表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

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Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因的原核表达与多抗的制备

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因的原核表达与多抗的制备王安平;朱善元;王永娟;吴双;左伟勇;洪伟鸣【摘要】根据Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ) SH株VP0基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,克隆入原核表达栽体pET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下重组蛋白获得了成功表达.SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为48 kD,Western-blotting 分析表明该蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应.将目的蛋白切胶纯化后免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析证明制备的抗血清能够与DHAV-Ⅰ感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应.以上结果表明,VP0基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP0蛋白的检测.【期刊名称】《河南农业大学学报》【年(卷),期】2015(049)005【总页数】4页(P658-661)【关键词】Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒;VP0基因;原核表达;多抗【作者】王安平;朱善元;王永娟;吴双;左伟勇;洪伟鸣【作者单位】江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,江苏泰州225300;江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,江苏泰州225300;江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,江苏泰州225300;江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,江苏泰州225300;江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,江苏泰州225300;江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,江苏泰州225300【正文语种】中文【中图分类】S834鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus，DHAV)属于小RNA病毒科禽肝炎病毒属鸭甲型肝炎病毒种，临床上主要引起21日龄以下的雏鸭发生急性肝炎，病死率高达100%，是一种急性高度致死性传染病，是严重危害养鸭业的疫病之一［1-2］。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及间接ELISA方法的建立的开题报告

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及间接ELISA方法的建立的开题报告
题目：Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及间接ELISA方法的建立
研究背景：
Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHBV）是一种引起鸭肝炎的病原体，也是动物病毒的重要代表之一。

DHBV感染鸭子时会导致严重的肝损伤以及肝癌等疾病，给养殖业、动物保健等领域造成了很大的损失和威胁。

因此，研究DHBV感染机制和控制方法显得非常重要。

其中，VP1蛋白是DHBV中最重要的蛋白之一，也是抗原表位较多的蛋白之一。

因此，通过鉴定VP1蛋白中的优势抗原区，建立有效的间接ELISA方法，能够在DHBV感染的诊断和疫苗的开发中起到积极的作用。

研究内容：
1. 鉴定Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白中的优势抗原区
通过重组表达和纯化DHBV的VP1蛋白，采用Western Blot和ELISA技术，筛选出VP1蛋白中的优势抗原区。

2. 建立基于VP1蛋白的间接ELISA方法
根据VP1蛋白优势抗原区的序列，设计并合成对应的多肽抗原，制备间接ELISA试剂盒，对鸭子血清进行检测，建立鸭子DHBV感染的诊断方法。

预期成果：
本研究旨在鉴定Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区，并通过建立基于VP1蛋白的间接ELISA方法，实现对鸭子DHBV感染的快速诊断。

实验成功将为DHBV的研究和控制提供重要的理论和技术支持。

鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株VP1基因克隆、原核表达及抗原性分析

鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株VP1基因克隆、原核表达及抗原性分析向毅勇;罗薇;靳艳玲;刘内生;刘群;龙虎【摘要】应用巢氏PCR(nested-PCR)扩增出1型鸭肝炎病毒鸡胚化弱毒MY株结构蛋白VP1基因片段,将VP1克隆到pMD18-T载体上,测序结果为714bp,GenBank登录号:GU363950.对MY株VP1基因编码蛋白的主要抗原位点进行预测,aa208-aa222氨基酸区段表现很高的亲水性、抗原指数和表面可及性.VP1经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得重组质粒pET-VP1,转入BL21 PLyss(DE3)细胞中,IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果表明,在大肠杆菌中表达了1个相对分子质量为47 ku的融合蛋白.Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可与鸭肝炎标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)012【总页数】6页(P68-73)【关键词】鸭肝炎;原核表达;SDS-PAGE;Western blotting【作者】向毅勇;罗薇;靳艳玲;刘内生;刘群;龙虎【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;中国科学院成都生物研究所,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】Q781型鸭病毒性肝炎是由1型鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus 1,DHV 1)引起的雏鸭急性死亡的传染病,主要侵害4周龄内的雏鸭,死亡率高,是危害养鸭业最为严重的传染病之一(辛朝安,2003)。

DHV 1为小RNA病毒科成员(Cornelia,2005),病毒粒子呈球形或类球形,核衣壳20面体对称,无囊膜,胞浆内繁殖,具有不分节段的单股正链RNA(蔡宝祥,2001),病毒基因组只含1个开放阅读框,编码3种结构蛋白(VP1、VP0、VP3)和9种非结构蛋白(Tseng等,2007)。

鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验

鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验路娇;罗薇;刘内生;刘群【摘要】将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Yp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果.结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45；雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用.首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2012(048)001【总页数】4页(P6-9)【关键词】鸭肝炎;鸡胚化弱毒;Vp1重组蛋白;免疫保护【作者】路娇;罗薇;刘内生;刘群【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S858.32鸭病毒性肝炎是由鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）引起雏鸭的一种以肝脏呈现出血性炎症为特征的急性、高度接触性和致死性传染病。

