神经干细胞的培养

合集下载

大鼠神经干细胞分离和培养的实验研究

一44一重庆医科大学学报2∞8年第33卷增刊l(J oum aI of C h ong qi ng M ed i caI U n．vers i ty2∞8．V o|．33No．s1)基础研究文章编号：0253—3626(2008)sl—0044—04大鼠神经干细胞分离和培养的实验研究何梅-，王学峰，马珊珊：，席志芹(1．重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆400016；2．山西医科大学第一附属医院神经内科，太原030001)【摘要】目的：探索体外培养大鼠神经干细胞(N eur al st e m ceus，N s cs)的方法和实验条件，建立一种较为可靠的神经干细胞培养方法。

方法：分别选取孕14～16ds D胎鼠和新生1d的sD大鼠进行神经干细胞培养，采用单纯机械吹打和机械吹打加酶消化丽种方法进行消化，对培养出的细胞进行神经干细胞、神经元、神经胶质细胞的免疫细胞化学和免疫荧光鉴定。

结果：用2种来源的大鼠培养出的原代细胞，均表达N es t i n，诱导分化后的细胞表达G FA P和M A P-2。

结论：大鼠神经十细胞的原代分离与培养的关键是单细胞悬液的获得，消化液浓度太高或消化时间太长，容易因消化过度致细胞损伤甚至死亡。

胎鼠来源者神经球形成早，数量多。

增殖活力更强，但原代取材过程易被污染。

新生鼠来源者鼠源易获得，组织取材过程操作简单，但神经干细胞成球率低。

【关键词】神经干细胞；细胞培养；免疫荧光；免疫生化【中国图书分类法分类号】R74l【文献标识码】A【收稿日期】2007一08—29St udV on i soI at j on and cul t ur e O f neur aI s t em C e¨s f r O m r at br ai nH E M ei．e￡击0D epdr t m em《N e酣ol ogy，t k F订st A航l谴ed H ospi斌，C hongqi唱M ed记击U n洳er s畸)【A bst ract】O巧ec渤e：To es讪l i s h岫m em od of cul t ur i ng neur al哟m ceus(N s cs)妇n ra t brai n．胁跏ds：E14～16sD吣一br yoni cm￡brai n粕d pos t nat aJ one—da y(P1)r a t br aj n w e r e r es pecti vel y ch ose t o cul t l l r e ne u m l st e m ceU s，an d t’帕diges t ive m et h—ods t}l at s i m pk m e ch肌i ca l di ges t i on a nd m e chan i ca l com bi ned诵t}l che m i c al diges t主on w e r e u8ed t o det e兀ni ne t l l e bes t condi—t ions i n pr i m ar y cuhur e．I m m un∞yt oc hem i st I y and i m m u noⅡu or e sce nc e w er e us ed t0i dent i母N SC s，ne urons a nd neum di al cel l s．R8s饿捃：B o t h t l l e pri m a巧ceu s f r o m t w o dⅢbr ent ki nds0f ra t bm i ns ex pr es sed nes ti n aJ l t i g en粕d t}l e di任br en t i ated cel l s ex—pr e ssedG F A P锄d M AP一2明t i gen．∞似砌6s暮D竹：ne key poi nt of pr i m ar y N SC s cul t ur e w鹊obt ai ni ng t he m on叩l鹊t s u叩ens i on．0ver di gest i on l ed t o c eu i nj u r y ev en de am．N SC s舶m em br yoni c ra t br ai n had bet t er pm l i f er at i on abi l i t y粕d co ul d f0肌ceⅡcl ones ea r l i er粕d m or e t}I an N SC s f南m new b om E a t br ai n，but t11e y w e r e e鹊i er t o be contam i nat ed．0h t ai n i ng new b om m t bm i n锄d i sol ati on N SC s舶m new bom ra t br ai n w er e e鹊i er，b ut N SC s舶m new bom ra t br ai n had w o璐e pm l如m t i on abi l吼【K ey w or ds】N eur al st e m ce ns；ceu cu l t u r e；I m m un onu or esc enc e；I m m uno cyt o che m i st r yN S cs是一种原始的未分化细胞，它有和成熟神经细胞相同的基因，且具有自我增殖和多向分化的潜能，神经干细胞研究是21世纪生命科学研究的重要领域。

