酵母转化PEG LiAC法
酵母双杂交操作手册 by shenao
酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料:PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187pGBKT7 DNA-BD Vector (bait)pGADT7 AD Vector (prey)pGBKT7-53 Control VectorpGBKT7-Lam Control VectorpGADT7-T Control VectorpCL1 Control Vector3' DNA-BD & AD Sequencing PrimersHerring testes carrier DNAYeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a-gal(Yeast Phenotypes–––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the–or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients.Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow.+His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.+LacZ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for b-galactosidase activity.+Mel1 Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for a-galactosidase activity. MiscellaneousAde2p Protein encoded by the yeast ADE2 gene.3-AT 3-amino-1,2,4-triazole; a competitive inhibitor of the His3 protein.CHX CycloheximideDropout (supplement or solution); a mixture of specific amino acids and nucleosidesDO used to supplement SD base to make SD medium; DO solutions are missing one ormore of the nutrients required by untransformed yeast to grow on SD medium.His3p Protein encoded by the yeast HIS3gene.Minimal Synthetic Dropout medium; comprised of a nitrogen base, a carbon source SD medium (glucose or galactose), and a DO supplement.YPH Yeast Protocols HandbookSD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainPJ69-4A – + – + + –––––– + + ––– PJ69-4α1SD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainAH109 – + – + + –––––– + + ––– Y187Yeast selection Bacterial selection Fusion EpitopeCloning vectorspGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycinpGADT7 AD/library HA LEU2 ampicillin Control vectorspCL1 GAL4 LEU2 ampicillinpGADT7-T AD/T-antigen HA LEU2 ampicillin pGBKT7-53 DNA-BD/p53 c-Myc TRP1 kanamycin pGBKT7-Lam DNA-BD/lamin C c-Myc TRP1 kanamycin .缩写:Ade腺嘌呤(adenine) His组氨酸(histidine) Leu亮氨酸(leucine) Trp色氨酸(tryptophan)培养基成分及配制方法:YPD & SD Base from CLONTECH already contains a carbonsource(Dextrose(glucose))YPD: 20g/L Peptone, 10g/L Yeast extract, 2% Dextrose(20g/L), 20 g/L Agar (for plates only) 加入上述药品，加水至1L，调节PH值到6.5。
酵母单杂筛库方法
酵母单杂转化方法1）制备Y1HGold[Bait/AbAi]酵母感受态细胞；2）在一个无菌的15ml离心管中配置如下体系AD文库(2–5 µg)20ul Herring Testes Carrier DNA,denatured加600ul Y1HGold[Bait/AbAi]酵母感受态细胞；3）轻柔的漩涡混匀；4）加2.5ml PEG/LiAc；5）轻柔的漩涡混匀；6）30℃水浴温浴45min，每15min混匀一次；7）加160ul DMSO，42℃水浴温浴20min，每10min混匀一次；8）700×g 离心5min9）吸去上清，用3mlYPDA悬浮沉淀；10）30℃振荡培养90min；11）700×g 离心5min；12）弃去上清，用15ml无菌生理盐水悬浮沉淀；涂布于SD/-Leu/AbA平板上，每150ul涂布于一个150mm的平板上。
30℃倒置培养，直至克隆长出。
Y1HGold Chemically Competent Cell 产品说明书产品规格Y1HGold： 10×100μl 保存条件：-80℃pAbAi（control vector）：10ng/μl 10μl 保存条件： 4℃Carrier DNA： 5ug/μl 100 μl 保存条件： -20℃PEG/LiAc： 5 ml 保存条件： 4℃基因型MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met –, MEL1产品说明Y1HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母转化
