一株产酯化酶菌株的分离鉴定及产酶
产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化
产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化赵伟;王俐琼;郑甲;周洪波【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2010(033)003【摘要】从长沙岳麓山和湘江等地富含油脂的样品中分离得到一株产脂肪酶菌株CS 1-1,经18S rDNA序列分析,确定该菌株为黑曲霉(Aspergillus,niger).对该菌株的产酶条件进行优化,发现该菌株在以体积分数为1%的橄榄油为诱导物,5 g/L蔗糖为碳源,40 g/L蛋白胨为有机氮源,1 g/L(NH4)2SO4为无机氮源,pH为6.5的培养基中,于28℃,180 r/min摇床培养48 h,可达最大酶产量(37.6±0.8)mmol·min-1·L-1.【总页数】5页(P88-92)【作者】赵伟;王俐琼;郑甲;周洪波【作者单位】中南大学资源加工与生物工程学院,中国,长沙,410083;中南大学资源加工与生物工程学院,中国,长沙,410083;中南大学资源加工与生物工程学院,中国,长沙,410083;中南大学资源加工与生物工程学院,中国,长沙,410083【正文语种】中文【中图分类】Q939【相关文献】1.产脂肪酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化 [J], 胡珺;杜新凯;王常高;林建国;杜馨;蔡俊2.产脂肪酶菌株的筛选、鉴定与产酶条件优化 [J], 黎小军;谢莲萍;刘建宏;朱婷婷;刘蓉3.一株产脂肪酶细菌的分离鉴定及产酶条件优化 [J], 刘晓丽;杨孝朴;赵军4.产脂肪酶菌株C7828-5的筛选、鉴定以及产酶条件的优化 [J], 麻琼丽;张家明5.产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及产酶条件优化 [J], 吴子君;陈思沅;杜昭君;胡双;李海峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
己酸乙酯酯化菌分离筛选及鉴定
菌为 主要 产香 功 能菌 。 自然 界 中能够 代 谢 己酸 乙酯
真菌 进 行分 离纯 化 ，获得 了具有 较 高 活性 的 己酸 乙 酯酯 化 功能 菌 。 对一 些 菌株作 了分 类 鉴定 ， 对培 养基 和培 养条 件进 行 了研 究 ，使 菌株 的酯化 产酯 能 力进
一
步 得 到提 高【 本 文报 道菌 株分 离筛 选 和一株 红 曲 ３ Ｉ 。
酯化 酶 的微生 物种 类不 多 ， 主要 是霉 菌 。 一般 大 型真 菌， 酵母 菌和 细菌 均不 能合 成 己酸 乙酯 ｆ 白酒 工业 ２ 】 。 中的 己酸乙酯 酯化 菌 主要 是根 霉 和 红 曲霉 。根霉 是
一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究
中山大学学报 （ 自然 科 学 版 ）
ＡＣ ＴＡ Ｓ ＥＮＴＩ ＣＩ ＡＲＵＭ ＮＡＴＵＲＡＬＩ ＵＭ ＵＮＩ ＶＥＲＳ ＴＡＴＩ Ｉ Ｓ Ｓ ＵＮＹＡＴＳ ＥＮＩ
Ｖｏ． Ｎｏ ５ １５１ ．
Ｓ ｐ． ２０１ ｅ ２
一
株 产 纤 维 素 酶细 菌 的分 离 鉴 定 及其 酶 学 特 性研 究
ｔ ０ ｏ ，ｗｈ ｌ ｈ ｒｗｔ ｏ ５ Ｃ ｉｅ ｔ ｅ ｇ ｏ ｈ ｐＨ ａ ｇ ｓｆｏ ５． ｏ １ ． ｒ ｎ ｅ ｍ ０ ｔ １ ０．Ｔｈ ｕ ｔ ｒ ｏ ｉ ｏ ｓａ Ｈ ． ｒ ｅ ｃ ｌｕ ｅ ｃ ｎｄｔ ｎ ｔｐ ６ ０～９． ｉ ０，３ ～ ４ ４ Ｃ ｎ ． ０ ｏ ａ ｄ １ ５％ ～３． ％ Ｎａ ｒ ｈ ｓ ｕ ｔｂ ｅ ｆ ｒｅ ｚ ｍｅ ｐ ｏ ｕ ｔ ｎ．Ｔ ｅ ｏ ｔｍａ ｅ ５ Ｃ１ａ ｅ ｔ ｅ ｍｏ ｔｓ ｉａ ｌ ｏ ｎ ｙ ｒ ｄ ｃ ｉ ｏ ｈ ｐ ｉ ｌｔｍｐｅ ａｕ ｅ ｆ ｒ ｒ ｔ ｒ ｏ
行 了产 纤维素 酶研 究 ，认 为 Ｂ ｕ ｉ ｓ ．ｐ ｍ ｌ 是一 种抗 分 ｕ
Ｐ Ｒ引物 由上 海 生 工合 成 。Ｔａ ｇｎ细 菌 基 『 组 总 Ｃ ｉ ｅ ｎ 大 ］
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１２ １ 样 品预 处理 取 采 集 到 的 土壤 样 品 ５ ｇ于 ． ．
纤 维 素是地球 上 光合作 用产 量最 高 的多糖 ，它 是 由葡萄糖 以 Ｂ一１ ４糖 苷键 连接 而成 的线状 大 分 ， 子物 质 。据 报道 ，纤 维 素全 球 年产 量 为 １５× 卜 ． １ 万 ｔ ０ 。高效纤 维 素 酶 的研 究 开 发是 可 再 生 性 资
一株产酯化酶细菌的筛选
一株产酯化酶细菌的筛选张秀红;刘秋林;孔健;赵景龙【摘要】A bacteria strain with strong capability of producing esterifying enzyme was screened out from Fenjiu Daqu,such strain was identified as Staphylococcus by its cell shape and colony characterization.When grown in liquid fermenting culture medium,37 ℃ for 48 h,its enzyme activity could reach up to 25.00 U/mL.After the optimization of carbon source and nitrogen source of the culture medium（soybean cake powder used as nitrogen source and corn flour as carbon source）,the enzyme activity of the strain could reach up to 33.33 U/mL（37 ℃,180 r/min for 48 h）.%从汾酒大曲（后火曲、红心曲、清茬曲）中筛选出1株产酯化酶较高的菌株,从菌落外形及显微镜观察初步确认是葡萄球菌。
该菌株在液体发酵培养基中,以37℃恒温摇床培养48 h,发酵液酶活力可达25.00 U/mL;对该菌株的发酵培养基进行碳源和氮源优化。
结果表明,以豆饼粉作氮源,玉米粉为碳源,于37℃、180 r/min下摇床培养48 h,酶活力可达到33.33 U/mL。
【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】3页(P56-58)【关键词】微生物;细菌;酯化酶;酶活力;优化;汾酒大曲【作者】张秀红;刘秋林;孔健;赵景龙【作者单位】山西杏花村汾酒厂股份有限公司,山西汾阳032205 山西师范大学生命科学学院,山西临汾041000;山西师范大学生命科学学院,山西临汾041000;山东大学生命科学学院,山东济南250100;山西杏花村汾酒厂股份有限公司,山西汾阳032205【正文语种】中文【中图分类】TS261.1;Q93-3酯化酶亦称羧基酶，是一种混合酶的统称。