海马神经干细胞的分离、培养与鉴定

显示神经元、状胶质细胞、星寡树突细胞抗原阳性。结论：海马分离出的细胞具有自我更新、殖和分化能从增
力，神经干细胞。是
关键词神经干细胞海马大鼠细胞培养
分类号Ｒ７１０４．５
维普资讯
第１２卷第１９期２００２年ｌＯ月
中国现代医学杂志Ｃｈｎｏｍ￣ｏｏｅｎＭｅｉｉｉａＪｕｆＭｄＦｄｃｎｅ
Ｖｏ．２Ｎｏ．９１１１０Ｃ．２０ｔ０２
ＩＯＬＡＴＩＮ．ＳＯＣＵＬＴＵＲＥＡＮＤＤＥＮＴＩＣＡＴＩＮＦＮＥＵＲＡＬＩＦＩＯＯＳＴＥＭＣＥＬＬＳＩＲＡＴＳ’ ＨＩＮＰＰＯＣＡＬＭＰＵＳ
ＬｉｕＢａｉａｎ，ｉｇｑｙＬｉＸｎｕｎ，ａｎＺｈｇｈｕｘｉ，ｅ．ａａｎｔａ１
个克隆进行连续传代培养，免疫组化检测ｎｓｉ原和分化后神经细胞特异性抗原。结果：海马获得的用ｅｔｎ抗从
细胞群能够连续传代，离后的单个细胞能形成事迹球，疫检测为ｎｓｉ性；外、内分化的细胞分别分免ｅｔｎ阳体体
［ｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｏｉｌｔｎａｄｉｅｔｉｔｎｏｅｒｌｔｍｅｓｉｒｔ’ ｉｐｃｌｕ．ｔｏｓＣｌＡｓｃ］ｊｃｉ：ｏａｉｎｎｉｃｉｆｕａｓｃｌａｓｈｐｏａｍｐｓＭｅｈｄ：ｅｓｒｖｓｏｄｆａｏｎｅｌｎｌ

嗅鞘细胞与神经干细胞共培养后增殖及向神经元的分化

，
。ＤｅｐｒｍｅｎａｔｔｏｆＮｅｏｏ，ｉｍｕｉｕｒｌｇｙＪａｓＵｎｉｅｓｔ．ｉｍｕｖｒｉＪａｓｉｙ１４０２．０Ｈｅｉｎｇｉｎ５ｌＪｇｏａＰｒｖｎｃ．ｏｉｅＣｈｉａ；ｎＴｈｒｐｒｍｅｔｏｉＤｅａｔｎｆｄ
．
Ｈｉｎｊｎｅｌｇｉｇｏａ
Ｐｒｖｎｅ．ｉａｏｉｃＣｈｎ
１０”／１ｘＬＯＥＣｓｇｏｐＡｔａｙｆｒｃ－ｕｔｒｔｅｐｒｅｔｅｏｅｒｎｓｉｒｕ．ｄｓａｔｏｃｌｅ．ｈｅｃｎａｇｆｎｕｏ７ｅｕｍｍｕｎｓａｉｎｅｌｓｓｇｉｃｔｒａｅｈｏｔｎｉｇｃｌｗａｉｎｆａｎｌｇｅｔｒｉｔｅｓｉｙｎ
ｕｄｒａｎｅｔｕｒｓｅｔｉｒｓｏｅ．ａｓａｔｒｃ－ｕｌｅｔｘｅｓｏｎｏｅｒｎｓｅｉｃｅｏａｅＷａｅｅｔｙｎｅｎｉｖｒｅｆｏｅｃｎｃｏｃｐＡｔ７ｄｙｆｅｏｃｔ。ｈｅｅｐｒｓｉｆｕｏｐｆｎｌｓＳｄｔｃｅｂｄｌｍｕｒｎｃｉｄ
ｗｘ６８ｓｈｏｊ５＠ｏｕｍ９ｃ
摘要背景：影响神经干细胞增殖分化的外在因素包括细胞因子和微环境，嗅鞘细胞能分泌多种细胞因子，与神经干细胞共培养时改变其微环境
目的：观察不同浓度嗅鞘细胞对神经干细胞增殖及分化的影响。方法：体外分别培养Ｗｉａ大鼠神经干细胞和嗅鞘细胞，５１Ｌ’ ｓｒｔｘ０神经干细胞分别和１１Ｌ。１１。Ｌ。１ｌ ” Ｌ０。ｘ０。０嗅ｘ，，ｘ

