大肠杆菌感受态多种方法
当前位置：生命经纬 > 实验技术 > 生物化学与分子生物学实验技术大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 2005-4-14 10:53:00 来源：生命经纬第一节概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。
转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。
1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。
一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。
由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。
转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。
由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。
转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
第二节材料、设备及试剂一. 材料E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf管。
二. 设备恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
三. 试剂1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。
2.Amp母液：配方见第一章。
3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
第三节操作步骤一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
三、转化1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
四、计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不一定一样。
有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
思考题1. 制备感受态细胞的原理是什么？2. 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞 2005-4-15 0:20:00 来源：丁香园下面的简单方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。
该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重复性更好。
该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。
１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。
为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。
在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各黧度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。
２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。
切记：下述所有步骤均需无菌操作。
３）于４℃用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
４）倒出培养液，将管倒置１分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。
５）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
我们发现将１mol/L CaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。
制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mlk，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。
对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB（见表1.3）代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。
６）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
７）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
８）每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，见表1.3和步骤５）注]重悬每份细胞沉淀。
此时，可将细胞分成小份，放于-70℃冻存[有关讨论请参见53页本节（二）步骤11)b.c)]。
大肠杆菌感受态细胞的转化方法
一、概述大肠杆菌是一种常见的微生物细菌，广泛存在于自然界中。
而大肠杆菌感受态细胞的转化方法，是一项重要的研究课题。
本文旨在探讨大肠杆菌感受态细胞的转化方法，以期为相关领域的学者和研究人员提供参考。
二、大肠杆菌感受态细胞的定义大肠杆菌感受态细胞是指能够接受外源DNA并进行转化的大肠杆菌细胞。
在细菌转化的过程中，外源DNA能够通过不同的方式导入大肠杆菌感受态细胞内，并且在某种条件下，使其获得新的遗传信息，从而表现出与原有菌株不同的性状。
三、大肠杆菌感受态细胞的转化方法1. 热激转化方法热激转化方法是将需要转化的大肠杆菌细胞与外源DNA在高温条件下共培养，利用高温使大肠杆菌细胞的细胞壁变得松弛，使外源DNA能够顺利进入细胞内。
然后在低温下将其复性，并引起DNA与细胞的内合作用，最终实现外源DNA的转化。
2. 电穿孔法电穿孔法是通过将大肠杆菌感受态细胞暴露在高电场中，在电场作用力下使细胞膜发生孔道破裂，从而使外源DNA顺利进入细胞内，实现转化。
3. 化学法化学法是使用化学物质（如钙离子、聚乙二醇等）处理大肠杆菌感受态细胞，使细胞膜通透性提高，从而使外源DNA得以顺利进入细胞内，实现转化。
4. 冷冻法冷冻法是将需要转化的大肠杆菌感受态细胞与外源DNA共同置于冰冻条件下进行培养，利用冰冻条件下细胞膜通透性增加，使外源DNA能够进入细胞内，最终实现转化。
5. 基因枪法基因枪法是利用基因枪将外源DNA通过高速微粒轰击的方式，直接送入大肠杆菌感受态细胞内，从而实现转化。
6. 瞬时脉冲法瞬时脉冲法是利用高压脉冲将外源DNA导入大肠杆菌感受态细胞内，通过瞬时压力使细胞膜通透性增加，从而使外源DNA能够进入细胞内，实现转化。
四、大肠杆菌感受态细胞的转化效率影响因素1. 外源DNA的浓度外源DNA的浓度对大肠杆菌感受态细胞的转化效率有重要影响。
过高或者过低的外源DNA浓度都会降低转化效率。
2. 细胞状态大肠杆菌感受态细胞的生长状态和健康程度对转化效率有直接影响。
大肠杆菌感受态
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
本实验室一般用TSS 法制备感受态。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态的制备
五、本实验所需要掌握内容
掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休 克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰 浴，冷却1－2分钟。
9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分 钟。
10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的 LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放 置几分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM 的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即 成感受态细胞悬液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存 于-70℃可保存半年。 取其中一份进,轻度摇晃混合 后于冰上放置30分钟。
实验二、大肠杆菌感受态的制备
一、实验原理
