冰冻切片免疫组化染色步骤
切片、免疫组化步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。
也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗，5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
石蜡切片免疫组化染色步骤三步法（以SP试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。
冰冻切片免疫荧光染色步骤
冰冻切片免疫荧光染色步骤
冰冻切片免疫荧光染色步骤：
(1)冰冻切片取出，室
温放置使其干燥后，用冷丙酮于4C固定10分钟。
( 2)切片用
0.01MPBS清洗后加入
1.2%双氧水作用30 分钟，以除去非特异染色。
( 3)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。
( 4)
0.3%Triton X-100作用30 分钟。
(5)加入以抗体稀释液(含1%BSA勺
0.01M PBS，pH
7.4)稀释至工作浓度的一抗，4C过夜。
( 6)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。
(7)加入荧光抗体TRITC-lgG( 1: 100)或FITC-lgG( 1: 100),室温孵育2 小时。
( 8)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。
( 9)缓冲甘油封片，荧光xx 下观察。
对照组:
采用空白对照:
除用
0.01MK PBS代替一抗外，其余程序与实验组相同载玻片处理步骤：（1 ）硫酸浸泡过夜。
（2）自来水冲洗干净后双蒸水冲洗3 遍。
（3）晾干后在
0.1%明胶中快速浸泡后取出。
室温晾干或37 C烤干备用。
冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。
`注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.4 0.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存一、操作方法及步骤：①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
本文将详细介绍这些步骤。
二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。
比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。
2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。
固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。
3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。
脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。
4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。
三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。
这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。
2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。
这一步需要注意，避免样品受到外界污染。
四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。
这一步可以通过加热或酶解等方式实现。
2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。
3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。
这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。
4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。
观察过程需要使用荧光显微镜进行。
五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。
注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.40.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。
（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。
冰冻切片的免疫组化染色
冰冻切片的免疫组化染色1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6 m。
2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。
3. 如不马上染色，可密封后-20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。
5. PBS 洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔既抗原修复)。
6. 3% H2O2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光。
7. 用PBS 洗2次,每次5分钟。
8．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。
9．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2 小时（也可置于4℃冰箱过夜）。
10．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。
11．滴加二抗（辣根过氧化物酶标记）， 37℃，40 分钟。
12．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。
15．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
16．自来水（细水）充分冲洗。
17．苏木素复染，室温，1-5min，自来水冲洗。
（时间可调节，最好在镜下观察，核染上就好不要过染）。
18．自来水冲洗返蓝，15 分钟。
(可调节)19．梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。
20．二甲苯透明：I，II（二甲苯）各5 分钟21．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。
备注：若用DAB呈色，可经酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
若用AEC，则不能用酒精脱水，用吸水纸去周围组织多余的水份，直接将水溶性封片剂（例如明胶甘油）封片。
免疫组化染色步骤-冰冻切片
免疫组化染色步骤主要试剂：Triton X-100（上海生工，货号：0694-100ml ）；0.3% 和0.03% H 2O 2（国药集团，分析纯AR ，30%, 货号：10011218）； 5% normal goat serum （ S-1000，Lot ：Y0123，Vector ）；一抗：Truus rabbit anti- human AVP(23-06-‘86)（1:1000）【荷兰赠送】；二抗：biotinylated goat anti-rabbit IgG （1:200; catalog-BA-1000 Lot NO. X0524, vector ,burlingame, USA ）；ABC Kit ：peroxidase standard PK-4000, vectastain®, vector , USA （1:200） DAB ：0.05% 3,3’-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶液配制：1、10× Tris Buffered Saline (TBS) 、10× TBST 配方：24.2 g Tris base ，80 g NaCl ，adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1×).10×TBST （3% Triton ）：30ul Triton-100 + 970ul TBS （37℃）2、 0.3% H2O2 + 0.5%Triton + TBS ：【注意避光，提前20min 配，37o C 水箱溶解Triton 】 99ml TBS （1×） 500µl Triton【先把Triton 溶解在TBS 中后，再加入H 2O 2。
】3、 抗体配制方法：抗体 + 羊血清 + TBST （0.3%Triton-100），即TBST 来稀释抗体（稀释倍数视抗体而定）和羊血清（稀释成5%）。
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冰冻切片免疫组化染色步骤
引言
冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。
它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。
本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。
步骤一：样本制备
1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。
2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。
步骤二：切片制备
1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。
2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调
装置。
3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片
间的附着力。
步骤三：固定和脱水
1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。
2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。
3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%
乙醇。
步骤四：抗原修复
1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。
这可以通过热、酸或酶
消化等方法进行。
2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。
步骤五：阻断和孵育
1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非
特异性结合。
2.孵育时间通常为30分钟至1小时。
步骤六：一抗孵育
1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。
2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。
步骤七：洗涤
1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。
2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。
步骤八：二抗孵育
1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。
2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。
步骤九：洗涤
1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。
2.洗涤时间和次数根据实验要求和二抗特性进行优化。
步骤十：染色和封片
1.在切片上加入适当染料，如荧光染料或酶标记染料。
2.染色时间根据实验要求和染料的特性进行优化。
3.将切片用封片剂和玻片封装，保护切片并提高显微观察的清晰度。
注意事项
1.实验过程中应注意戴手套，避免污染和交叉污染。
2.所有试剂和缓冲液应正确处理和储存，避免受到污染或损坏。
3.在每个步骤中，涉及固定、切割、染色和封片等操作时，应注意操作的准确
性和流程的顺序。
4.对于特定的细胞和组织样本，可能需要针对抗原修复、阻断、一抗和二抗孵
育等步骤进行优化和调整。
5.根据实验设计和研究要求，可以使用不同的检测方法和荧光染料，以获取最
佳结果。
结论
冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，可以可视化细胞和组织中的特定分子。
通过按照以上步骤进行操作，可以得到高质量的染色结果。
然而，要获得最佳的实验结果，还需要根据实验要求和样本特性进行优化和调整。
希望本文能够对冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项有所帮助。