成年大鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定

ＥｒｕｒｈＥＭ，ｇａｆｔＨａｍｒＬ．Ｃａｄｏａｃａｒａｉｙａｎｉｒｉｖｓｕｌｒｍｏｔｔｍｏｇｐ — ｌ
［３１］
Ｃｏａ，ｏｏｏＡ，ｏｌｏＡＣｕｃｌＤｉＳｍｍａＣ，ｔａ．ｍｐｉｅａｄａｅＩａｒｄｃｉｃ１ｒｐｒｏａｃｎｅｄｒｙｐｔｅｔｔｒｗｔｏｏｅｄ・ｅｆｒｎｅｉｌｅｌａｉｎｓｗｉｈｇｏｈｈｒｎｅｍｍ
高峰贺世明，，王学廉高国栋，
（．１解放军军医进修学院，北京１０５２第四军医大学唐都医院神经外科）０８３；．
［摘要］目的
从成年大鼠脊髓中培养神经干细胞，并对其进行鉴定。方法采用悬浮培养神经干细
胞技术，对成年大鼠脊髓组织进行干细胞培养，并通过自我增殖实验和免疫细胞化学技术进行鉴定。结果培养１２周时，～培养液中即出现神经干细胞克隆球。该克隆球有很强的自我增殖能力，可多次传代。免疫细胞化学技术证明该克隆球表达大量神经干细胞特征性的中间丝—— 巢蛋白（ｅｔ）Ｎｓｎ。结论正常成年大鼠ｉ脊髓中含神经干细胞，在体外条件下可大量增殖。
［］６
ＣｅＢ，ａｇＬ，ａｇＰＩｓｌ — ｋｏｔａｔｒＩｈｎＤＷｎＷｎＨ．ｎｕｉｌｅｇｗｈｆｃｏｎｉｒ
ｒｔｒｓａｏｔｔｃｓｇｌｎｎｃｄｂｔａｏｉａｄｉ・ｅａｄｐｐｏｉｉｎａｉｇｉｄｕｅｙｅｈｎｌｎｃｒｏ

Y27632对体外培养的大鼠神经干细胞增殖和分化的影响的开题报告

Y27632对体外培养的大鼠神经干细胞增殖和分化的
影响的开题报告
一、研究背景
神经干细胞是一类具有自我更新和多能分化潜能的细胞。

在生物医
学领域，神经干细胞的应用前景非常广泛，例如可用于治疗神经系统退
行性疾病和中枢神经系统损伤等领域。

因此，提高神经干细胞的增殖和
分化效率是研究的重点之一。

而Y27632是一种针对Rho激酶的抑制剂，具有诱导形态学改变、增强细胞粘附和改变细胞骨架等作用，因此被广
泛应用于细胞培养中。

本研究旨在探究Y27632对于大鼠神经干细胞体外培养的影响。

二、研究内容
1.探究Y27632对大鼠神经干细胞增殖的影响。

选取一定浓度的Y27632加入到大鼠神经干细胞培养基中，采用
MTT法检测细胞增殖情况，观察加入Y27632后神经干细胞增殖程度的变化。

2.探究Y27632对大鼠神经干细胞分化的影响。

将大鼠神经干细胞培养在不同剂量的Y27632培养基中，观察神经干细胞的分化情况，并运用Immunofluorescence染色和实时荧光定量PCR 等技术方法对各细胞类型进行鉴定。

三、研究意义
探究Y27632对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响，能为神经干细胞的体外培养提供新的方法和途径，进一步推进干细胞研究领域的发展。

