神经干细胞培养与鉴定

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海马神经干细胞的分离、培养与鉴定

显示神经元、状胶质细胞、星寡树突细胞抗原阳性。结论：海马分离出的细胞具有自我更新、殖和分化能从增
力，神经干细胞。是
关键词神经干细胞海马大鼠细胞培养
分类号Ｒ７１０４．５
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第１２卷第１９期２００２年ｌＯ月
中国现代医学杂志Ｃｈｎｏｍ￣ｏｏｅｎＭｅｉｉｉａＪｕｆＭｄＦｄｃｎｅ
Ｖｏ．２Ｎｏ．９１１１０Ｃ．２０ｔ０２
ＩＯＬＡＴＩＮ．ＳＯＣＵＬＴＵＲＥＡＮＤＤＥＮＴＩＣＡＴＩＮＦＮＥＵＲＡＬＩＦＩＯＯＳＴＥＭＣＥＬＬＳＩＲＡＴＳ’ ＨＩＮＰＰＯＣＡＬＭＰＵＳ
ＬｉｕＢａｉａｎ，ｉｇｑｙＬｉＸｎｕｎ，ａｎＺｈｇｈｕｘｉ，ｅ．ａａｎｔａ１
个克隆进行连续传代培养，免疫组化检测ｎｓｉ原和分化后神经细胞特异性抗原。结果：海马获得的用ｅｔｎ抗从
细胞群能够连续传代，离后的单个细胞能形成事迹球，疫检测为ｎｓｉ性；外、内分化的细胞分别分免ｅｔｎ阳体体
［ｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｏｉｌｔｎａｄｉｅｔｉｔｎｏｅｒｌｔｍｅｓｉｒｔ’ ｉｐｃｌｕ．ｔｏｓＣｌＡｓｃ］ｊｃｉ：ｏａｉｎｎｉｃｉｆｕａｓｃｌａｓｈｐｏａｍｐｓＭｅｈｄ：ｅｓｒｖｓｏｄｆａｏｎｅｌｎｌ

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定方庆;朱庆丰;尹国才;陈新生【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2012(9)27【摘要】Objective To explore the methods of isolation, cultivation and differentiation of human fetal neural stem cells, and to observe the characteristics of proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro. Methods The neural stem cells were isolated from human fetal hippocampus at embryonic age 14 weeks by induction of labor with water bag. A serum free medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) was used to cultured and expanded neural stem cells. The cells were cultured, passed and differentiated. Cultured and differentiated cells were identified with immunofluorescence test. Results The human neural stem cells having the abilities of self-renew and multipotency were successfully isolated and cultured from human fetal brain with serum free medium. They were found to form typical neurospheres in suspension and express Nestin antigen. The cells could be amplified and passed continuously. Neural stem cells were induced to differentiate and express specific antigens of neuron and astrocyte in serum medium. Conclusion The neural stem cells isolated from human fetal brain have the abilities of self-replication, multipotency and amplification in vitro. It has useful appliacation in further basic and clinicalresearch.%目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点.方法采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定.结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原(Nestin);在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原.结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究.【总页数】3页(P19-20,24)【作者】方庆;朱庆丰;尹国才;陈新生【作者单位】安徽医科大学附属安庆医院神经外科,安徽安庆,246003;安庆师范学院生命科学系,安徽安庆,246003;安庆师范学院生命科学系,安徽安庆,246003;安徽医科大学附属安庆医院神经外科,安徽安庆,246003【正文语种】中文【中图分类】R421【相关文献】1.人胎肝间充质干细胞体外分离培养和生物学鉴定 [J], 何念海;赵文利;王宇明2.人胎肝干细胞体外分离、培养及鉴定 [J], 高沿航;李玉林;李艳茹;吴珊;全成实;王芯蕊;张丽红3.人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究 [J], 巨容;杜江;兰和魁;王斌;封志纯4.人胎儿骨髓基质干细胞的分离、体外培养和鉴定 [J], 陈金武;吴军正;张军;李焰;刘斌5.人胎肝干细胞的体外分离培养与鉴定 [J], 毛海洲;陈耀凯;王宇明;张磊;刘国栋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