该病呈世界性分布，我国以Ⅰ型鸭病毒性肝炎为主，严重危害了养鸭业的发展。

目前我国普遍采用接种鸭肝炎弱毒活疫苗或注射高免卵黄抗体的方式预防该病，虽有效果，但存在病毒株变异、弱毒株返强、免疫安全等问题。

因此，开拓疫苗研究的新领域是当前的热点问题。

Ⅰ型鸭甲肝病毒（DHAV-1）是小RNA病毒中的一员，其结构蛋白Vp1位于病毒壳体的表面，具有主要的型特异性抗原中和位点，已被证明具有良好的反应原性［1］，但其是否具有诱导机体产生中和抗体，使动物获得保护的能力还不得而知。

基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达

基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达皮晋魁;聂培婷;黄秋雪;岳华;张焕容【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2012(034)009【摘要】为原核表达基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C) VP1重组蛋白,本研究通过设计套式PCR引物,RT-PCR扩增DHAV-C VP1全基因,约为720 bp,将其亚克隆至pET-32a(+)载体中构建重组表达质粒pET-VP1.将其转化E.coli Rosetta (DE3)中,经IPTG诱导表达了约47 ku的重组蛋白.Western blot分析表明,该重组蛋白可以与兔抗DHAV-C阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性.%To express duck hepatitis A virus genotype C (DHAV-C) VP1 gene, Nested-PCR primers were designed to amplify VP1 gene from DHAV-C strain by RT-PCR and cloned into pET-32a(+) for expressing in E. coli recombinant VPlwas highly expressed at 8 hour under 1 mM IPTG induction. SDS-PAGE showed the relative molecular weight of the VP1 recombinant protein was about 47 ku, and western blot analysis showed that the VP1 recombinant protein reacted with rabbit anti DHAV-C.【总页数】3页(P740-742)【作者】皮晋魁;聂培婷;黄秋雪;岳华;张焕容【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;动物医学四川省高等学校重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;动物医学四川省高等学校重点实验室,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.鸭1型甲肝病毒亚型VP 3基因的克隆与原核表达 [J], 黄剑梅;黄瑜;傅秋玲;傅光华;万春和;陈翠腾;陈珍;程龙飞;施少华;陈红梅2.Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 顾玲玲;朱善元;成大荣;左伟勇;洪伟鸣;蔡树东;王安平3.基于基因C型鸭甲肝病毒VP1重组蛋白的鸭甲肝病毒抗体ELISA检测方法的建立 [J], 杨发龙;张焕容;程方明;岳华;汤承4.鸭甲肝病毒VP1基因的克隆和序列分析 [J], 彭小薇;徐永亮;王笑言;付余;张大丙5.基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 [J], 程方明;张焕容;洪杰;王远微;岳华;汤承因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鸭瘟病毒TK基因的研究与应用

鸭瘟病毒TK基因的研究与应用鸭瘟病毒(Duck Plague Virus,DPV)又称鸭肠炎病毒(Duck Enteritis Virus, DEV)，属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科，主要引起鸭、鹅、天鹅等雁形目成员的急性、败血性及高度致死性病毒性传染病［1］。

鸭瘟病毒为球形囊膜病毒，直径约为160-180nm，由核心(core)、衣壳(capsid)、外膜(tegument)、囊膜(envelope)四部分组成［2］。

鸭瘟病毒基因组较大，其中TK基因，即胸苷激酶(Thymidine Kinase,TK)基因，编码病毒的非结构蛋白--胸苷激酶，本文针对国内研究概况，对TK基因及蛋白的研究现状进行简述。

基因鸭瘟病毒基因组为双股DNA，约150kb，目前已有多株鸭瘟病毒完成了基因组测序，如强毒株CHv、鸡胚化弱毒疫苗株C-KCE及分离弱毒疫苗株V AC等。

整个基因组分为UL(unique long)和US(unique short)区，病毒的基因依次取名UL1，UL2，UL3等和US1，US2，US3等，其中TK基因位于UL23，因此TK基因又称UL23基因。

TK基因在不同病毒株的位置稍有不同，如在V AC株基因组的74481-75557位置，而在CHv株基因组77994-79070位置，全长1077bp，无内含子结构［3］。

将DPVTK基因与α、β和γ疱疹病毒的TK基因进行核苷酸序列相似性比较，发现DPV 与α疱疹病毒的相似性(36.8%)要高于β(26.8%)、γ疱疹病毒(29.6%)，其中与α疱疹病毒亚科的马立克氏病毒(Marek’s Disease Virus, MDV)(相似性36.3%)、鸡传染性喉气管炎病毒(Avian Infectious Laryngotracheitis Virus, ILTV)(相似性36.8%)及火鸡疱疹病毒(Herpevirus of turkey, HVT)(相似性40.6%)等禽类疱疹病毒的进化关系最近［4］。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆和表达

