菌种保藏 真空冷冻干燥法 操作步骤
菌种冻干操作规程
菌种冻干操作规程菌种冻干是一种将活菌种通过冷冻和真空干燥的方法，将其转化为冻干菌粉的过程。
菌种冻干技术广泛应用于微生物学、制药业、食品工业等领域。
下面是菌种冻干的操作规程，详细描述了操作过程和注意事项。
一、准备工作1. 确认菌种冻干设备状态正常，例如冷冻系统、真空泵等。
2. 准备菌种培养物、冻干粉剂、无菌容器等相关物品。
3. 清洗工作区、操作台和工具，并进行消毒处理。
二、菌种培养1. 取出菌种培养物，将其接种到含有培养基的培养皿中。
2. 在恒温摇床上进行培养，温度、时间和培养方式需要根据不同菌种而定。
3. 筛选出生长良好、纯度高的菌种，进行后续处理。
三、制备冻干粉剂1. 预先准备好冻干粉剂，根据菌种特性选择合适的添加剂和保护剂。
2. 按照比例将冻干粉剂溶解于适量的培养基中，充分混合并进行无菌过滤。
四、菌种冷冻1. 将培养物转移到冷冻管中，添加适量的冷冻保护剂。
2. 快速冷冻，推荐使用液氮浸泡法或酒精浴法。
3. 将冷冻菌种存放在低温冷冻机中，温度通常为-70℃至-196℃。
五、菌种真空干燥1. 将冷冻菌种转移到真空干燥设备中，调整设备到合适的温度和压力。
2. 打开真空泵，排除设备内的气体，并在适当温度下加热样品。
3. 维持一定的真空度和温度，直至样品完全干燥。
六、收集和包装冻干菌粉1. 将干燥的菌种收集到无菌容器中，注意避免污染。
2. 对冻干菌粉进行密封和标记，包括菌种名称、生产日期和效期等信息。
3. 存放在干燥、阴凉、无菌的环境中，防止湿气和光照。
七、清洁和保养1. 完成操作后，及时清洗和消毒工作区、设备和工具。
2. 定期检查和保养设备，确保其正常运行。
八、安全注意事项1. 在操作过程中，必须佩戴防护手套、防护眼镜等个人防护用具。
2. 注意避免菌种与人体直接接触，容易引起感染。
3. 操作时要轻拿轻放，避免对菌种造成机械伤害。
4. 注意电源和设备的安全使用，防止触电或设备故障引起事故。
以上是菌种冻干的操作规程，通过正确的操作步骤和注意事项，可以确保菌种冻干过程的安全和有效。
菌种冻干操作规程
菌种冻干操作规程
《菌种冻干操作规程》
一、冻干操作前准备
1. 准备工作台、传染性物质隔离柜等操作设备，保持洁净。
2. 取出所需的冻干管和培养基，确保其完整和干燥。
3. 消毒操作台面、设备和工具。
二、冻干操作步骤
1. 将需要冻干的菌种培养液倒入冻干管内，每支管液面高度不超过管壁的一半。
2. 在管盖上打蜡封，确保密封性。
3. 将密封的冻干管放入冻干机内，设置适当的温度和压力。
4. 开启冻干机，开始冻干操作。
三、冻干后处理
1. 冻干结束后，关闭冻干机，取出冻干管。
2. 在无菌条件下，将密封蜡封刮除。
3. 将冻干管存放在低温冰箱内保存。
4. 记录冻干操作的日期、菌种信息等相关信息。
四、冻干操作注意事项
1. 操作过程中要保持无菌操作，避免外源污染。
2. 注意操作台面和工具的消毒，确保操作环境清洁。
3. 冻干机的设置和操作要符合菌种所需的温度和时间条件。
4. 冻干管的密封要确保严密，避免冻干过程中的氧化。
5. 冻干操作结束后，要及时记录菌种信息，方便后续的使用和
管理。
以上就是关于《菌种冻干操作规程》的操作步骤和注意事项，希望对相关工作人员能有所帮助，确保菌种冻干操作的顺利进行。
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
冷冻真空干燥保藏法的原理
冷冻真空干燥保藏法的原理
冷冻真空干燥保藏法，又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法，是一种常用的微生物保藏方法。
其原理是在低温下快速将含菌样品冻结，然后在减压条件下抽真空，使水分子直接从固态升华到气态，从而实现对样品的干燥保藏。
具体操作过程如下：首先，将需要保藏的菌悬液或孢子悬液制备成适当的浓度，并添加适量的保护剂以提高菌种稳定性。
接着，将样品装入安瓿管中，并在低温下快速将含菌样品冻结。
然后，将安瓿管置于真空干燥设备中，在减压条件下进行抽真空处理。
由于水分子直接从固态升华到气态，无需经过液态，因此可以有效地避免菌种在干燥过程中的损伤。
最后，将干燥后的菌种管放置在4℃或-20℃的低温环境中保存。
冷冻真空干燥保藏法的优点在于能够有效地保存菌种，且保存时间较长，一般可达到几年或几十年。
此外，该方法还具有较高的保藏效果，菌种在复苏后仍具有较高的活力和生长能力。
因此，冷冻真空干燥保藏法被广泛应用于微生物学、生物制品和医药研究领域。
冷冻干燥法保存菌株
1.制备无菌瓶。
药用青霉素小瓶先用2%盐酸浸泡8-10h，再用自来水冲洗多次，最后用蒸馏水洗2次，烘干。
贴标签，盖塞并用容器封口膜覆盖扎紧，高压蒸汽灭菌。