一株酯化酶霉菌的分离、鉴定及代谢产物特征
一株酯化酶霉菌的分离、鉴定及代谢产物特征黄丹;方春玉;尚志超;储玉龙;李见基【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2010(000)006【摘要】研究不同培养条件下产酯化酶霉菌的代谢产物特征.从浓香型大曲中分离得到一株产酯化酶霉菌,用Biolog微生物自动分析系统进行鉴定,改变培养温度、发酵时间、碳源物质等培养条件,用乙醇对发酵液进行萃取,并用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对其进行鉴定分析.结果表明,该分离菌株为黄曲霉(Aspergillus flavus).随温度的升高,其代谢产物分子量逐渐加大,高级醇的合成逐渐增多,碳链逐渐加长;随时间的延长代谢产物的合成大致呈醇-酸-酯的变化规律,碳链短的产物先于碳链长的产物出现;分别以淀粉、蔗糖、麸皮为碳源物质时,正丁醇、异戊醇是其共有的代谢产物,以蔗糖为碳源时合成的代谢产物多为一些短链的醇、酸,以淀粉为碳源时生成了琥珀酸乙酯,以麸皮为碳源时,合成的代谢产物较少.【总页数】3页(P62-64)【作者】黄丹;方春玉;尚志超;储玉龙;李见基【作者单位】四川理工学院,生物工程系,四川,自贡,643000;四川理工学院,生物工程系,四川,自贡,643000;四川理工学院,生物工程系,四川,自贡,643000;四川理工学院,生物工程系,四川,自贡,643000;四川理工学院,生物工程系,四川,自贡,643000【正文语种】中文【中图分类】TS261.1【相关文献】1.一株产己酸乙酯酯化酶霉菌的分离鉴定及产酶条件研究 [J], 黄丹;刘清斌;刘达玉;阚思洋;张拓2.一株产酯化酶菌株的分离鉴定及产酶 [J], 王晓丹;李付丽;胥思霞;班世栋;王荣村;沈锡翠;吴鑫颖;邱树毅3.一株酯化酶细菌的分离、鉴定及代谢产物特征 [J], 黄丹;方春玉;储玉龙;尚志超;杨伟4.一株油藏嗜热厌氧杆菌的分离、鉴定及代谢产物特征 [J], 黎霞;承磊;汪卫东;邓宇;尹小波;张辉5.一株黄芪内生真菌甾醇类代谢产物的分离和鉴定 [J], 刘瑞;张弘弛;安志鹏;李慧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及发酵培养基优化
was selected and identified as
. The fermentation medium formula was optimized by single factor and response surface methodology as
follows: tributyrin 2.0% ( / ), glucose 9 g/L and urea 8 g/L. Under the condition, the lipase activity was 4.3 U/ml, which was 16.22% higher than that of
将采集的样品分别依次进行富集培养、初筛和初始发 酵复筛。样品经过3次富集培养后，分别取50 滋L菌液上清 涂布于罗丹明B培养基平板，罗丹明B能与脂肪酶降解油脂 产生的脂肪酸特异性结合，产酶菌落周围会生成玫红色， 在波长365 nm紫外灯下呈现橙黄色。将罗丹明B平板放在 波长365 nm紫外灯下进行观察，选取橙黄色圈较大的菌株 进行分离培养，镜检至无杂菌后作为出发菌种，接种于初 始发酵培养基中进行复筛，选出脂肪酶高产菌株[15-17]。 1.3.2 菌种鉴定
富集培养基：酵母膏0.2 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二 钠3.5 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，橄榄油 10 mL，用蒸馏水定容至1 000 mL，121 益灭菌20 min。
初筛罗丹明B培养基[14]：硫酸铵0.5 g，氯化钠4 g，磷酸 氢二钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，琼脂粉15 g，三丁酸甘油脂乳 化液100 mL（4% PVA颐三丁酸甘油脂=3颐1，超声乳化），用 蒸馏水定容至1 000 mL，121 益灭菌20 min后，待温度降至 60 益时加入1 mL罗丹明B 溶液（质量浓度＜10 mg/mL），混 匀后倒平板。
一株内切葡聚糖酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化
第 43 卷第 1 期2024年 1 月Vol.43 No.1Jan. 2024中南民族大学学报（自然科学版）Journal of South-Central Minzu University（Natural Science Edition）一株内切葡聚糖酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化赵思卡1，许倍滔1，冯喆1，王力2，张建国2，李晓华1*（1 中南民族大学a. 生命科学学院；b. 微生物资源与利用湖北省工程技术研究中心，武汉430074；2 江苏神力生态农业科技有限公司，江苏宜兴214211）摘要从湖南省长沙县养殖场牛胃秸秆发酵物中分离获得了一株高产内切葡聚糖酶的菌株，命名为SCUEC7. 通过菌落形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析，鉴定SCUEC7菌株为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）. 当培养时间为12 h、pH值为6.0、培养温度为37 °C、碳源为20.0 g·L-1麦芽糖、氮源为15.0 g·L-1胰蛋白胨、金属离子为1.5 g·L-1的Mn2+的条件下，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株菌体生长量和内切葡聚糖酶活性均较高. 在单因素实验的基础上，响应面法分析显示：培养11.9 h，初始pH值为5.9，麦芽糖含量为19.8 g·L-1时，预测最高酶活力为409.0 U·mL-1，内切葡聚糖酶的酶活力实测值与预测值之间有较高的拟合度. SCUEC7菌株产生内切葡聚糖酶活性较高，为其秸秆饲料中的应用奠定基础.