小鼠子宫内膜细胞炎症模型的建立_杨倩

１．３．３ 炎症模型实 验 将 处 于 对 数 生 长 期 的 细 胞 接种于９６孔培养板 中，随 机 分 为 ４ 组，每 组 ５ 个 样 本，空白对 照 组、２４、４８、７２ｈ 模 型 组。 根 据 前 面 的 诱导剂 ＬＰＳ的 细 胞 毒 试 验 所 确 定 的 浓 度 给 各 组 施 加药物。收集 ２４、４８、７２ｈ３ 个 时 间 段 的 细 胞 用 于 ＲＴ－ＰＣＲ 检 测 细 胞 内 的 ＩＦＮ－γｍＲＮＡ 的 丰 度。 同 时每个时间段用倒置相差显微镜进行各组细胞的形
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河北农业大学学报
第 ３４ 卷
１ 材料与方法
１．１ 试 验 动 物 １０周龄清洁级未经产昆 明 小 鼠，购 于 河 北 省 实
验动物中心。
１．２ 主 要 试 剂 ＬＰＳ Ｓｉｇｍａ；ＤＭＥＭ／Ｆ－１２Ｓｉｇｍａ；ＦＢＳ 杭 州 四
季青生物 科 技 有 限 公 司；ＭＴＴ Ｓｉｇｍａ；０．２５％ 胰 蛋 白酶－ＥＤＴＡ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ－ ｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ；总 ＲＮＡ 提取试剂盒（离 心 柱 型 ＤＰ４１９） ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ（保 定 ）公 司 。 １．３ 方 法 １．３．１ 小鼠子宫内 膜 细 胞 的 分 离 和 培 养 无 菌 采 取小鼠子宫，放入含双抗的 Ｄ－Ｈａｎｋ＇ｓ液漂洗，修剪， 加 入 ０．２５％ 胰 蛋 白 酶－ＥＤＴＡ（液 体 完 全 覆 盖 子 宫 ）， ３７ ℃ 水 浴 下 消 化 ３０ ｍｉｎ［３］。 过 滤，滤 液 在１ ２００ｒ／ ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，用 Ｄ－Ｈａｎｋ′ｓ洗涤 ３ 次。 弃 上 清， 加入含１５％ＦＢＳ的 ＤＭＥＭ／Ｆ－１２制成细胞悬液，台 盼蓝法检测 细 胞 活 率，分 别 接 种 于 培 养 瓶、２４ 孔 培 养板或９６孔培养 板 中，３７ ℃、５％ 体 积 分 数 ＣＯ２ 条 件 下 培 养 ，定 期 观 察 细 胞 生 长 情 况 。
不同时段的细胞，用 ＲＴ－ＰＣＲ 的方法测定细胞 中ＩＦＮ－γｍＲＮＡ 的 表 达 丰 度。结 果 表 明，１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ 是 体 外
培 养 的 子 宫 内 膜 细 胞 诱 导 炎 症 的 最 适 浓 度 。 炎 症 模 型 组 培 养 细 胞 中ＩＦＮ－γ 的 丰 度 表 达 极 显 著 于 空 白 组 （Ｐ＜
杨 倩， 史万玉， 赵驻军， 钟秀会
＊
（河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 ０７１００１）
摘要：用０．２５％胰酶－ＥＤＴＡ 消化法分离培养小鼠子宫内膜 细 胞，用 细 菌 脂 多 糖（ＬＰＳ）诱 导 子 宫 内 膜 细 胞 炎 症，
以培养细胞的形态学和传统炎症指标作为 炎 症 发 生 和 发 展 的 判 断 标 准 。 以 不 同 浓 度 的 ＬＰＳ 作 用 于 细 胞，收 集
１．３．２ ＬＰＳ 的 药 物 剂 量 确 定 筛 选 试 验 取 ９６ 孔 培养板中处于对数 生 长 期 且 生 长 良 好 的 细 胞，随 机
分为６组（５ 个 不 同 浓 度 的 ＬＰＳ 组，浓 度 分 别 为 １、 ５０、１００、５００、１ ０００ｎｇ／ｍＬ，和 １ 个 空 白 对 照 组），每 组５ 个 孔，不 同 ＬＰＳ 处 理 组 换 液 后 添 加 １００μＬ 不 同剂量的 ＬＰＳ，空白对照组添 加 １００μＬ ＤＭＥＭ／Ｆ－ １２（含胎牛血清１０％）。３７ ℃、５％ 体 积 分 数 ＣＯ２ 条 件下 培 养 ４８ ｈ。４８ ｈ 后 每 孔 加 入 ５ ｍｇ／ｍＬ 的 ＭＴＴ ２０μＬ，继续温育６ｈ。吸去培养液，加入 ＤＭ－ ＳＯ １００μＬ，震荡 ５ ｍｉｎ，使微小黑色结晶溶解，形成 均匀蓝紫色溶液。 用 酶 标 仪 测 定 吸 光 度 （Ａ），测 定 波长５７０ｎｍ，以不 加 细 胞 的 孔 调 零，计 算 药 物 对 细 胞的抑制 率 （Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ≤１０％），确 定 ＬＰＳ 的 最 佳 浓 度 ，同 时 进 行 形 态 学 观 察 。
第６期

杨 倩 等 ：小 鼠 子 宫 内 膜 细 胞 炎 症 模 型 的 建 立
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接近ＩＲ≤１０为１００ｎｇ／ｍＬ 组的浓度，所以，选取的 最佳浓度为１００ｎｇ／ｍＬ 组的浓度（表１）。形态学观 察：１００ｎｇ／ｍＬ 组细胞 明 显 收 缩，形 态 不 规 则，偶 见 漂浮死亡（图 １－Ｃ）。５００ｎｇ／ｍＬ 和 １ ０００ｎｇ／ｍＬ 组细胞明显收缩，形 态 不 规 则，大 量 飘 浮 死 亡，与 空 白对照组相比，细 胞 核 极 度 不 规 则，核 膜 明 显 内 陷。 在胞浆中出现大量 的 空 泡 和 脂 肪 体，线 粒 体 肿 胀 并 扩 大 ，溶 酶 体 增 多 ，细 胞 的 间 隙 增 宽 （图 １－Ｄ、Ｅ）。 其 余各组形态基本正常。