酵母转化方法步骤1.YPD固体培养基Yeast Extract：10 g；Peptone：20 g；葡萄糖：20 g；Agar：20 g2.1M LiAcLiAc：10.2 g；加水到100 ml高压蒸汽灭菌，4℃保存。
100 mM的LiAc只需将1M LiAc稀释10倍即可。
3.50% PEG3350（50% W/V）4.鲑鱼精DNA（2 mg/ml）i.鲑鱼精DNA：2 mg；加TE缓冲液至10 mlii.振荡溶解后用注射器剧烈抽吸30-40次，沸水浴20分钟后马上置于冰上降温，分装100 μl到1.5ml离心管中-80℃保存。
5.SD-Trp培养基（1L, pH6.8）无氨基氮源（含硫胺酸）：6.7g；葡萄糖：20g；-Trp DO supplement：0.74g。
调节pH，121℃高压灭菌20分钟。
酵母热激转化1.将酵母XK1-35在YPD固体培养基划线活化，3-4天菌落长到直径大约2-3 mm待用（菌落平板可放在4℃冰箱保存2至3周）。
2.将单菌落挑到含有50 ml YPD的100 ml三角瓶中，30℃, 220 rpm摇12 h。
3.用分光光度计测量OD值到1.0（即5×107个/ml）,吸取5ml培养液加入到含有45 ml YPD的100 ml三角瓶中，终浓度约为5×106个/ml。
4.置于30℃摇床中，200rpm摇至OD值为0.4-0.6（即2-3×107个/ml），约用时3小时（2.5小时测一次OD值防止浓度摇过）。
5.将OD值为0.4-0.6的培养物转移到预冷的50ml的离心管中，置于冰上冷却15分钟，3000g离心5分钟。
后面用到的试剂和仪器都要预冷，所有操作都要在冰上或者4℃。
6.倒掉上清液，加入30 ml预冷的无菌水并将酵母悬浮，同上步离心。
7.倒掉上清液，将酵母悬浮于1 ml 100 mM的LiAc中并转移到一个预冷2 ml无菌离心管中。
一种筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法
一种筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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酵母转化
酵母转化（By HMM）1.取50mL YPD液体培养基于100mL已灭菌的三角锥形瓶中，从中吸取1mL培养基于已灭菌的1.5EP管，挑单克隆接种于1mL YPD培养基中，吹吸混匀（可再vortex继续混匀）后转移至50mL的YPD液体培养基中，过夜培养约11h45min；PS: 晚上21:15开始准备，21:30接种完毕开始摇菌。
（30℃ 250rpm）。
2.第二天早上9:15开始准备，取出1mL菌液用于测OD600，用1mL YPD培养基作为Blank. 9:30测完。
PS: a.要求OD600在0.5至0.6之间。
b.测完OD后打冰盒，将ssDNA置于冰上融化。
3.将菌液分装在2支50mL离心管（蓝色，无菌）中（锥形瓶留用），2500Xg常温离心5min.弃上清于之前的锥形瓶中，各用1mL灭菌ddH2O重悬转移至1.5EP管中，共水洗两次，再各用1mL 灭菌ddH2O重悬后转移至同一个5mL无菌EP管中，吹吸混匀置于冰上。
PS：a.离心期间将灭菌水置于65℃烘箱中预热，将所需平板置于30℃培养箱中预热。
b.为避免菌液浓度差异，故将重悬后的菌液混匀，因重悬后体积大于2mL，因此转移至5mLEP管中，也可在2mL EP管中混匀后分装出一部分在一个1.5EP管中。
4.待ssDNA溶化后根据所需量在1.5EP无菌管中分装几管，各100uL（有助于煮沸后迅速冷却）。
PS: a. ssDNA要尽量多出一些，煮沸和转移过程中均有损失。
b.看ssDNA快融化时即可打开水浴锅，中频煮沸（800即可），煮沸ssDNA时用最低频120.5.将ssDNA沸水浴5min, 然后迅速冰浴5min;PS：a.重复沸水浴5min与冰浴5min可提高转化效率。
b.冰浴ssDNA时将50％PEG与1M LiOAc也置于冰上。
6.在超净台中配制mix，vortex混匀。
Component Amount（for 5 transformation）50 % PEG 1.2 ml1 M LiOAc 180 µlSingle-stranded carrier DNA 125 µlPS: 50 % PEG特别粘稠，在分装时容易损失，因此配制mix时要注意量要足够。
酵母双杂交操作步骤
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母转化试剂盒使用说明书第二版
酵母转化试剂盒使用说明书（第二版）储存条件：Carrier DNA-20℃保存，其它组分可室温保存，有效期1年。
产品内容：Components SK2400-200PEG Solution50mlLiAc Solution50mlCarrier DNA2×1ml说明书1份酵母感受态细胞的制备：1.活化菌种。
-80℃保存的菌种在固体YPDA培养基（YPDA加20g Agar/L）上划线，在30℃培养2-4天。
2.挑取酵母单菌落在固体YPDA培养基上划3-5mm的短线，在30℃培养2-4天。
待酵母单菌落长至2mm长时，接种。
3.首先把酵母细胞接种到3ml液体YPDA培养基中，30℃过夜培养。
4.第二天转接到含有30ml液体YPDA培养基的三角瓶中继续培养，待OD600到0.4-0.5范围内。
收集细胞，1000g，离心5min,去上清。
5.沉淀用30-50ml的无菌的去离子水悬浮。
1000g，离心5min，去上清。
6.沉淀用合适体积的1/10浓度的LiAc悬浮（30ml的酵母菌最多用不超过1mL的1/10浓度的LiAc悬浮，通常100μl的酵母细胞用于转化一个质粒，即一个反应）。
1/10浓度的LiAc稀释方法：100μl LiAc Solution+900μl无菌水。
7.把酵母细胞的悬浮液分装到1.5ml的离心管中，每管分装100μl，用于转化一个质粒即一个反应。
1000g，离心5min，去上清。
制备好的感受态细胞备用。
酵母转化：1.配制预混液，每转化一个质粒即一个反应需要360μl的预混液。
PEG Solution240μlLiAc Solution36μlCarrier DNA10μl质粒（大约200ng/μl）5μl（根据质粒的浓度加入相应的体积）总体积360μl（不足体积用ddH2O补充）2.吸取360μl的预混液加入到感受态细胞中，用枪头反复吹吸沉淀，使离心管底的酵母细胞彻底地悬浮在含有PEG的预混液中。
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酵母转化
(一)原理：
我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。
PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。