关键词枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株；内切葡聚糖酶；产酶条件优化；响应面法优化中图分类号Q93 文献标志码 A 文章编号1672-4321（2024）01-0024-08doi：10.20056/ki.ZNMDZK.20240104Isolation and identification of an endoglucanase producing strain and optimization of its enzymatic production conditionsZHAO Sika1，XU Beitao1，FENG Zhe1，WANG Li2，ZHANG Jianguo2，LI Xiaohua1*（1 South-Central Minzu University a. College of Life Sciences； b. Hubei Provincial Engineering and Technology Research Center for Resources and Utilization of Microbiology， Wuhan 430074，China； 2 Jiangsu Shenli Ecological AgriculturalScience and Technology Co Ltd， Yixing 214211， Jiangsu China）Abstract A strain with high production of endoglucanase was selected from the straw fermentation of cattle stomach in Changsha County， Hunan Province， and was named SCUEC7. Based on the morphological observation， physiological and biochemical characteristics， and 16S rDNA sequence comparison analysis， SCUEC7 strain was identified as Bacillus subtilis. The culture conditions for the better growth of SCUEC7 strain were as follows： 12 h of culture period， pH 6.0， 37 °C of culture temperature， 20.0 g·L-1 maltose as carbon source， 15.0 g·L-1 tryptone as nitrogen source， 1.5 g·L-1 Mn2+ as metal ion. Response surface methodology analysis showed that the highest predicted enzyme activity was 409.0 U·mL-1 when the initial pH value was 5.9， maltose content was 19.8 g·L-1， and culture period was 11.8 h. There was a high degree of fit between the measured and predicted values of endoglucanase activity. SCUEC7 strain has a strong ability to produce endoglucanase， which can provide a basis for the development of animal feed.Keywords Bacillus subtilis SCUEC7 strain； endoglucanase； optimization of enzymatic production conditions； response surface optimization收稿日期2021-09-24* 通信作者李晓华（1968-），男，教授，博士，研究方向：微生物资源与应用， E-mail：*********************基金项目国家自然科学基金资助项目（31070087）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（CZY19018）；中南民族大学企业委托资助项目（HZY20042，HZY21015）第 1 期赵思卡，等：一株内切葡聚糖酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化纤维素酶是作用于纤维素中β-1，4-葡萄糖苷键的一组酶［1］，能够使纤维素变为葡萄糖和纤维二糖［2-3］，根据酶功能不同主要分为3种：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶［4］，纤维素酶在各行业应用广泛，在全球市场占据了酶产业份额的15%［5］. 目前筛选到具有产纤维素酶能力的真菌主要来自木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）和脉孢菌属（Neurospora）等；细菌主要来自芽胞杆菌属（Bacillus）、高温单胞菌属（Thermomonospora）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）等；放线菌主要有链霉菌属（Streptomyces）、小单胞菌属（Micromonospora）、分枝杆菌属（Mycobacterium）等［6］. 秸秆主要成分为木质纤维素［7］，具有致密结构，在自然条件下难以被动物体降解和吸收［8］，纤维素酶在秸秆饲料中的应用可以起到增加饲料适口性和动物体吸收率等作用［9］.本研究从健康的牛胃秸秆发酵物中分离内切葡聚糖酶产生菌株，并通过菌落特征、生理生化性质、16S rDNA 序列对比分析对菌株进行鉴定，进一步对菌株产酶条件进行研究，为内切葡聚糖酶在秸秆饲料中应用奠定基础.1 材料与方法1.1 实验材料实验样品采自于湖南省长沙县养殖场健康牛胃中的秸秆发酵物.1.2 培养基（1）基础发酵培养基：葡萄糖5.0 g·L-1，酵母浸粉10.0 g·L-1，pH值自然.（2）牛肉膏蛋白胨培养基：NaCl 5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，牛肉膏3.0 g·L-1，琼脂18.0 g·L-1，pH 值7.0.（3）CMC-Na培养基：羧甲基纤维素钠10.0 g·L-1，酵母浸粉0.5 g·L-1，KH2PO4 1.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，MgSO4 0.3 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，琼脂15.0 g·L-1，pH值自然.1.3 实验方法1.3.1 产内切葡聚糖酶菌株的筛选将牛胃秸秆发酵物在CMC-Na液体培养基中37 ℃，180 r·min-1，富集培养24 h，取富集培养液1 mL，稀释涂布于CMC-Na固体培养基中，37 ℃培养24 h，多次分离纯化挑取单菌落.用牛津杯法［10-11］测定降解圈大小，实验设置3次重复.1.3.2 菌株特征、生理生化特性及16S rDNA序列的扩增分析将筛选得到的菌株划线接种后，37 ℃培养12 h，革兰氏染色［12］，镜检观察.