2.制备无菌脱脂牛奶。
配制20%脱脂乳115℃15min。
3.制备菌悬液。
在培养好的新鲜菌种斜面上，加入无菌水3ml，用接种环刮下，轻轻搅动，制成细胞分散均匀的菌悬液（不要刮破培养基）。
4.分装。
用无菌移液管将菌悬液分装与灭菌青霉素小瓶中，每瓶装0.2ml，再用无菌长滴管将灭菌脱脂乳0.2ml加入上述小瓶中，稍振摇使之混匀。
5.预冻。
将上述小瓶放入500ml干燥瓶中，放入-80℃的冰箱中预冻0.5h，待小瓶中菌悬液冻结成固体后取出；
6.冷冻真空干燥。
迅速将干燥瓶插在冷冻干燥器的抽真空管上，迅速抽真空，并冷冻干燥，约24-36h，待菌体混合物呈疏松态，稍一振动即脱离瓶壁方可取出。
7.封存。
在无菌室内将容器封口膜取下，迅速换以无菌橡皮塞，最后用封口膜将瓶口封住，-20℃低温冰箱保存。
经过试验，10%和20%的脱脂牛奶都可以。
严格厌氧菌菌种保藏方法
严格厌氧菌菌种保藏方法1.冷冻保存：将培养基中的菌体经过初步清洁处理，如去除杂质和溶液，然后将其转移到冷冻保藏管中。
添加一定量的保护剂，如甘油、DMSO等，以提高菌体的存活率。
将管子迅速置于液氮罐或-80°C冰箱中保存。
这种方法广泛适用于大多数严格厌氧菌，并且可以长期保存。
2.干燥保存：将培养基中的菌体在无菌条件下晾干，然后将其转移到无菌干燥保存球或干燥管中。
这种方法主要适用于一些特殊的严格厌氧菌，如拟杆菌等。
由于干燥后的菌体处于休眠状态，因此其长期保存能力相对较高。
3.真空保藏：将培养基中的菌体经过初步清洁处理后，将其转移到真空保存管中。
用真空泵抽除管中的氧气，然后密封保存。
这种方法能够有效地减少氧气的存在，从而延缓菌体的代谢活动，增加保存时间。
4.冷冻干燥保存：将培养基中的菌体进行冷冻保存后，再进行冻干处理。
将菌体在真空条件下冻干，并转移到无菌干燥保存管中。
这种方法可以同时减少菌体的新陈代谢和水分含量，从而增加保存时间和稳定性。
5.液氮保存：将培养基中的菌体直接转移到液氮罐中保存。
液氮的低温可以有效地抑制菌体的代谢活动，从而保持菌体的长期稳定性。
这种方法适用于一些特别敏感的严格厌氧菌，但操作和管理也相对较为困难。
无论采用何种方法，都需要进行严格的无菌操作，以避免杂菌或其他污染物的引入。
同时，保存前需要对菌株进行彻底的鉴定和鉴定，以确保保存的菌株的纯度和可重复性。
此外，为了保证菌株的质量和安全性，菌株应定期复苏和传代，以确保其细胞活力和生物学特性的稳定性。
在保存过程中，还可以定期检测菌株的活力和污染情况，以及监测保存条件的稳定性和有效性。
总结起来，严格厌氧菌菌种的保藏方法应考虑到细胞的生物学特性和菌种的要求。
选择合适的保存方法，正确操作和管理，并定期检测和验证保存条件和菌株的稳定性，将有助于确保菌种的可持续性和研究的可靠性。
严格厌氧菌菌种保藏方法
严格厌氧菌菌种保藏方法以下为本实验严格厌氧细菌的保藏方法，如果是兼性厌氧菌可参照好氧菌保藏方法保藏。
一、厌氧细菌的甘油保藏方法：1、厌氧甘油的制备：厌氧瓶或厌氧管中放置一定量的甘油，甘油的量根据需要加入，不要多加，因为厌氧甘油制备好以后不能反复灭菌，反复灭菌甘油会变性而呈黄色，且有一股芳香味道。
加入终浓度为0.04%的L-cysteine和1%的5%的N2S母液。
往厌氧瓶中通N2，通气时间和配制培养基时时间相同。
盖上塞子和盖子。
121℃，20min灭菌后备用。
2、取新鲜菌液（对数期），在通N2的情况下，用针筒和针头往有菌液的厌氧管中加入终浓度为15-20 %的厌氧甘油，再通一会N2，目的是赶走在转移甘油过程中带进去的O2。
盖上塞子和盖子，混匀，冻于-80℃。
3、活化：用针头和针头吸取一定甘油保藏的菌液，加到培养基当中，加的量一般要多于1%，因为厌氧菌的生物量比较小，一般2到5%左右。
目测加完甘油菌液的培养基是否浑浊，并作记录。
如果加入的菌液太多，造成一开始培养基就比较浑浊，会干扰我们对菌是否生长的判断，而且甘油太多也会抑制菌的生长。
二、厌氧细菌的冷冻干燥保藏方法：1、厌氧牛奶的制备：先配置10% Difco Skim Milk（BD）的母液。
和厌氧甘油配制方法一样，转移到厌氧瓶中，加入加入终浓度为0.04%的L-cysteine和1%的5%的N2S母液。
通N2，盖上塞子和盖子。
113℃，15min灭菌后放置过夜，于4℃放置备用。
放置过夜后牛奶不结块，溶液均匀，不沉淀才可以用，否则牛奶变性，需要重新配制。
同样，厌氧牛奶只能灭菌一次，反复灭菌牛奶会变性。
2、准备冷冻干燥用的安瓿管，管口要用棉花封住，棉花缠在牙签上，这样拔出比较方便，灭菌并烘干后备用。
3、新鲜菌液离心，尽量除去上清，根据菌量加入10%的厌氧牛奶，一般大拇指盖大小的菌体能做15-20支安瓿管左右。
将菌体打散后，迅速分装到安瓿管中，每支安瓿管0.2ml，并用棉花封住管口，防止杂菌污染。
