一种长期培养人神经干细胞的新方法

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人体诱导多能干细胞技术在精神分裂症研究中的应用现状与展望

-1092-国际精神病学杂志JOURNAL OF INTERNATIONAL PSYCHIATRY2020年第47卷第6期人体诱导多能干细胞技术在精神分裂症研究中的应用现状与展望徐书琦万瑾凌王学义王冉【摘要】诱导多能干细胞（iPSCs）技术作为现下的一个热门领域，提供了一种用以体外模拟神经系统发育过程的工具。

本文中综述了应用精神分裂症（SCZ）患者来源iPSCs模型在精神分裂症领域中的研究进展，通过hiPSCs建立SCZ模型以期阐明这类复杂遗传性精神疾病的发病机制，并提出iPSCs在诱导产生神经元方面的挑战及对未来研究前景的展望，以期实现疾病的早期干预及个体化治疗。

【关键词】诱导多能干细胞；精神分裂症；神经细胞模型【中图分类号］R749.3【文献标识码】A【文章编号］1673-2952（2020）06-1092-05◎综述◎Summarize精神分裂症（Schizophrenia,SCZ）是一种复杂的精神疾病，由环境、遗传等多种因素共同致病，然而，SCZ的确切病因和影响因素还不十分明确，其发病机制仍处于探索阶段。

在众多因素中，遗传因素最具影响力并具有强有力的支撑。

基因变异以及微效基因叠加作用都可能影响SCZ的发病。

因此，识别基因特征和生物学信号对SCZ的发展具有重要作用。

2006年，日本科学家Takahashi从胚胎十细胞及肿瘤细胞特异表达的候选转录因子中筛选出4种转录因子（Oct3/4、Sox2、c-Mye和Klf4）,在ES细胞培养条件下，将小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠尾尖成纤维细胞诱导为小鼠iPSCs,并利用这4种转录因子成功将人成纤维细胞诱导为人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells,hiPSCs）〔5iPSCs的成功培养及分化第一次证明人类体细胞有被重新诱导至多能干细胞的潜力.通过获得同种基因型的患者来源的细胞建立iPSCs能在细胞水平上反映临床诊断的异质性，并可避免人类胚胎干细胞涉及的伦理道德及法律的争议。

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定方庆;朱庆丰;尹国才;陈新生【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2012(9)27【摘要】Objective To explore the methods of isolation, cultivation and differentiation of human fetal neural stem cells, and to observe the characteristics of proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro. Methods The neural stem cells were isolated from human fetal hippocampus at embryonic age 14 weeks by induction of labor with water bag. A serum free medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) was used to cultured and expanded neural stem cells. The cells were cultured, passed and differentiated. Cultured and differentiated cells were identified with immunofluorescence test. Results The human neural stem cells having the abilities of self-renew and multipotency were successfully isolated and cultured from human fetal brain with serum free medium. They were found to form typical neurospheres in suspension and express Nestin antigen. The cells could be amplified and passed continuously. Neural stem cells were induced to differentiate and express specific antigens of neuron and astrocyte in serum medium. Conclusion The neural stem cells isolated from human fetal brain have the abilities of self-replication, multipotency and amplification in vitro. It has useful appliacation in further basic and clinicalresearch.%目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点.方法采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定.结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原(Nestin);在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原.结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究.【总页数】3页(P19-20,24)【作者】方庆;朱庆丰;尹国才;陈新生【作者单位】安徽医科大学附属安庆医院神经外科,安徽安庆,246003;安庆师范学院生命科学系,安徽安庆,246003;安庆师范学院生命科学系,安徽安庆,246003;安徽医科大学附属安庆医院神经外科,安徽安庆,246003【正文语种】中文【中图分类】R421【相关文献】1.人胎肝间充质干细胞体外分离培养和生物学鉴定 [J], 何念海;赵文利;王宇明2.人胎肝干细胞体外分离、培养及鉴定 [J], 高沿航;李玉林;李艳茹;吴珊;全成实;王芯蕊;张丽红3.人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究 [J], 巨容;杜江;兰和魁;王斌;封志纯4.人胎儿骨髓基质干细胞的分离、体外培养和鉴定 [J], 陈金武;吴军正;张军;李焰;刘斌5.人胎肝干细胞的体外分离培养与鉴定 [J], 毛海洲;陈耀凯;王宇明;张磊;刘国栋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

