淋巴细胞分离描述
淋巴细胞的分离
淋巴细胞的分离与活力检测
实验原理：
将血液组分与分离液一起离心时，不同比重的血液组分
会分布于相应密度梯度的分离液中，从而将血液各组分分 开，收集到淋巴细胞。 活性T淋巴细胞表面CD2分子可与绵羊红细胞（SRBC）表 面糖肽受体结合，形成玫瑰花环，计数总T细胞中玫瑰花环 数，可检测活性T细胞比例。
实验方法：
1. 小鼠摘眼球取血1 ml，滴入装有1 ml肝素的试管A内摇匀，
Hank’s液对倍稀释。
2. 保沿管壁流下的血液与分离液形成明显的界面。 3. 配平试管A、B，2５00 rpm离心15 min，小心取出。 4. 小心吸取B试管内中间区域的白色雾状薄层，移入试管C。
5. Hank’s液洗1-3次(加Hank’s液对倍稀释,2000 rpm离心10
min）。 6. 洗完后留下管底0.1ml液体，即为淋巴细胞悬液。
7. 加入0.1 ml SRBC，(37度孵育5 min)500 rpm离心5 min。
8. 小心吸去上清，留0.1 ml，轻轻吹匀，加0.8%戊二醛2滴固
定2-3 min。 9. 取1 滴涂片，晾干后加瑞氏染液1 ml，1 min左右，加等量 缓冲液，10 min左右，漂洗掉多余液体，擦干玻片周缘水 渍，镜检。
1. T细胞
2. SRBC
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。
淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。
具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。
2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。
3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。
4. 放入离心机，进行离心。
离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。
5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。
上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。
6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。
7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。
洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。
8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。
9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。
通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。
淋巴细胞培养方法
淋巴细胞培养方法引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，对于研究免疫学以及治疗免疫相关疾病具有重要意义。
淋巴细胞的培养是研究淋巴细胞功能和特性的关键步骤。
本文将介绍一种常用的淋巴细胞培养方法，以帮助读者了解淋巴细胞培养的基本原理和操作步骤。
一、材料准备1. 培养基：常用的淋巴细胞培养基包括RPMI 1640培养基、DMEM培养基等，可根据实验需要选择合适的培养基。
2. 补充物：培养基中常需添加胎牛血清(FBS)、人血清(HS)等，以提供细胞所需的营养和生长因子。
3. 抗生素：如青霉素、链霉素等，以防止细菌污染。
4. 受试者淋巴细胞：可以通过外周血或淋巴组织等方式获取。
二、淋巴细胞的分离1. 密度梯度离心法：将受试者淋巴细胞与离心管中的淋巴细胞分离液缓慢加入离心管中，离心分离液的密度逐渐由低到高，使淋巴细胞在不同密度的离心分离液之间分层离心。
离心后，淋巴细胞会沉积在特定密度的离心分离液上，可将淋巴细胞分离出来。
2. 磁珠分离法：利用表面标记有特定抗体的磁珠与淋巴细胞表面的特异抗原结合，通过磁场将目标淋巴细胞与其他细胞分离。
三、淋巴细胞的培养1. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪准确计算淋巴细胞的数量。
2. 细胞密度调整：根据实验需求，将细胞悬浮液中的淋巴细胞浓度调整至适当的浓度，通常为1-2 × 10^6个细胞/mL。
3. 培养基配制：根据实验需要，将培养基加热至37℃后，加入适量的补充物和抗生素，混匀均衡。
4. 细胞培养：将细胞悬浮液与预先配制好的培养基按照适当的比例混合，转移到细胞培养瓶或培养皿中。
5. 培养条件：将细胞培养瓶或培养皿置于37℃恒温培养箱中，设置适当的CO2浓度和湿度，通常为5% CO2和95%湿度。
定期观察细胞形态和生长情况。
6. 培养周期：根据实验需求，定期更换新鲜的培养基，一般为2-3天一次，以保证细胞的正常生长和代谢。
四、细胞活性检测1. 活细胞计数：使用染色剂如Trypan blue染色，观察染色细胞和未染色细胞的比例，以评估细胞的存活率。
淋巴细胞的分离技术
淋巴细胞的分离技术（一）材料与试剂1．淋巴细胞分层液有两种：（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。
应用时，用蒸馏水配制9％溶液。
泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。
含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。
应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。
1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：9％聚蔗糖液 24份33.9％泛影葡胺液 10份混合即可。
必要时，可测比重。
需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。
一般可保存3个月。
如要配制不同比例的分层液，可按下列公式计算：式中dm为分层液的比重，d1和d2分别为9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重，V1和V2分别为它们的体积。
如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液，则9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液34％泛影葡胺液 10份60％右旋糖酐液 12.5份混合，即为比重1.07～1.09的分层液。
分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。
2． 3％的明胶液称取明胶3g，溶于0.9％的灭菌生理盐水，终体积100ml，114.3℃高压灭菌10min，冷却后4℃冰箱保存，临用时37℃预热10min。
3．Hank’s液。
（二）操作方法1．取抗凝血，自然沉降，如是马属动物的血液，可直接直立试管架上，让其自然沉降1h，取上层血浆。
如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明胶液，混匀后让其自然沉降，1h后取上层血浆。
2．2 000r/min离心10min，弃上清。
淋巴细胞培养与分离
• 3、摇床培养 • 将接种后的培养瓶放于CO2培养箱中培养 ，条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。从 72h开始每48h添加等体积的新鲜培养液 。
注意事项