态学观察。
１．３．４ ＲＴ－ＰＣＲ 法 检 测 细 胞 中ＩＦＮ－γｍＲＮＡ 的 表 达丰度 总 ＲＮＡ 的提取，按总 ＲＮＡ 提取试剂盒操 作，用紫 外 分 光 光 度 计 测 定 ＲＮＡ 的 ＯＤ２６０，ＯＤ２８０ 值，计算 ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值，判定 ＲＮＡ 纯 度 及 浓 度；取 部分 ＲＮＡ 甲醛 变 性 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳，紫 外 灯 下 观 察，以 确 定 其 完 整 性。ＩＦＮ－γ 基 因 上 游 引 物：５－： ＧＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＴＡＣ－３，下 游 引 物：５－ ＡＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣ－３ ，扩 增 片 段 长 度 ２３７ｂｐ；内 对 照 β－ａｃｔｉｎ 基 因 上 下 游 引 物 分 别 为：５－ ＧＣＣＡＡＡＣＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣ－３；５－ＧＡＣＡＣＡＴ－ ＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＡＡＣ－３ ，扩增片段长度为 ３７９ｂｐ。 ＲＴ－ＰＣＲ 采用两步法，先合成ｃＤＮＡ，再以ｃＤＮＡ 为 模板进行 ＰＣＲ．２０μＬ ＰＣＲ 反应体系，先９４ ℃变性 ５ｍｉｎ，然后进 入 循 环：９４ ℃ 变 性 ３０ｓ，５５ ℃ 退 火 ３０ｓ，７２ ℃ 延 伸 １ ｍｉｎ，循 环 ３０ 次，最 后 再 延 伸 ５ｍｉｎ，ＰＣＲ 产物进行琼 脂 糖 凝 胶 电 泳，图 像 分 析 仪 扫描分析并摄像。 １．３．５ 统 计 学 处 理 所 有 数 据 均 用 ＳＰＳＳ１３．０ 软 件包进行处理
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｒｙｐｓｏ－ ｇｅｎ－ＥＤＴＡ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａ－ ｒｉｄｅ（ＬＰＳ）．Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒａｄｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＬＰＳ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ＩＦＮ－γｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｄｅ－ ｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩＦＮ－γｉｎ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｅｒｉｏｄ （Ｐ＜０．０１），ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｃｒｅａｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌ；ＬＰＳ；ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｏｄｅｌ
＊收 稿 日 期 ：２０１１－０５－０７ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （３０９７２２０８）和 教 育 部 博 士 点 基 金 （２０１０１３０２１１０００４）资 助 ． 作 者 简 介 ：杨 倩 （１９８４－ ），女 ，河 北 保 定 市 人 ，在 读 研 究 生 ． 通 讯 作 者 ：钟 秀 会 （１９５６－ ），男 ，教 授 ，博 导 ，研 究 方 向 ：中 药 药 理 ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｘｈ８０７８＠１６３．ｃｏｍ．
图 １ 细 胞 形 态 的 变 化 Ｆｉｇ．１ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ
２．３ ＬＰＳ 的 药 物 剂 量 确 定 筛 选 试 验 诱导药物 ＬＰＳ剂 量 筛 选 的 ＭＴＴ 试 验 发 现，从
１００ｎｇ／ｍＬ 的浓度起 才 有 作 用，呈 浓 度 依 赖 性。 最
０．０１），表 明 炎 症 模 型 建 立 成 功 。
关 键 词 ：子 宫 内 膜 细 胞 ；ＬＰＳ；炎 症 模 型
中 图 分 类 号 ：Ｓ８５２．１
文 献 标 志 码 ：Ａ
Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ
ＹＡＮＧ Ｑｉａｎ，ＳＨＩ Ｗａｎ－ｙｕ，ＺＨＡＯ Ｚｈｕ－ｊｕｎ，ＺＨＯＮＧ Ｘｉｕ－ｈｕｉ
第 ３４ 卷 第 ６ 期 ２ ０ １ １年１ １月
河北农业大学学报
Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．６
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＥＢＥＩ Ｎｏｖ．２ ０ １ １