根据《常见细菌鉴定手册》对菌株进行生理生化鉴定［13］. 提取菌株基因组DNA，使用16S rDNA通用引物［14］扩增. PCR产物由武汉擎科生物公司测序，利用BLAST对16S rDNA 序列比对分析，使用MEGA7.0构建系统进化树. 1.3.3 菌株产酶条件单因素优化以培养时间、pH值、温度、碳源、氮源、无机盐作为影响因素，依次改变其中一个因素，研究各因子对SCUEC7菌株产内切葡聚糖酶的影响.以1%接种量将SCUEC7菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，37 °C，180 r·min-1培养48 h，每隔4 h 测定一次菌体量和酶活性；分别将pH值设置为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，37 °C、180 r·min-1培养12 h测定菌体量和酶活性；分别将培养温度设置为25、30、37、42、50、55 °C，180 r·min-1培养12 h，每个处理设置3次重复，测定菌体量和酶活性.以发酵培养基为基础，分别将唯一碳源设置为浓度分别为10 g·L-1的蔗糖、麦芽糖、果糖、淀粉、魔芋粉；唯一氮源设置为浓度分别为10 g·L-1的胰蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白、尿素、硫酸铵；分别向培养基中添加浓度为1 g·L-1的K+、Cu2+、Na+、Mn2+、Mg2+，37 °C、180 r·min-1培养12 h，每个处理设置3次重复，测定菌体量和酶活性.按国际单位规定：在37 °C、pH值7.0条件下，每分钟催化CMC-Na水解产生1 μg葡萄糖所需要的酶量定义为1个内切葡聚糖酶酶活性单位（1 U）. 1.3.4 菌株产酶条件响应面法优化在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken响应面设计，分析各因素的交互作用，构建二次响应面回归模型，计算方差，得出最佳酶活性条件并验证. 响应面试验各因素与水平如表1所示.表1 响应面试验因素与水平Tab.1 Analytical factors and levels for response surface methodology 水平-11因素培养时间/h91215pH值567麦芽糖含量/（g·L-1）15202525第 43 卷中南民族大学学报（自然科学版）2 结果与讨论2.1 产内切葡聚糖酶菌株筛选将牛胃中秸秆发酵物在CMC-Na液体培养基中富集培养，用生理盐水进行梯度稀释，涂布于CMC-Na固体培养基上，利用牛津杯法测定，结果如表2所示，11株菌株中纤维素降解圈在11.38～22.83 mm之间，G2菌株直径最小，为11.38 mm，G7菌株直径最大，为22.83 mm，将G7菌株命名为SCUEC7菌株.2.2 内切葡聚糖酶产生菌SCUEC7菌株的鉴定将SCUEC7菌株接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，菌落扁平，呈圆形，边缘不规则，无光泽，呈现不透明黄白色，易挑起，无色素. SCUEC7菌株生理生化特性测定结果：革兰氏染色试验、酪素利用试验、甲基红试验、伏-普试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉利用试验、丙酸盐利用试验和硝酸盐还原试验结果呈阳性，硫化氢试验、枸橼酸盐利用试验和吲哚试验结果呈阴性.以SCUEC7菌株基因组DNA为模板，PCR法扩增菌株的16S rDNA序列，利用BLAST进行同源性序列比对，使用MEGA7.0软件N-J法构建系统进化树，结果如图1所示，SCUEC7菌株与Bacillus subtilisstrain ATCC 6015相似度达到99%，结合SCUEC7菌株形态特征、生理生化特性，初步鉴定SCUEC7菌株为枯草芽胞杆菌.2.3 单因素实验优化产酶条件2.3.1 培养时间以1%接种量将SCUEC7菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，结果表明（图2），培养时间在0～12 h 范围内，菌株生长量和酶活性随时间的增加而增加；培养时间在12～48 h范围内，菌株生长量和酶活性随时间的增加而下降.2.3.2 pH值以1%接种量将SCUEC7菌株接种到不同初始pH值的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养12 h后，pH值在2.0～6.0范围内，菌株的生长量和内切葡聚糖酶活性随pH值的增加而增加（图3）； pH值在6.0～11.0范围内，菌株生长量和酶活性随pH值的增加而逐渐降低. pH值为6.0时，SCUEC7菌株产酶活性显著高于其他实验组（P <0.05）. 结果表明， pH值为6.0时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株生长量和酶活性较高.2.3.3 温度培养温度在25～37 °C范围内，菌株生长量和表2 11株菌株降解圈大小Tab.2 Size of CMC-Na degradation circle of 11 strains菌株编号G1G2G3G4降解圈直径/mm15.40±2.2511.38±1.5314.57±1.5312.13±1.70菌株编号G5G6G7G8降解圈直径/mm18.77±1.1520.52±0.9222.83±1.5617.40±0.70菌株编号G9G10G11降解圈直径/mm21.23±1.7915.77±0.4213.67±3.36图1 基于16S rDNA 的SCUEC7菌株系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of SCUEC7 strain based on 16S rDNATime/hOD6酶活性/(U·mL-1)图2 培养时间对SCUEC7菌株生长和产酶活性的影响Fig.2 Effects of culture time on the growth and enzyme productionof SCUEC7 strain26第 1 期赵思卡，等：一株内切葡聚糖酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化酶活性随培养温度的升高而增加（图4）；培养温度在37～55 °C 范围内，菌株生长量和酶活性随温度的升高而下降.温度为37 °C 时，SCUEC7菌株产酶活性显著高于其他实验组（P <0.05）. 因此，培养温度为37 °C 时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株生长量和酶活性较高.2.3.4 碳源当以麦芽糖作为碳源时（图5），枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高，除与葡萄糖、果糖实验组差异不显著外，显著高于其他三个实验组（P <0.05）. 