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制 备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌， 从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此 条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面， 通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
试剂： 1.LB固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。 5. 待转化质粒。
三、实验步骤
11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。
四、实验注意事项
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时 为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细 胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR. 或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下 进行。
质粒DNA转化感受态大肠杆菌的方法
质粒DNA转化感受态大肠杆菌的方法实验原理利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便能在含有抗生素的平板上生长菌落。
试剂与器材1.LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。
2.LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。
3.0.1mol/L CaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌。
4.氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。
5.质粒6.大肠杆菌DH5α 此为DNA扩增菌7.恒温水浴箱8.超净工作台9.高速冷冻离心机10.恒温摇床11.恒温箱12.消毒离心管13.消毒tips 14.玻璃培养皿直径90mm 15.玻璃涂布器16.95%乙醇17.标记笔实验方法与步骤1、制备含有Amp抗生素的LB平板，终浓度为50ug/ml2、取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入20ul 质粒T+G(提取的质粒DNA稀释500X)，用移液器轻柔混匀。
冰上静置20min。
3、42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3~5min。
整个过程不要振荡菌液。
4、加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5、取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀。
6、待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12~16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。
7、计算转化率8、统计每一个培养皿中的菌落数。
9、转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：10、转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积;11、转化频率(转化子数/μg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(μg)2．DNA重组子的转化大肠杆菌DH-5α：（实验流程如下所示）100ul感受态细胞DH-5α+重组质粒───→轻轻旋转混合───→冰上放置30min───→42 ℃,热激120S───→冰浴2min───→400ulLB培养基───→37℃, 50r/min振摇45min───→取200ul涂布于含Amp琼脂板───→室温放置，使液体吸收───→37℃倒置培养12~16h冻融法质粒DNA转化至大肠杆菌操作步骤1. 取100μl感受态细胞于冰浴上融化。
感受态制备和电转化,多种感受态
一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4℃将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。
4、加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。
5、重复4 .6、再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。
7、用600ul 0.5M蔗糖垂悬。
8、分装菌液，每管100ul。
9、液氮冷冻10s，存于-80℃。
二、大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。
3、冰浴10min。
4、4℃5000rpm离心5min，去上清。
5、加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
6、2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
7、分装每管100ul，存于-80℃。
三、超级感受态（一）溶液1、TB （1L）终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),≥99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。
感受态大肠杆菌制备方法
感受态大肠杆菌制备方法四川大学生命科学学院试剂配制：A液：1M，MnCl2；mol/LB液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液：称取CaCl20.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。
将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
TB缓冲液：方法步骤：1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，3、其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，4、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10×8，好时可到10×9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。
无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态制备与质粒转化
大肠杆菌感受态制备与质粒转化主要试剂1、LB培养基（灭菌后使用）胰蛋白胨（bacto-tryptone） 10g/L酵母提取液（bacto-yeast extract） 5 g/LNaCl 10g/L用NaOH调pH至7.0。
2、LB固体平板每升液体培养基中加入15g琼脂粉，高压灭菌后倒入灭过菌的培养皿中。
3、SOC培养基20g/L Tryptone5g/L Yeast extract0.58g /L NaCl0.186g /LKCl，灭菌后加入过滤除菌的2M葡萄糖（终浓度为20mM），1M MgCl2（终浓度为10mM）。
5.0.1M CaCl2（灭菌后使用）6. 0.1M CaCl2+10%甘油7. 保存于-80℃冰箱的DH5α 或DH10B甘油菌主要仪器恒温摇床冷冻离心机实验步骤一、热击感受态细胞的制备及热击转化1、细菌培养1）从平板上挑取大肠杆菌（DH5α或DH10B）单菌落，放到LB培养基中。
（液体培养基的体积为溶液容积的1/3-1/4为宜）。
2）在37℃，220 rpm培养10h左右。
3）中吸取2 mL培养液到装有200 mL LB培养基的三角瓶中，37℃，220 rpm培养2-3hrs，使其OD600达0.5-0.6。
2、细菌收集将培养液倒入预冷的50 mL离心管中，置于冰上。
3000 rpm离心5-10mi n。
3、感受态制备1）倒弃上清后，加入适量（20mL左右）的预冷的0.1M CaCl2，悬浮菌体，冰上放置30 min。
2） 4000 rpm离心5-10min，倒弃上清后再加入适量（20mL左右）的预冷的0.1M CaCl2，悬浮菌体。
3） 4000 rpm离心5-10 min，加入少量0.1M CaCl2+10%甘油悬浮菌体。
4、感受态保存将上述感受态细胞分装于0.5 mL Eppendorf管（100mL/管）中，置于-70℃贮存备用。
5、感受态融化从冰箱中取出制备好的感受态细胞，放在冰上，使其融化。