生命科学中的iPS细胞技术

生命科学中的iPS细胞技术人类对于身体的理解和探索一直都是科学的一大重点，科学家们不断地通过不同的方法来探索生命的奥秘。

随着生命科学的不断发展，新的技术不断涌现。

而iPS细胞技术则是生命科学领域最重要的技术之一。

iPS细胞全称是诱导性多能干细胞，是一种新型的干细胞。

它是人类成年细胞重新编程而来的，通过某些特殊因素的作用，将细胞重新转化为具有多能性的细胞。

iPS细胞可作为一种新的来源，用于研究和治疗各种疾病。

iPS细胞技术的起源可以追溯到2006年，当时研究人员发现一些特殊的基因可以重新编程成干细胞，并获得了多个生物学奖项。

经过多年的研究，iPS细胞的应用逐渐扩大，已经成为生物科技领域的重要进展之一。

作为一种新的干细胞，iPS细胞有着广泛的用途。

在生命科学领域，它可以用于研究各种疾病的病理生理机制，以及评估药物的安全性和有效性。

在临床实践中，iPS细胞技术可以用于治疗各种疾病，如心脏病、癌症、神经退行性疾病等。

在疾病治疗方面，iPS细胞技术的应用有着广泛的前景。

疾病治疗方面的研究表明，iPS细胞可以通过向患者的身体内注入重新编程的细胞来治疗一些疾病。

例如，患有心脏病的患者可以通过iPS细胞技术产生自己的心血管细胞，这些细胞可以用于替代患有心脏病的组织，从而修复受损的组织。

除此之外，iPS细胞技术还可以用于治疗神经退行性疾病，如帕金森症和脊髓灰质炎。

通过iPS细胞技术，研究人员可以重新编程成脑细胞，这些细胞可以用于修复受损的神经组织，缓解疾病的症状。

虽然iPS细胞技术的应用前景很大，但是目前它仍然存在一些限制。

例如，iPS细胞的品质对于研究和治疗具有至关重要的作用。

目前，研究人员还无法完全精准地判断新的iPS细胞的质量，这也会对其应用造成一些影响。

此外，iPS细胞技术的成本也是一项限制因素。

目前，iPS细胞的制定和培养过程较为复杂且耗费时间较长，这也增加了制定的成本。

因此，在广泛应用iPS细胞技术之前，这些问题需要得到解决。

一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810804437.9(22)申请日 2018.07.20(71)申请人东南大学地址 211102 江苏省南京市江宁区东南大学路2号(72)发明人陈陆馗　张桂龙　(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204代理人孙斌(51)Int.Cl.C12N 5/10(2006.01)C12N 15/867(2006.01)(54)发明名称一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法，该方法包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L -myc基因的重组慢病毒载体；(3)对上述重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)选取合适浓度病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。

本发明永生化细胞系的制备方法是一种新的稳定且安全有效的永生化编码策略；制备的永生化人源神经干细胞系具有原代神经干细胞的所有生物学特征，同时也具有正常的三系分化特性，可以成功分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，同时该细胞系的生长速度及成神经球的能力较原代细胞强，成功传代20代以后依然可以快速增殖，并且无致瘤性。

权利要求书1页说明书9页序列表2页附图8页CN 108866005 A 2018.11.23C N 108866005A1.一种永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L -myc基因的重组慢病毒载体pLenti -EF1a -EGFP -P2A -Puro -CMV -MYCL -3Flag；(3)对重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)采用慢病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。

2.根据权利要求1所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述分离培养原代人海马来源神经干细胞的具体步骤为：(A)收集自然流产终止妊娠的3月胎儿脑组织；(B)显微分离获取海马，浸于培养基中，用显微剪剪碎海马组织，随后胰酶消化，离心，用完全培养基重悬，过滤网，分瓶培养，换液传代；(C)取第1代神经干细胞鉴定Nestin、Sox2、Musashi1的Marker表达，以及诱导分化后分化为三系--神经元、星形神经胶质和少突胶质细胞分别鉴定Tuj1、GFAP、MOG的Marker表达。

干细胞最新突破消息,干细胞有什么用途,注意利弊

干细胞最新突破消息，干细胞有什么用途，注意利弊干细胞新突破消息，干细胞有什么用途，注意利弊！在现代医学的探索中，干细胞技术的发展不仅令人兴奋，也带来了前所未有的可能性。