同时，该研究还能为神经系统疾病和损伤的治疗提供有力的基础研究支持。

神经干细胞的单层培养及分化过程中HES1和MASH1的表达变化

Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】ＣｕｌｔｕｒｉｎｇｃｆＮＳＣｉｎｗ＇ｔｒｏｗｅｒｅｉｎｖｅｓｉｔｇａｔｅｄ，ｉｎｗｈｉｃｈＮＳＣｃｏｕｌｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｆｏＨＥＳ１ａｎｄＭＡＳＨ１ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃｆＮＳＣ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔｈｅｃｅｒｅｂｒｕｍｓｆｏｒａｔｅｍｂｒｙｏｓ
化，Ｑ — ＰＣＲ检测分化过程中ＨＥＳ１和ＭＡＳＨ１的表达变化。【结果】神经球悬浮培养和单层贴壁培养均可得到的ＮＳＣ；分化３ｄ
后，在不加入任何诱导因素的情况下，单层贴壁培养的ＮＳＣ能更高比例［（１９．５５±１．０９）％］地分化为１３一ｔｕｂｕｌｉｎｍ阳性细胞；
ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＮｅｕｒａｌＳｌｃｍＣｅｌｌｉｎＶｉｔｒｏａｎｄｌｈｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｈａｎｇｅｓＯｆＨＥＳ１ａｎｄＭＡＳＨ１
ｄｕｒｉｎｇＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ

纹状体神经干细胞的分离培养及其鉴定

热点，科学家们试图通过研究干细胞的体外培养、分
化及一系列的影响因素来探讨中枢神经系统的发育等问题．］干细胞是指有多种分化潜能和自我更新能力一的细胞，有两种，它一种是胚胎干细胞，种一是组织干细胞．织干细胞是指已经进入机体并负组有某种构建组织功能的干细胞，如神经组织干细胞、
维普资讯
第８卷第ｌ期
２００２年２月
上海大学学报（然科学版）自
ＪＯＵＲＮＡＬＨＡＮＧＨＡＩＵＮＩＯＦＳＶＥＲＳＴＹ（ＩＮＡＴＵＲＡＬＳＥＮＣＥ）ＣＩ
Ｖｏ＿８Ｎ１＿
ＡｂｔａｔＣｅｔｉｕｓｒｃ：ｒａｎｎｍｂｒｏｅｒＩｔｍｅｌｈｔｅｉｔｎｔｅｅｒｏｉｍａｅｆｎｕａｅｃｌｔａｘｓｈｍｂｙｎｃｓｓｉｍｍａｉｎｂａｎｃｎｂｌｒｉａｅａ
Ｉｏａｉｎ，Ｃｕｔｖｔｏｎｄｎｉｉａｉｎｏｔｉｔｍ — ｒｖｄｓｌｔｏｌｉａｉｎａｄＩｅｔｆｃｔｏｆＳｒａｕＤｅｉｅＮｅｒｌＳｅｌｓｕａｔｍＣｅｌ
ＧＵｎｇ，Ｐｉ
近年来对于细胞的研究已经成为生命科学界的
血液组织干细胞和皮肤组织干细胞等，这些干细胞不仅能再生某些组织，而且可以衍生成与其来源不同的组织细胞类型．胎脑及成脑内都有神经干ｊ在细胞的存在一，这种干细胞在发育期，以通过自可我增殖来满足发育期生成大量细胞的需要，同时部分子代细胞发生向神经元及肢质细胞的分化，以满足脑功能的需要；在成年期，神经干细胞一般处于静