• 一、严格无菌操作 • 对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿 、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的 要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可 松懈。 • 二、血清的选择 • 淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生 产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血 清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且 更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计 更严密。血清浓度在5 %～20 %时细胞生长比较好,当 超过30 %时反而不利于细胞生长。
• 4、培养液 • RPMI1640培养基、培养用无机盐、胎牛血清 (FCS)、HEPES、肝素、淋巴细胞分离液、植物 凝集素(PHA)和白细胞介素等。 • 植物凝集素(PHA)是体外淋巴细胞培养成败的 关键，只有在PHA的作用下才能进入有丝分裂 ，因此要考虑它的质量和尝试，质量有问题药 效会降低，浓度过高可能会导致红细胞凝集， 都会造成实验效果差。
（四）、淋巴细胞亚群的分离
原理：根据相应细胞的特性和不同的 标志加以选择性纯化。 常用方法：
（1）E花环分离法 （2）尼龙纤维分离法 （3）流式细胞术 （4）磁珠分离术 （5）亲和板结合分离法
(1)E花环分离法
• 原理：人类T细胞表面上有能与绵羊红细 胞相结合的受体（E受体，CD2）,能与经 溴化二氨基异硫基异硫脲氰化物（AET） 处理的绵羊红细胞结合，形成稳定的、 细胞体积和比重较大的E花环。
检测与讯号处理系统
荧 光 激 活 细 胞 分 离 仪 分 离 法
细胞流动系统及气压流速控制系统
淋巴细胞分离实验
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离 原理 试剂和仪器 实验步骤 注意事项
原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
红细胞
1.093 1.092
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带 气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀 释不当，需重新制备细胞悬液、计数
淋巴细胞 单核细胞
外周血
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
1.075~1.090 1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀 释 外 周 血
稀释的血浆、 血小板
1500rpm, 20℃ , 30min
PBMC
Ficoll
Ficoll
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的 管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）
实验步骤
3.20℃，1500r/min，离心30min
4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入 另一试管中
实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min 离心10min ，弃上清 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min， 弃上清 7.适量的培养基重悬细胞 ，计数
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。
淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。
本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。
实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
注意避免气泡的产生。
2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。
离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。
3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。
轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。
此步骤的目的是去除红细胞和血浆。
4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。
注意避免两种液体混合。
离心管中的液体应该形成明显的两层。
5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。
离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。
6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。
加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。
7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。
8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。
同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。
结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。
在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。
淋巴细胞分离
用毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单 个核细胞，置于含5倍体积的Hanks液 的离心管中， 1000r/min离心10min；
用Hanks液重复洗涤一次， 1000r/min离心10min；
最后用Hanks液配成1×107个细胞/ml 浓度的细胞悬液。
要求 分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失活性，同时 也要求分离技术简单、操作方便。
细胞分离基本原理
➢不同细胞密度不同 ➢不同细胞表面生物学特性不同 ➢不同细胞表面分化抗原不同
一、白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞比例约为600~1000：1， 两者的比重不同其沉降速度也不同，通常用两种方法 加以分离。（直立静置RT30～60min，紧贴红细 胞层上的白膜层）
三、豚鼠淋巴细胞的分离
采血前的准备 用注射器取3 ml淋巴细胞分层液于一试管中. 再用注射器吸取２ml的阿氏液，并保存在注射 器中．
心脏采血 取血前应探明心脏搏动最强部位，通常在胸骨左 缘的正中，选心跳最显的部位作穿刺。针头宜稍 细长些，以免发生手术后穿刺孔出血。
取豚鼠抗凝血4毫升，加3毫升Hanks 液使之稀释。
（二）EA花环
B细胞表面带有IgG Fc段受体，AgAb复合物中IgG Fc 段牢固结合；这类红细胞抗体致敏的动物红细胞（EA)黏附在 B细胞周围形成花环。
（三）尼龙毛柱分离法
利用B细胞和单核细胞具有黏附在尼龙（nylon wool) 表面的特性。
先洗脱出的事T细胞，再用培养也便冲洗边捻 压塑料管，流出来的液体中主要含B细胞。T细胞 纯度达90%，B细胞纯度达80% 。
（3）阿氏液（Alsever液）：
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