结果表明，麦芽糖为碳源时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高.将培养基中的麦芽糖浓度分别设为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g ·L -1的梯度，培养12 h 后发现（图6），麦芽糖浓度在5.0～20.0 g ·L -1范围内，酶活性从203.8 U ·mL -1增加到242.4 U ·mL -1，麦芽糖浓度在20.0～30.0 g ·L -1范围内，酶活性从242.4 U ·mL -1下降到198.0 U ·mL -1 . 麦芽糖浓度为20.0 g ·L -1时，SCUEC7菌株产酶活性显著高于其他实验组（P <0.05）.所以麦芽糖浓度为20.0 g ·L -1时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高.2.3.5 氮源当胰蛋白胨作为唯一氮源时，SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性显著高于其他五个实验组（P <0.05）. 结果表明：胰蛋白胨为氮源时，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高（图7）.将胰蛋白胨浓度分别设置成5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 g ·L -1的浓度梯度，培养12 h 后，测定内切葡聚糖酶活性，结果如图8所示：胰蛋白胨的浓度在5.0~15.0 g ·L -1范围内，酶活性由198.0 U ·mL -10.01.02.03.04.0pH50100150200O D 600酶活性/(U ·m L -1)a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 和h 代表不同pH 值对SCUEC7菌株产酶活性影响的显著性差异分析（P <0.05）.图3 pH 值对SCUEC7菌株生长和产酶活性的影响Fig.3 Effects of pH value on the growth and enzyme production ofSCUEC7 strain-01234Temperature/℃O D 600酶活性/(U ·m L -1)a 、b 、c 、d 、e 和f 代表不同温度对SCUEC7菌株产酶活性影响的显著性差异分析（P <0.05）.图4 培养温度对SCUEC7菌株生长和产酶活性的影响Fig.4 Effects of culture temperature on the growth and enzymeproduction of SCUEC7 strain葡萄糖蔗糖麦芽糖果糖淀粉魔芋粉50100150200250碳源aaabcd酶活性/(U ·m L -1)a 、b 、c 和d 代表不同碳源对SCUEC7菌株产酶活性影响的显著性差异分析（P <0.05）.图5 不同碳源对SCUEC7菌株生长和产酶活性的影响Fig.5 Effects of different carbon sources on the growth and enzymeproduction of SCUEC7 strain150175200225250麦芽糖浓度/(g·L -1)酶活性/(U ·m L -1)a 、b 、c 和d 代表不同浓度麦芽糖对SCUEC7菌株产酶活性影响的显著性差异分析（P <0.05）.图6 不同浓度麦芽糖对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.6 Effects of different concentration maltose on enzyme productionof SCUEC7 strain27第 43 卷中南民族大学学报（自然科学版）增加到222.0 U ·mL -1，胰蛋白胨的浓度在15.0~30.0 g ·L -1范围内，酶活性由222.0 U ·mL -1下降到185.1 U ·mL -1. 胰蛋白胨浓度为15.0 g ·L -1时，SCUEC7菌株产酶活性显著高于其他实验组（P <0.05）.结果表明，胰蛋白胨浓度为15.0 g ·L -1时，枯草芽胞杆菌SCUEC72.3.6 金属离子以1%接种量将SCUEC7菌株分别接种到添加1.0 g ·L -1的Na +、K +、Mn 2+、Cu 2+和Mg 2+离子的基础发酵培养基中，培养12.0 h 后（图9），添加Mn 2+的实验组，SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性显著高于其他四个实验组（P <0.05）. 因此，添加Mn 2+，枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株的内切葡聚糖酶活性较高.将Mn 2+浓度分别设置成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g ·L -1的梯度，培养12.0 h 后，测定内切葡聚糖酶活性，结果如图10所示，Mn 2+浓度在0.5～1.5 g ·L -1范围内，酶活性由311.6 U ·mL -1增长到354.3 U ·mL -1，Mn 2+浓度在1.5-3.0 g ·L -1范围内，酶活性由354.3 U ·mL -1下降到310.6 U ·mL -1 . Mn 2+浓度为1.5 g ·L -1时，SCUEC7菌株产酶活性显著高于其他实验组（P <0.05）.2.4 响应面试验优化结果2.4.1 响应面设计与结果选取培养时间、pH 值、麦芽糖含量3个独立变量为考察因素，设计响应面试验，测定每组实验菌株酶活性，作为响应面法分析的依据，表3为响应面试验设计及结果.2.4.2 响应曲面模型构建及回归方程结果显著性分析使用Design -Expert 10软件分析表4实验数据，建立多元回归模型.拟合培养时间（A ）、pH 值（B ）、麦芽糖含量（C ）之间的二次多项回归方程如下：酶酵母浸粉胰蛋白胨牛肉膏酪蛋白尿素硫酸铵60120180240氮源abcdee酶活性/(U ·m L -1)a 、b 、c 、d 和e 代表不同氮源对SCUEC7菌株产酶活性影响的显著性差异分析（P <0.05）.图7 不同氮源对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.7 Effects of different nitrogen sources on enzyme production ofSCUEC7 strain酶活性/(U ·m L -1)胰蛋白胨含量/(g·L -1)a 、b 、c 、d 和e 代表不同浓度胰蛋白胨对SCUEC7菌株产酶活性影响的显著性差异分析（P <0.05）.图8 不同浓度胰蛋白胨对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.8 Effects of different concentration tryptone on enzyme productionof SCUEC7 strainNa +K +Mn 2+Cu 2+Mg 2+100150200250300350金属离子acdeb酶活性/(U ·m L -1)a 、b 、c 、d 和e 代表不同金属离子对SCUEC7菌株产酶活性影响的显著性差异分析（P <0.05）.