燥
小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
(6)溶解RNA沉淀
溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40u1用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。
(7)测定RNA的质量
1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定：
A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。
样品RNA浓度(ug/m1)计算公式为：A260×稀释倍数×40 ug／ml。
具体计算如下：
RNA溶于4u1 DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260=0.21
RNA浓度=0.21×100×40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul取5ul用来测量以后，剩余样品RNA 为35u1，剩余RNA总量为：35u1×0.84 ug/ul=29.4 ug
②纯度测定：
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C，灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25u1溶液。
胶凝后将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18m1的37％甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液0.4M MOPS，pH 7.0；0.1M 乙酸钠；0.01M EDTA
②准备RNA样品
取3ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10ug/ml。
加热至70C孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。
5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5s核糖体RNA)组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
用数码照相机拍下电泳结果。
(8)反转录(枪头和PCR管均经过湿热灭菌，无RNA酶)
1)取一PCR管，加入含2ug RNA的溶液。
2)加入1u1 oligo(dT)15。
3)用无核糖核酸酶的去离子水补足至12u1。
4)于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。
5)依次加入4u1 5×buffer，2u1 10mM dNTPs，1u1 RNA inhibitor和1ul反转录酶，用枪抽吸混匀。
6)于PCR仪上42C保温30min，结束后80C保温5min灭活反转录酶。
定量PCR
1)取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
2×qPCR Mix 12.5ul
2.5 uM基因引物 2.0u1
反转录产物 2.0 u1
ddH20 8.5u1
2)取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
2×qPCR Mix 12.5u1
2.5uM内标引物2.0u1
反转录产物 2.0u1
ddH20 8.5u1
3)PCR扩增
预变性 95℃，lmin 循环(40次)
95℃-15s；58℃-20s；72℃-20s
末段延伸 72℃ 5min
溶解曲线 72℃-95℃，每20s升温1℃
3．数据处理
△△CT法：
A=CT(目的基因，实验样本)一CT(内标基因，实验样本)
B=CT(目的基因，对照样本)一CT(内标基因，对照样本)
K=A-B 表达倍数=2-K。