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆和表达吕敏娜;戚南山;覃宗华;廖申权;余劲术;袁建丰;吴彩艳;孙铭飞【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)002【摘要】通过RT-PCR方法克隆出GD株Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)的结构蛋白VP1基因片段,VP1基因片段和原核表达载体pMAL-C2X均以EcoR Ⅰ、HindⅢ双酶切后构建获得重组质粒pMAL-C2X-VP1,经限制性酶切和序列测序证明,目的基因正确插入表达载体,转入E.coli BL21(DE3),构建重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-VP1,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明,DHV-1的结构蛋白VP1能在E.coliBL21(DE3)中表达,获得可溶性重组蛋白,表达产物的分子质量约为69 ku.【总页数】4页(P13-16)【作者】吕敏娜;戚南山;覃宗华;廖申权;余劲术;袁建丰;吴彩艳;孙铭飞【作者单位】广东省农业科学院兽医研究所,广东广州510640;广东省农业科学院兽医研究所,广东广州510640;广州英赛特生物技术有限公司,广东广州510663;广东省农业科学院兽医研究所,广东广州510640;广东省农业科学院兽医研究所,广东广州510640;广东省农业科学院兽医研究所,广东广州510640;广东省农业科学院兽医研究所,广东广州510640;广东省农业科学院兽医研究所,广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6;S858.32【相关文献】1.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因重组鸭瘟病毒载体的构建 [J], 张婧;董嘉文;罗永文;郭霄峰2.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达 [J], 胡来根;廖俊伟;尹秀凤;刘大伟;毛火云;张小飞3.基因C型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备 [J], 赵立娜;崔言顺;任建亭;李建亮;黄兵;李玉峰;马秀丽4.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因克隆与序列分析 [J], 任邵娜;袁生;蒲文珺;彭巧丽;王辉;陈志伟;张浩吉;李国清5.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因克隆及其原核表达 [J], 孔留五;康艳梅;何逸民;李小康;潘全会;张桂红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

携带I型鸭肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒的构建

ＫｎＩ自Ｆｒｅｔｓ公司；Ｎｐ２购ｅｍｎａＤＡ胶回收试剂盒购
１．重组病毒的鉴定将重组病毒原始病毒．４２
液接种ＤＦ细胞盲传２，在荧光显微镜下进行Ｅ代
观察。ＥＤＦ细胞反复冻融３次，２００ｒｍｎ离心１０／ｉｉｉ，０ｍｎ收取上清液，照刘根梅等＿的方法，按ｌ ∞ 将
（ＢｕＳ－ＫＥＦ－Ｄ，此研究为研制鸭瘟一鸭肝炎二联苗奠定了基础。ｐｌｅＫＴ－ＧＰ３）
关键词：Ｉ型鸭肝炎病毒；鸭瘟病毒；３基因；重组Ｄ
中图分类号：￥５．８５３文献标识码：Ａ文章编号：１０ — ５７２１）１０３ — ３０５８６（０１Ｏ — ０２０
基，获得转移载体ｐｌｅＫＴ — ＧＰ；ＢｕＳ — ＫＥＦ）鸭瘟病毒弱
１．重组载体的构建以Ｋｎ１分别对鸭瘟．２２ｐ２
病毒ＴＫ基因缺失转移载体以及ｐＤ８３酶Ｍ１— Ｄ单切，收线性鸭瘟病毒Ｔ回Ｋ基因缺失转移载体（使
ｌｒｓｅｃｓｓｉｓｒｅｎｃｌｆｅｏｄｂｉａｓｇ．ｈｓｅｕｔｓｏｄｔｔｔｎｆｒｖｃｏｆｏｅｃｎｅｗａｔｌｂｅｖｄｉｅｌａｔｒｔｅｓｃｎｌｄｐｓａｅＴｅｅｒｓｌｈｗｅａａｓｅｅｔｒｕｌｏｓｅｈｎｓｈｒｐｕＳＴＫ－ＧＦ一Ｄａｅｎｃｎｔｃｅｕｃｓｆｌ．ｈｓｓｕｙｌｉｅｆｕｄｔｎｆｒｄｖｌｐｎｆａＢｌｅＫ— ＥＰ３ｈｄｂｅｏｓｒｔｄｓｃｅｓｙＴｉｔｄａｄｔｏｎａｉｏｅｅｏｍｅｔｏｕｕｌｈｏ