图9 不同金属离子对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.9 Effects of different metal ions on the growth of SCUEC7 strainMn 2+浓度/(g·L -1)酶活性/(U ·m L -1)a 、b 和c 代表Mn 2+浓度对SCUEC7菌株产酶活性影响的显著性差异分析（P <0.05）.图10 不同浓度Mn 2+对SCUEC7菌株产酶活性的影响Fig.10 Effects of different concentration Mn 2+ on the growth ofSCUEC7 strain28第 1 期赵思卡，等：一株内切葡聚糖酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化活Y=408.78-3.38A-3.22B-1.67C-2.40AB-15.97AC+ 0.042BC-22.73A2-23.89B2-10.11C2.如表4所示，模型的F=11.7，模型P=0.0019< 0.01，表明模型极为显著. R2=0.9377，表明该方程与对应的响应值吻合程度达93.77%. 由F检验可知影响菌株SCUEC7产酶活性的主次因素为培养时间>pH值>麦芽糖含量. 通过Design-Expert 10软件计算得出：当预测的响应值最大时，3个因素所对应的最佳值是11.9 h，初始pH值5.9，麦芽糖含量19.8 g·L-1.在此条件下所预测的最大酶活为 409.0 U·mL-1 .2.4.3 响应曲面交互作用及结果分析培养时间、pH、麦芽糖含量3个因素对SCUEC7菌株产酶活性影响的响应面图和等高线图见图11. 由图可知，pH值、培养时间之间存在较弱的交互作用；pH值、麦芽糖浓度之间和培养时间、麦芽糖浓度之间存在很强的交互作用.2.4.4 模型检验试验结果将SCUEC7菌株最佳产酶活条件调整为培养时间11.9 h，初始pH值6.0，麦芽糖含量19.8 g·L-1，此条件下进行3组平行实验，所得平均酶活力为409.2 U·mL-1，与预测值409.0 U·mL-1差距不大，表明该结果符合客观实际. 所以采用响应面法优化SCUEC7产内切葡聚糖酶条件可行.3 结语本研究从湖南省长沙县养殖场健康牛胃秸秆发酵物中分离得到枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）SCUEC7菌株，通过响应面分析，预测最优产酶条件下培养时间为11.9 h，初始pH值为5.9，麦芽糖含量为19.8 g·L-1.在动物饲料加工过程中，内切葡聚糖酶可高效降解秸秆饲料中的纤维素［15］，增加动物体营养物质利用率［16-18］.陈龙等研究Bacillus velezensis 157发现，以碱处理玉米秸秆和豆粕的质量比为1.0∶1.0，底物与水分质量比为1.0∶0.5，于37 °C培养温度下发酵24 h后，其内切葡聚糖酶活性为56.83 U·mL-1［19］；何楠等从玉米秸秆中分离出一株枯草芽胞杆菌BS-DX4，在最适生长温度 40 °C，最适pH值7.0 条件下，该菌株胞外分泌液内切葡聚糖酶最高活性为358.3 U·mL-1 ［20］，其最高酶活低于SCUEC7菌株，最适pH值与最适温度高于SCUEC7菌株；马振刚等从自然界分离出一株蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus strain CQNUX 3-1，在70 °C、pH值8.0条件下该菌株胞外分泌液内切葡聚糖酶最高活性为107.7 U·mL-1 ［21］，最高酶活低于SCUEC7菌株，最适pH值与最适温度高于SCUEC7. 虽然研究者已从芽胞杆菌中分离出多株产内切葡聚糖酶菌株，但远不能满足工业生产对产酶菌株需求和酶性质的要求，产内切葡聚糖酶菌种资源筛选备受关注. 本研究为内切葡聚糖酶的表3 响应面各因素水平与产酶活性Tab.3 Factor level of response surface methodology and enzyme activity实验序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17A培养时间/h11-11-1-1-11B pH值-11-11-1-111C麦芽糖含量/（g·L-1）-1-11-111-11酶活力/（U·mL-1）377.0388.8372.6368.5362.2347.6369.4396.8371.9408.1360.6413.4416.4395.0380.1409.2357.7表4 回归模型方差分析Tab.4 Regression model and analysis of variance来源ModelABCABACBCA2B2C2残差失拟项净误差总离差平方和6754.3291.2382.9122.3823.011020.140.0007082175.412402.55430.01449.09225.47223.617203.41df911111111173416均方750.4891.2382.9122.3823.011020.140.0007082175.412402.55430.0164.1675.1655.90F值11.701.421.290.350.3615.900.00001433.9137.456.701.34P值0.00190.27190.29300.57330.56810.00530.99190.00060.00050.03600.3785显著性*******注：“**”，差异极显著（P<0.01）；“*”，差异显著（P<0.05）.29第 43 卷中南民族大学学报（自然科学版）工业化生产提供了微生物资源.参 考 文 献［1］ HU Y W ， KANG G B ， WANG L ， et al. 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产脂肪酶真菌的分离鉴定、产酶条件优化及酶学性质研究的开题报告
产脂肪酶真菌的分离鉴定、产酶条件优化及酶学性质研究的开题报告一、研究背景随着人们生活水平的不断提高，高脂肪食品的消费量逐渐增加。
而高脂肪食品的长期摄入容易导致人体各种代谢疾病的发生，如肥胖、高血脂、心脑血管疾病等。
因此，研究开发高效、环保的脂肪降解酶已经成为了当前生物技术领域的热点。
真菌是脂肪酶的主要产生菌种之一。
目前已经分离出多种产脂肪酶的真菌，并在饲料、乳制品、面包等食品工业中得到广泛应用。
然而，目前已知的产脂肪酶真菌种类还很有限，而且其酶学性质和产酶条件也需要进一步的研究和优化。
因此，本课题将通过对自然环境中的微生物进行筛选和鉴定，分离出一株高效产脂肪酶的真菌，并对其产酶条件和酶学性质进行研究和分析，以期为生产上的应用提供科学依据和技术支持。