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

ＰＡＩｌ —。
２结果
血浆ｔＡ、ＡＩｌ原含量检测见表ｌ — Ｐ —抗Ｐ。观察组血浆ｔＡ — Ｐ含量低于对照组（ｏ０）Ｐ — 量显著高于对照组（Ｐ＜．５．ＡＩｌ含Ｐ＜
０．０５）。
本文结果表明．急性脑梗死患者血浆ｔＡ含量降低，ＡＩ — ＰＩ — ｌ含量升高，内纤溶活性低。提示临床上可用ｔＡ、Ａｌ体 — Ｐ一Ｐ１的含量作为判断急性脑梗死患者纤溶活性，指导治疗的参考指标之
一
０
表ｌ两组血浆ｔＡ、ＡＩ含量比较（ ± ｓ — ＰＰ — ｌ）
参考文献
［３ＬｓａｚＢｒｕ１ｏｃｌｏＪ，ａｎｗａｄＥ．ｓｕｌｓｉｏｅｃｉａｏ（］．ＥｎｉｌＴｉｓｅｐａｍｎｇｎａｔｖｔｒＪＮｇ
维普资讯
・
３・４
中国塞旦神经疾病杂志２０年１月第９０６１卷第６期ＣｉｓＪｕｎｌｆｒｃｃｌｅｏｓｉａｓｏ．０６ＶＩｏ６ｈｅｅｏｒａｏＰａｔａＮｒｕｓｓｖ２０，ｏ９Ｎ．ｎｉｖＤｅｅＮ．
显示．性脑梗死患者血ｔＡ明显低于对照组（急 — ＰＰ＜００）．５而
１２标本制备所有实验对象人院第２．ｄ空腹、卧静息平１ｒｎ后采集，血中尽量减少静脉压迫时间。血液标本按０ｉａ采ｌ：抗凝（０１Ｍ枸橼酸钠０２＋血液１８）按３０ｒ９即．３．ｍｌ．ｍ１。００／ａｎ离ｒｉ心１ｒｉ，分离血浆放人一Ｏ５ｎ取ａ８ ℃超低温冰箱保存。１３检测方法及试剂采用ＥｌＡ定量测定ｔＡ、Ａｌ．ＬＳ — Ｐ一Ｐ１水平，剂盒购自美国诊断试剂公司（Ｄ。操作过程严格按照试ＡＤ药盒说明书进行。１４统计学处理采用ＳＳ１．．ＰＳ００统计软件进行两样本均数比较的ｔ检验，＝００ “ ．５作为检验水准，据以均数 ±标准差（－数Ｘ ± ｓ表示。）

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

神经干细胞的培养
一、神经干细胞的分离和传代
无菌条件下取新生SD大鼠(出生48h内)脑组织，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖显微镜下剥离脑膜，准确分离海马，用眼科剪将海马剪碎后，再转移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞浓度为5×104~5个/ml，置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μl。

待神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，仍以5×104个/ml的细胞浓度置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μl。

此后每7d机械分离克隆传代1次，方法同前。

二、BrdU标记
将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后加入神经球形成后再次机械分离克隆制作的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的神经球形成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。

三、神经干细胞的诱导分化
选取部分上述传代后形成的次代神经球种植于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并加入有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养，观察其生长分化情况。

另将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后加入有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫细胞化学染色。

四、条件培养液的制备
取1g鸡胚的后肢骨骼肌组织，加入9mlD-Hanks液中冰浴匀浆15min，离心获得上清液，过滤除菌后，加两倍体积DMEM/F12培养基制成条件培养液备用。

五、神经干细胞的定向诱导分化
将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后分别加入条件培养液和有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中对照贴壁培养，7d后均行ChA T免疫细胞化学染色。

六、免疫细胞化学染色
培养细胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分别行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫细胞化学染色，用DAB和H2O2作为呈色剂，阳性着色为棕黄色。

具体方法为：
（1）0.05M PBS漂洗10min×3次
（2）0.3%H2O2/0.05M PBS室温30min
（3）0.3%Triton-100/0.05M PBS 37 ℃，15min
（4）0.05M PBS漂洗10min×3次
（5）5%羊血清/0.05M PBS 37 ℃，15min
（6）I抗（2%羊血清/0.05M PBS配）4℃，48h
（7）0.05M PBS漂洗10min×3次
（8）II抗（2%羊血清/0.05M PBS配，1：200）37 ℃，1.5h
（9）0.05M PBS漂洗10min×3次
（10）AB复合物（0.05M PBS配，1：100）37 ℃，1.5h
（11）0.05M PBS漂洗10min×3次
（12）Tris-HCl缓冲液37 ℃，15min
（13）DAB显色20min
（14）蒸馏水漂洗10min×3次
然后，为进一步证明实验组的细胞是胆碱能神经元，将已作完ChAT免疫细胞化学染色的细胞用PBS终止显色以及进一步封闭非特异性结合位点后，仍用ABC法行Tuj1免疫细胞化学染色，用含有NiCl的DAB和H2O2作为呈色剂,双标阳性细胞着色为蓝黑色。