干细胞疗法是一种具有自我复制和多向分化潜能的细胞，它们可以分化为人体中任何类型的细胞，如肌肉细胞、神经细胞或肝细胞等。

那么，干细胞有什么用途呢？干细胞可以帮助治多种病：例如，对于心脏病患者，干细胞可以对于新的心肌细胞生长，心脏功能；对于糖尿患者，干细胞可以生成新的胰岛细胞，帮助调控血糖；对于帕森病患者，干细胞可以生成神经细胞，缓解症状。

此外，干细胞疗法可以提高人体的免疫、减缓衰老过程、并可以用于美容领域！需要注意的是，虽然干细胞疗法有诸多好处，但也存在一些风险。

研究发现，越是能变化多端的干细胞，其致瘤性也越大，面对的伦理困境也越大，我们也不能忽视其可能带来的副作用。

干细胞副作用可以从两个层面来考虑：一是与移植过程有关的技术问题，二是生物学反应引发的副作用。

在技术层面上，任何操作都存在风险，包括感染、出血以及麻晬相关的风险等。

而在干细胞操作中，如何精确地将干细胞定位到受损区域，也是一大挑战。

如果不能准确地达到目标区域，可能会导致效果不佳甚至产生新的问题。

Stem cell side effects can be considered from two levels: one is the technical problems related to the transplant process, and the other is the side effects caused by biological reactions. On a technical level, there are risks associated with any operation.从生物学角度来讲，干细胞可能导致副作用主要涉及免疫反应和肿瘤形成。

当体内植入异体干细胞时，患者的免役系统可能会将其视为外来入侵者，并发起攻击，这就可能发生免役排斥反应。

人胚皮层神经干细胞培养方法的探讨(简报)

人胚皮层神经干细胞培养方法的探讨（报）简
任萍１关云谦１张，２・ｚ愚・
１０５）００３（首都医科大学宣武医院细胞治疗中心，－北京１０５；教育部神经变性病重点实验室，京００３北
原代培养的目的［。由于人胚组织来源有限，引而且人
胚神经细胞特别是皮层神经细胞对缺血、氧和损缺伤非常敏感，如何在完全分离细胞的同时减少细胞死亡率成为影响实验成败的关键问题；本实验进一步对两种常用基础培养基对神经干细胞成球的作用进行了比较，采用两种消化酶进行传代。索并探
元或神经胶质细胞分化的未分化或低分化细胞［。１．
３ ℃消化１ｎ离心后ＤＭ／１７０ｍｉ，ＭＥＦ２完全培养基重悬，吸管吹打及过滤步骤同上。以２１Ｓｌ度接ｘ０／密ｍ种于２４孔板中，于３ ℃ ５Ｏ孵箱培养，每３４７％Ｃ — 天半量换液，观察神经干细胞生长状况。收集神经球进行克隆及传代实验。克隆实验：收集ＤＭ／１全培养基培养ＭＥＦ２完ｌ的神经球，４天胰蛋白酶消化后ＨａｋＳｎ液洗一遍，均分两份．分别添加ＤＭＦ２完全培养基和ＭＥ／１Ｎｕｏａａ完全培养基（７ｅｒｂｓｌ养基、％ｅｒｂｓｌ９％Ｎｕｏａａ培２无血清培养基添加剂Ｂ７ｌ２、％青链霉素、０ｇｌ２１／￣ｍｂＧ及２１／ｌＧ）重悬，ａｔｒ打散成单细ＦＦ０ｇｍＦ￣ＥＰｓｕ管ｅ胞悬液，以４０／ｌ０ｍ接种于９板中，ｈ后记录每６孔４