二、研究内容和方法1. 真菌的分离鉴定本研究将从自然环境中采集样本，通过板培法、毛细管扩散法等方法筛选出能够产生脂肪酶的菌种，并通过形态学、生理生化、分子生物学等方法进行鉴定和分类。
2. 产酶条件的优化通过单因素试验和正交试验等方法，对影响真菌产酶的因素进行优化，如温度、pH值、培养基成分、培养时间等。
3. 酶学性质的研究将分离出的真菌进行大量培养，提取纯化脂肪酶，并进行酶学性质的分析和研究，如酶的催化效率、热稳定性、pH稳定性、底物特异性等。
三、预期结果本研究预计可以成功分离出一株高效产脂肪酶的真菌，并通过优化培养条件、提高酶的活性和稳定性等手段，进一步提高其产酶能力和应用价值。
同时，对其酶学性质和催化机理的深入研究也将为其在工业生产中的应用提供科学依据和技术支持。
四、研究意义本研究将为开发高效、环保的脂肪降解酶提供新的思路和方法，并为其在食品、医药、生物燃料等领域的应用提供技术支持和料源基础。
同时，通过研究其催化机理和特异性等酶学性质，也将为更深入地理解生物催化反应的本质提供新的思路和方向。
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第五期
酿
酒
2014
吸光度 /OD520
α- 萘酚溶液的浓度 /μmol·L-1 图 1 α- 萘酚标准曲线
2.2 菌株形态特征 镜检特征见图 1，菌丝有隔膜，多核，分枝甚微，
且不规则。细胞幼时含有颗粒，老后含空泡及油滴， 菌丝体不产生与营养菌丝有区别的分生孢子梗。分 生孢子着生在菌丝及分枝的顶端，单生，2~6 个成 链，呈倒梨型 8~12μm×8- 11μm；闭囊壳单生在似 柄的菌丝上，直径（25-）45- 60（- 70）μm，分生孢子 闭囊壳内散生着子囊，子囊球形。成熟子囊果直径 在 60μm 左右，发育中的闭囊壳和分生孢子极多， 根据根据真菌鉴定手册描述[12]，初步判断该菌株属 于红曲属(Monascus)。
第 41 卷 第 5 期 2014年9月
文章编号:1002- 8110（2014）05- 0042- 06
酿酒 LIQUOR MAKING
Vol.41.№.5 Sep.， 2014
一株产酯化酶菌株的分离鉴定及产酶 *
王晓丹 1，3，李付丽 1，4，胥思霞 2，班世栋 1，3,王荣村 2，沈锡翠 2,吴鑫颖 1，4,邱树毅 1，4**
with morphological characters,cultural characteristics,physiological and biochemical characteristics and molecular methods to identify
it.The strain monascus FBKL3.0018 was identified as Monascuspurpureus.The strain is a high esterifying ability,it can be applied to
肪酸酯的生物合成有关。对大曲而言，酯化力是反 映大曲质量优劣的重要指标之一。己酸乙酯是浓香 型白酒的主体香味成分，其含量高低直接影响白酒
显示出巨大的潜力，它不但可催化合成甘油脂肪酸 酯 ，而 且 还 能 合 成 其 他 酯 类 [3- 4]，细 菌 、霉 菌 、酵 母 的 许多种属均能分泌催化合成己酸乙酯的胞外脂肪酶[5]，
WU Xin-ying1,4，QIU Shu-yi1,4**
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guiyang, Guizhou,550025,China；
2.Guizhou Green liquor Co.,Ltd, Zhenyuan, Guizhou,557702,China； 3.College of LifeSciences, Guizhou University, Guiyang ,Guizhou,550025,China； 4.School of Liquor-making and Food Engineering, Guizhou University,Guiyang,Guizhou,550025,China)
移取 0.25mL 酯化酶液(10 倍稀释)，加入 pH=6. 5 磷酸缓冲液 4.25mL、然后加入 0.25mL 0.006mol/L α- 乙 酸 萘 酯 溶 液 ， 于 40℃ 恒 温 水 浴 定 时 反 应 5min，然后加入 0.25mL 3.0%SDS 水溶液终止反应， 再加入 0.25mL 0.02%的固兰 B 盐溶液显色，混匀计 时 30s 时加入 0.25mL 1∶1 的盐酸溶液混匀使显色 稳定。以酶液换成蒸馏水其它不变作空白。
(10μM) 各 0.5μL，dNTP mix (10Mm each)0.5μL， 10*Taq reaction Buffer 2.5μL，Taq (5u/μL)0.2μL， 加 水 至 25 μL。 PCR 反 应 程 序 为 ： 预 变 性 94℃ 5mim;循环 94℃ 30s, 55℃ 35s, 72℃ 1min, 35 个 循环 ，延伸 8min。PCR 产物测序经上海生工生物工 程有限公司完成。 1.3.4 系统发育分析：根据测序结果，在 NCBI 上使 用 BLAST 程序从 GenBank 数据库中搜索有关种的 公认 18S rRNA 标准序列数据，用 ClustalX 1.8 进行 多序列对比分析，利用 MEGA 4.0 构建系统发育 树[8]。 1.4 固体发酵培养
中图分类号：TS262.3；TS261.15
文献标识码：B
Identification and Enzyme Production of the Strain Producing Esterifying
Enzyme*
WANG Xiao-dan1,3, LI Fu-li1,4,XU Si-xia2, BAN Shi-dong1,3,WANG Rong-cun2,SHEN Xi-cui2,
的品质。浓香型大曲酒中己酸乙酯的生成，由于受 到底物浓度和作用条件的制约，生成周期较长[1],酶 法合成己酸乙酯具有反应条件温和、转化率高、副
应用微生物酯化酶催化合成含己酸乙酯的香酯液可 用于浓香型白酒提高酒质, 为浓香型白酒优质高产 提供了一条有效途径[6]。
* 基金项目：黔科合重大专项[2010]6004 号；科技部科技支撑计划项目课题（2011BAC06B12） 收稿日期：2014- 05- 26 作者简介：王晓丹（1980- ），辽宁人，博士生，主要从事应用微生物学研究。 ** 通讯作者：邱树毅，博士生导师，syqiu@。
术筛选得到产酯化酶的红曲霉 FBKL3.0018，根据形态特征、培养特征、生理生化特征并结合分子生物学方法进
行鉴定。结果鉴定菌株 FBKL3.0018 为红曲属的紫色红曲霉(Monascuspurpureus)。菌株的酯化力较高，可用于生
产酯化酶制剂和高酯化大曲等。
关键词：浓香大曲，酯化酶，鉴定，红曲霉
produce esterifying enzyme preparation and Daqu high esterifying ability.