微生物菌种保藏管理中心操作指南
微生物菌种保藏管理中心操作指南保藏方法冷冻干燥法、-80℃冻结法、液氮超低温冻结法。
冷冻干燥保藏法将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
操作步骤如下：好氧菌冷冻干燥管的制备1 安瓿管准备安瓿管材料以中性玻璃为宜。
清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2 保护剂的选择和准备保护剂种类要根据微生物类别选择。
配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。
如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。
3 冻干样品的准备在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。
微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。
采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。
若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。
分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。
分装时应注意在无菌条件下操作。
4 预冻一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。
5 冷冻干燥采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。
6 真空封口及真空检验将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。
熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。
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真空冷冻干燥法保藏菌种操作步骤
操作过程
1、安瓿管准备
选取规格约直径为8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好脱脂棉塞，121℃下高压灭菌20分钟，备用。
2保护剂的选择和准备
选取新鲜牛奶作为保护剂，牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂， 115℃下高压蒸汽灭菌25min，备用。
3冻干样品的准备
(3)菌种准备及分装
菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。
每支长好的斜面加2～3ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。
如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。
悬液中菌数要求达到108～1010个/ml为宜。
悬液制备完成尽快分装和冻结。
分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，每管分装量约～毫升，分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。
分装时应注意在无菌条件下操作。
4预冻
-80℃冰箱预冻1～2小时。
5冷冻干燥
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。
终止干燥时间应根据下列情况判断：①安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；②真空度接近空载时的最高值；③选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结。
6真空封口
将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封。
7保藏
安瓿管保藏在-20℃冰箱里。
8活化
如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，用镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端，使管子破裂，在安瓿管中加入～1ml液体培养基，慢慢旋转安瓿管，是冻干菌种复水，然后直接接种到琼脂斜面或涂布平板。