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Ｉ型鸭肝炎病毒）Ｐ基因，隆到质粒ｐＣ表达盒的多克隆位点Ｋｎ与Ｘａ之间，Ｖ１克ＴＬｐＩｂＩ构建含Ｌｃ及ＶＩ因的转ａＺＰ基移栽体质粒ｐ－ＬＶＩＴＣ－Ｐ。将此转移载体与鸭瘟病毒ＣＫＥ株共转染鸡胚成纤维细胞（Ｅ）经蓝斑克隆筛选和纯－Ｃ毒ＣＦ，化，了遗传性状稳定的表达Ｉ获得型鸭甲肝病毒Ｖ１因的重组鸭瘟病毒。Ｐ基关键词：甲肝病毒；鸭鸭瘟病毒；Ｋ基因；Ｐ基因；鸭瘟病毒ＴＶＩ重组中图分类号：８２６９０８Ｓ５．５：７文献标识码：文章编号：０５９４２１）６０２－１Ａ１０ — ４Ｘ（０００ — ０８４４
ｂａｓｏｉｅｔｎｗｉｅｔｉｔｎｅｚｍｅｎｅｓｒｄｎｔｄｌｏｅＴｙｍｅｎｆｄｇｓｉｔｒｓｃｏｎｙａｄｔｎｉｅｔｉｏｍｉｄｅｆｔＫｅｅｂｉｉｇｌｓｄｐＬ．ｉｇｏｈｒｉｈｎｅｈｇｎ，ｏｔｎｎｐａｍｉＴＣＵｓａｎｈｒｒｓｎｓｄａｃｒｉｇｔｔｙｅＩｄｃｅａｉｉｔｅｐｍｅｙｔｅｉｅｃｏｄｎｅｔｐｕｋｈｐｔｓｖｒｓＶＰｇｎｅｕｎｅｐｂｉｅｎｂｎ，ｔｅｉｓｈｚｏｈｉｔｕ１ｅｅｓｑｅｃｕｌｈｄｉＧｅｅａｋｈＶＰ１ｅｅｓｎｇｎＷａｍｐｉｅｒｍｅｐａｍｉ－ｓａｌｄｆｉｆｏｔｌｓｄＴＶＰ１ｓｅｌｔｄｃｏｅｎｏｂｔｅｅｔｅｐｌｃｏａｉｒｄＸｂｌｏｌｓｄｈａｔｍｐａｅａｌｎｄｉｔｅｗｅｎｔｏｙｌｎｌｓｅＫｐａａａｆｐａｍｉｎｈｈｔｎｐＣＬｔｕｏｔｉｉｇｔｅｐＣＬＶＰ１ｌｓｄｗｉＬｃａｄＴ，ｈｓｂａｎｈＴ－ｎｐａｍｉｔｈａＺｎＶＰ１ｅｅＴｅｏｓｕｔｄｔｎｆｒｖｃｏｗａｃｔｎｆｃｅｏｇｎ．ｈｃｎｔｃｅｒｓｅｅｔｒｒａｓｏｒｓｅｔｄｎａ
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摘要：扩增鸭瘟病毒（Ｐ）ＤＶ生长非必需区的ＴＫ基因，并在其中间引入ＢｌＩｇＩ酶切位点，再之克隆到ｐｔ９Ｕ１栽体，获得载体ｐＫＴ。用限制性内切酶从已有质粒ｐＤＡＬｃｃＮ — ａＺ上切下ＣＶ启动子、Ｍ多克隆位点、Ｖ０ＬｃＳ４及ａＺ的完整的基因表达盒，插入到ｐＫ的Ｔ基因中，ＴＫ获得质粒ｐＣ。ＴＬ用质粒ＴＶ１－Ｐ做模板，扩增出Ｉ型鸭甲肝病毒（以前称为血清
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一
２８一
中国动物检疫
２１００年第２７卷第６期
持人：胡藕祥ｚｄｊ＠ｉａｏｇｗｙｓ．ｍｎｃ
表达Ｉ型鸭甲肝病毒Ｖ基因的Ｐ１重组鸭瘟病毒的构建
张瀚元 ’ ，左青山李明义黄保续。，，（．１东北农业大学，黑龙江哈尔滨１０３；．００２青岛易邦生物工程有限公司，５山东青岛２６３；６０２３中国动物卫生与流行病学中心，．山东青岛２６３）６０２
ｈｎｃｏｅｏｐｔｅｌｎｄｉｔＵＣ１ｖｃｏｏｏｔｉＴｖｃｏ．Ａｃｏｄｇｔｈｅｔｃｏｎｏｕｅｅｅｏｎｚｄｉｓｉｅｖｃｏｎ９ｅｔｒｔｂａｎｐＫｅｔｒｃｒｉｏｔｅｒｓｒｔｎｅｄｎｌａｒｃｇｉｅｓｅｎｔｅｔｒｎｉｉｓｔｈ