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

【ｂｔｃ０ｊｃｉｏｅｐｏｅｍｔｄｏｉｌｉ，ｕｉｔｎａｄｄｆｅｔｔｎｏｕａｔｅｒｌｔｅｓＡｓａｔｂｅｔｅｘｌｅｔｅｏｓｆｓａｏｃｌａｏｎｉｅｎａｏｆｍｎｆａｎｕａｓｍｃｌ，ｒ】ｖＴｒｈｈｏｔｎｔｉｖｆｒｉｉｈｅｌｅｌ
ｓｒｍｆｅｍｅｉｍｃｎａｎｎａｉｆｒｂａｔｒｗｈｆｃｒ（Ｆ）ｎｐｄｒｌｒｗｈｆｃｏ（Ｇ）ａｓｄｔｕ— ｅｕｅｄｕｏｔｉｉｇｂｓｂｏｌｓｇｏｔｔｈＧＦａｄｅｉｅｍａｇｏｔａｔｒＥＦｗｓｕｅｏｅｌｒｃｉａｏ
ＦＮｉｇＨＵＱｎｆＹＮＧｏａＣＥｉｈｎＡＧＱｎＺｉｅｇｎｌｕｃｉＨＮＸｎｅ￣２ｓ
１ＤｅａｔｎｆＮｅｒｓｒｅｙＡｎｉｇＨｏｐｔｌＡｆｉａｅｏＡｎｕｄｃｌＵｎｖｒｉ，Ａｎｕｒｖｎｅ．ｐｒｍｅｔｏｕｏｕｇｒ，ｑｎｓｉｆｉｔｄｔｈｉＭｅｉａｉｅｓｔａｌｙｈｉＰｏｉｃ，Ａｎｉｇ２６０，ｑｎ４０３
Ｃｈｎ；．ｐｒｍｅｔｏｉｃｅｃｓｉａ２ＤｅａｔｎｆＬｆＳｉｎｅ，ＡｎｉｇＮｏｍａｉｅｓｔ，Ａｎｕｏｉｃ，ｑｎ２６０，ｉａｅｑｎｒｌＵｎｖｒｉｙｈｉＰｒｖｎｅＡｎｉｇ４０３Ｃｈｎ
２２９第卷２０年月９第７１期
・论
著・
人胎脑神经干细胞的体外分离、养与鉴定培

2024年的干细胞疗法

适应症与禁忌症
适应症
干细胞疗法适用于多种疾病的治疗，如白血病、再生障碍性贫血、帕金森病、心肌梗死、糖尿病等。同时，对于一些难以治愈的疾病，如脊髓损伤、脑卒中等，干细胞疗法也展现出了良好的应用前景。
禁忌症
尽管干细胞疗法具有广泛的应用前景，但仍存在一些禁忌症。例如，对于患有严重感染、恶性肿瘤、严重心肝肾功能不全等疾病的患者，以及孕妇和哺乳期妇女等特殊人群，应谨慎使用或避免使用干细胞疗法。
2024年的干细胞疗法
汇报人：XX
2024-01-12
• 干细胞疗法概述 • 2024年干细胞疗法研究进展 • 临床应用领域拓展 • 技术创新与挑战 • 政策法规与伦理道德问题探讨 • 未来发展趋势预测
01
干细胞疗法概述
定义与发展历程
定义
干细胞疗法是一种利用干细胞的自我更新和分化潜能来治疗疾病的方法。
肿瘤形成风险
对于干细胞可能具有的肿瘤形成风险，可以通过严格的质量控制、选择安全的干细胞来源、控制干细胞的增殖和分化等方式来降低风险。
03
技术标准和监管政策
制定统一的技术标准和监管政策，规范干细胞疗法的研发和应用流程，
确保干细胞疗法的安全性和有效性。同时加强国际合作与交流，共同推
动干细胞疗法的发展和应用。
发展历程
自20世纪60年代发现干细胞以来，干细胞研究逐渐成为生物医学领域的热点。随着技术的不断进步和临床应用的不断拓展，干细胞疗法在2024年已经取得了显著的成果和广泛的应用。
干细胞类型及功能
类型
根据来源和分化潜能的不同，干细胞可分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞等。
功能
干细胞具有自我更新、多向分化和免疫调节等功能，可以用于治疗多种疾病，如血液系统疾病、神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病等。