本文使用的PEG分子量为3350,实验结果表明促转化效果可以达
到103～105cfu/μg。
PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,
减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。
PEG的
浓度是务必适宜,这一点很重要。
LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA。
鲑鱼精担体DNA为短的线形单链DNA,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。
在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA打开,保证鲑鱼精担体DNA
在转化实验体系中以单链形式存在
(二)材料、仪器设备及试剂：
1.SD培养基：
z YNB： 1.6g/L
z硫酸铵：5g/L
z氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加
z调节pH=5.8，121°灭菌15min
2.YPDA培养基
z胰蛋白胨20g/L
z酵母浸膏10g/L
z琼脂20g/L(固体)
z腺嘌呤15ml0.2%腺嘌呤/L
z调节pH=7.5，121°灭菌15min
3.0.9%NaCl（w/v）
z NaCl:0.9g
z milipore水定容到100ml
z灭菌121°，20min
4.100%DMSO
从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存
5.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA）
z Tris-HCl 1.211g/100ml
z EDTA0.37g/100ml
z调节pH=7.5,121°，20min
6.10×LiAc（pH=
7.5）
z1M LiAc10.202g/100ml
z用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min
7. 1.1×TE/LiAc
z Tris-HCl11ml10×LiAc（pH=7.5）/100ml
z EDTA11ml10×EDTA（pH=7.5）/100ml
z调节pH=7.5,121°，20min
8.50%PEG3350：
z PEG3350：50g
z已灭菌的milipore水：定容到100m
z（可用50°水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌）
9.PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中
终浓度10ml
PEG335040%8ml50%PEG3350
TE buffer1×1ml10×TE
LiAc1×1ml10×LiAc
10.变性的鲑鱼精DNA(10mg/ml)
ipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管
架，ep管架
(三)具体方法：
A：酵母感受态制备
1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30°培养3天左右。
2.从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行做3
管）
3.30°，250rpm，培养8-12h
4.取200ul菌液，测OD600
5.选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50m新鲜的YPDA
培养基中（培养基装在250ml三角瓶中）
6.30°，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.3
7.将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新
鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。
8.30°，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）
9.将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30ml
milipore水重悬。
10.再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.4ml1.1×TE/LiAc重悬。
11.将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s
12.弃上清，每管用600ul 1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。
B：酵母质粒转化
小规模转化大规模转化
1.加入质粒DNA100-500ng3-5ug
鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml)5ul20ul
加入感受态细胞,轻弹混匀50ul600ul
2.加入PEG/LiAc,轻弹混匀500ul 2.5ml
3.30°水浴，每10-15min轻弹混匀30min45min
4.加入DMSO,轻弹混匀20ul160ul
5.42°水浴，每5-10min轻弹混匀15min20min
6.离心，弃上清最大转速3000g
15s3min
7.用液体YPDA培养基重悬1ml3ml
8.30°，230rpm，培养90min90min
9.离心，弃上清最大转速3000g
15s3min
10.用0.9%NaCl重悬1ml15ml
11.涂板在相应的筛选培养基上。
(四)注意事项：
1.转化效率与很多因素有关，酵母活力是一个重要因素，一般制备酵母感受态的细胞必须
是没有经过4°保存的，活化过的，从培养箱中取出的新鲜酵母。
2.在制备酵母感受态时，不要超过上述的的OD值，要让酵母一直处在生长最旺盛的时期，
特别是最后一次培养，OD600的值不要超过0.5
3.酵母转化过程中，没有抗生素，极易染菌，所有实验都在超净台中进行，超净台需提前
一天用70%酒精棉擦拭，将第二天用到的物品（如，试剂，试管，架子等）都放入超净台，灭菌过夜，每次进入超净台操作时，需用70%酒精棉擦手消毒。
4.由于酵母生长周期较长，平板一般在培养箱中要放3天左右，所以在倒板时，不可吹得
太干，小板晾干10min左右，大板晾干15min左右即可
5.有些筛选培养基需要加入3-AT，必须是在培养基冷却到55°一下才可加入。