Key words:luzhou-flavor daqu,esterifying enzyme,identification, monascus
酯化酶是脂肪酶和酯酶的统称，它与短碳链脂 产物少等优点[2]，目前脂肪酶的逆反应酯化的研究已
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第五期
王晓丹，等：一株产酯化酶菌株的分离鉴定及产酶 *
2014
本研究选用产酯较多的浓香型大曲进行菌株的分 离筛选。筛选出己酸乙酯合成能力强的酯化酶生产 菌株，根据其形态特征、培养特征，并结合分子生物 学方法对菌株进行鉴定。鉴定菌株 FBKL3.0018 为 红曲属的紫色红曲霉(Monascuspurpureus)，生理生化 测定结果表明其酯化力较高，可用于生产酒类香酯 液，弥补浓香型白酒的局限，提高浓香型大曲酒的 质量。 1 材料与方法 1.1 菌株
取 0.1g 含菌样品，置于装有无菌水的三角瓶 中，充分振摇，取 0.1mL 菌液，涂布于含麦芽汁培养 基的琼脂平板上，经 30℃培养 72h，平板上长出各 种菌落，转移到试管斜面上培养，将纯种转接入装 有 40g 麸皮的麸皮培养基中，31℃堆积培养 24h，待 布 满 菌 丝 后 打 散 ， 之 后 每 隔 8h~12h 扣 瓶 一 次 ， 72h~84h 培养结束后，40℃通风干燥供产酶性能的 测定。 1.5 酶活力的测定 1.5.1 液化力测定：30℃碘液褪色法[9] 1.5.2 蛋白水解力的测定：沉淀法[10] 1.5.3 糖化力的测定：费林氏法[10] 1.5.4 红曲酯酶活力测定
酶活力定义：40℃15min 水解醋酸 - α- 萘酯产 生 1.0μmol α- 萘酚所需的酶量为 1 酶活力单位 (U)。
用 TU- 1909 紫外分光光度仪在 450~650nm 波 长对固兰 B 与 α- 萘酚形成的络合物进行光谱扫 描得到如下曲线图，在 542nm 处有最大吸收峰。选 择 542nm 为最佳测定波长。绘制 α- 萘酚标准曲线 如图 1
红曲霉 FBKL3.0018，贵州某企业浓香型大曲中 分离得到，接种于麸皮浸出液培养基， 1.2 主要仪器及试剂
安捷伦 6890N 气相色谱仪 （美国安捷伦公司） YS100 光学显微镜 (日本尼康) ；PCR 反应扩增仪 （加拿大 BBI 公司）；3730 测序列分析仪( 美国 ABI 公司)；DYY- 8 型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪 器有限公司）；H6- 1 微型电泳槽 （上海精益有机玻 璃制品仪器厂）；凝胶成像系统 （Gene Genius 公 司）；U- 3010 紫外 - 可见分光光度计(Hitachi 公司)。 麸皮，河南省台前县兴隆面粉有限公司提供，其他 常规试剂均为国产或进口分析纯。 1.3 菌种鉴定 1.3.1 培养特征：将纯化的菌株在查氏培养基（CA）， 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），麦芽汁琼脂培养 基 （MEA），麸皮浸出液培养基 4 种培养基上培养 7d，观察菌落外观形态，菌丝生长情况，显微镜观察 菌丝体大小、形状、分生孢子等。 1.3.2 生理生化特性：糖发酵基础培养基、碳源同化 基础培养基、氮源同化基础培养基。在培养基上 30℃培养 7d 后观察结果。参考文献中[12-13]对菌株进 行生理生化鉴定。 1.3.3 菌株的分子鉴定：菌株 FBKL3.0018 取菌丝体 接种于麸皮浸出液培养基中，培养 3d，收集菌丝体， 按照文献[7]提取基因组 DNA，以提取的真菌 DNA 作 为模板，用真菌通用引物扩增 18S rDNA 序列。NS1 （5′ GTAGTCATATGCTTGTCTC 3′） 及 NS6（5′ GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC3′）为 引 物 扩 增 供 试 菌 的 片 段 。 在 25μL PCR 反 应 体 系 中 含 有 Template（基 因 组）1 μL，引 物 NS1 (10 μM)和 NS2