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均购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；肝素钠和胰酶抑制剂购自美国
１．２．６神经球细胞爬片的制备和分化鉴定
取培养３０个
Ｓｉｇｍａ公司；庆大霉素购自上海现代哈森（商丘）药业有限
公司；其他实验材料有巢蛋白、多聚赖氨酸、维生素Ｅ、腐胺、亚硒酸钠、人转铁蛋白、黄体酮、Ｌ．谷氨酰胺、维生素Ｃ葡萄糖苷。１．２方法
体酮、３００ｍｇＬ．谷氨酰胺、２０ＩｘｇｒｈＥＧＦ、２０岭ｒｈｂＦＧＦ、５０ｍｇ维生素Ｃ葡萄糖苷、４００００ＩＵ庆大霉素，混匀。１．２，２神经于细胞的分离取孕１６周的人流胎儿脑组
下观察结果并记录照相。
１材料和方法
１．１材料ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：Ｉ）培养基购自美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；重组人表皮细胞生长因子（ｒｈＥＧＦ）、重组人碱性成纤维细胞
生长因子（ｒｈｂＦＧＦ）、Ｂ２７添加剂、Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＴＰ．ＥＤＴＡ
中国医药生物技术
２０１７年４月第１２卷第２期
ＣｈｉｎＭｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ａｐｒｉｌ２０１７，Ｖｏ１．Ｉ２，Ｎｏ．２
ＤＯＩ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１６７３ — ７１３Ｘ．２０１７．０２．０１７
基，加入５．９ｇ４．羟乙基哌嗪乙磺酸（ＨＥＰＥＳ）搅拌均匀，制成基础培养液，使溶液ｐＨ值控制在７．０～７．１，分别加
２结果
２显微镜下观察，大多为单个圆形亮球状，没有细胞突起，折光性好。培养２～３ｄ后，形成
１．２．１培养基配制取１０００ｍｌＤＭＥＭ／Ｆ．２（１：１）培养
月的神经干细胞球，直接吹打或用０．２５％ＴＰ．ＥＤＴＡ溶液消化制成单细胞悬液。细胞计数后以５× １０４／片密度种于经１００ｍ［Ｉ１１多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，在ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基中添加２％胎牛血清，Ｂ２７添加剂（１：５０稀释），撤除生长因子（ＥＧＦ、ｂＦＧＦ）进行分化培养。８ｄ后进行免疫荧光细胞化学染色。荧光显微镜下观察并记录照相。
前，神经干细胞的获取途径主要是从多个胚胎或流产胎儿中分离并进行有限的培养扩增，但胚胎或胎儿源的贫乏及各胚胎或流产胎儿之间的差异性使得神经干细胞来源混杂，无法
达到标准化，成为神经干细胞临床化的重要限制因素。本实验从流产胎儿中分离出神经干细胞，并在体外长期规模化培养、扩增，为神经干细胞的研究提供稳定的、用之不竭的细胞来源，为临床神经干细胞移植奠定基础。
多个细胞组成的细胞团，形状不规则，大小不一。１０ｄ以
入２００ｇ肝素钠、３Ｏ维生素Ｅ、２５ｍｇ重组人胰岛素、１．６ｍｇ腐胺、６ｂｔｇ亚硒酸钠、５．５ｍｇ人转铁蛋白、７黄
入新的培养瓶中，并加入一半新配置的培养液，按１：２或
陈世明，章瑾，宣丹英，毛钟鸣，陈鹏翱
力和多向分化潜能。神经干细胞的移植对治疗神经系统的损伤和神经退行性疾病都有直接或间接的作用Ｗ３１，临床研究和应用对神经干细胞的需求日益迫切。但由于技术原因，神经干细胞在体外的培养存在易分化和易死亡的技术难题。目
者１：４比例分瓶传代培养。按这种方法可以连续扩增培养人神经干细胞２年以上。
１．２．５神经干细胞球的鉴定
取连续培养３０个月的神经
干细胞球悬液滴于经多聚赖氨酸包被的盖玻片上，置３７℃ 培养箱中培养２４ｈ，使细胞黏附于载玻片上。室温下４％多聚甲醛和Ｏ－３％戊二醛固定１５ｍｉｎ。ＤＰＢＳ缓冲液漂洗３次后，用含５％正常山羊血清的ＤＰＢＳ（含０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）在３７℃ 温育３０ｍｉｎ进行封闭。吸去封闭液，加抗人巢蛋白单克隆抗体，３７℃ 温育３ｈ后，用含０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ．１００的ＤＰＢＳ漂洗３次，各１０ｍｉｎ。加偶联Ｒｏｄａｍｉｎｅ的第二抗体，３７℃ 温育４５ｍｉｎ。吸去第二抗体反应液，用ＤＰＢＳ漂洗３次，用封片液封片，荧光显微镜
一
・
技术与方法・
种长期培养人神经干细胞的新方法
神经于细胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）具有自我更新能培养２Ｏ～３０ｄ，神经干细胞球直径为５００ —１０００ｖｒｎ时，
把含有干细胞球的培养基用２００ｍｌ注射器吸出，经干细胞球切割器（不锈钢筛网）切割，将每个大的神经干细胞球切割成３～８小块（直径３０～２００ｏｍ），将小块干细胞球放