成年大鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定

ＥｒｕｒｈＥＭ，ｇａｆｔＨａｍｒＬ．Ｃａｄｏａｃａｒａｉｙａｎｉｒｉｖｓｕｌｒｍｏｔｔｍｏｇｐ — ｌ
［３１］
Ｃｏａ，ｏｏｏＡ，ｏｌｏＡＣｕｃｌＤｉＳｍｍａＣ，ｔａ．ｍｐｉｅａｄａｅＩａｒｄｃｉｃ１ｒｐｒｏａｃｎｅｄｒｙｐｔｅｔｔｒｗｔｏｏｅｄ・ｅｆｒｎｅｉｌｅｌａｉｎｓｗｉｈｇｏｈｈｒｎｅｍｍ
高峰贺世明，，王学廉高国栋，
（．１解放军军医进修学院，北京１０５２第四军医大学唐都医院神经外科）０８３；．
［摘要］目的
从成年大鼠脊髓中培养神经干细胞，并对其进行鉴定。方法采用悬浮培养神经干细
胞技术，对成年大鼠脊髓组织进行干细胞培养，并通过自我增殖实验和免疫细胞化学技术进行鉴定。结果培养１２周时，～培养液中即出现神经干细胞克隆球。该克隆球有很强的自我增殖能力，可多次传代。免疫细胞化学技术证明该克隆球表达大量神经干细胞特征性的中间丝—— 巢蛋白（ｅｔ）Ｎｓｎ。结论正常成年大鼠ｉ脊髓中含神经干细胞，在体外条件下可大量增殖。
［］６
ＣｅＢ，ａｇＬ，ａｇＰＩｓｌ — ｋｏｔａｔｒＩｈｎＤＷｎＷｎＨ．ｎｕｉｌｅｇｗｈｆｃｏｎｉｒ
ｒｔｒｓａｏｔｔｃｓｇｌｎｎｃｄｂｔａｏｉａｄｉ・ｅａｄｐｐｏｉｉｎａｉｇｉｄｕｅｙｅｈｎｌｎｃｒｏ

大鼠海马神经干细胞的分离培养与免疫荧光鉴定

Ｉｏａｉｓｌｔｏｎ，ｕｌｕｒｎｄｉｃｔｅａｍｍｕｎｏｕｏｅｃｎｃｄｅｔｆｃｔｏｆｎｅｒｌｓｅｃｌｓｉａｔｌｆｒｓｅｅｉｎｉａｉｎｏｕａｔｍｅｌｎｒｓｉ
Ｃｅａ。，ａｇＸａｊｎＺａｇＰｎ３ｅａ．ｈｎＫｉＫｎｉｎｉｇ，ｈｎｉｇ，ｔ１一ａ
ｐｏｅｔｓｒｐｒｅ．ＭｅｈｄＴｉｓｕｙａｏｔｄｔｅｓｒｍ－ｒｅｃｌｒｏｉｅｉｈａｉｂｏｌｓｇｏｔｉｔｏｓｈｓｔｄｄｐｅｈｅｕｆｅｕｔｅｃｍｂｎｄｗｔｔｅｂｓｃｆｒｂａｔｒｗｈｕｈｉ
果
从新生大鼠海马齿状回分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球，并且呈ｎｓｎ阳性表达，ｅｔｉ具有多向分化能力。结论
分离培养的细胞是中于细胞；分离培养；免疫荧光鉴定
中图分类号：３３Ｑ４文献标志码：Ａ文章编号：６４４０２１一２００ — ４１７ — ９Ｘ（００）０ — ０１０
（．ＣｌｇｆＬ－ｃｅｃｓｅｅＵｉｒｉ，Ｂｏｉｂｉ０１０；．Ｃｌｇ厂Ａｒｕｔｒ，Ｈｂｉ１ｏｌｅｏｓｉｎｅ，ＨｂｉｎｅｓｙａｄｎＨｅｅ７０２２ｏｌｅＱｇｉｌｅｅｅｅｖｔｇｅｃｕＵｉｒｉ｛ＥｇｎｅｉＨａｄｎＨｅｅ５０１３ＤｐｒｍｎｅｒｌｙｆｌｅｏｐｔｊＨｂｉｎｖｓｙｏｎｉｒｇ．ｎａｂｉ０６０．ｅａｔｅｔｏＮｕｏｇ，ＡｆｉｄＨｓｉｌ０ｅｅｅｔｅｎｆｏｉ￣ａ

大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究

胚胎神经干细胞的体外培养体系，５的胎牛血清诱导神经干细胞分化，免疫荧光染色技术进行对神经用％用千细胞及诱导分化细胞的鉴定。结果原代培养的神经干细胞折光性强，养第２培ｄ开始形成细胞集落，第３形成大的神经球。３～ｄ５代传代的细胞生长稳定。经胎牛血清诱导后第３ｄ开始，神经球开始向周边发出突起，悬浮的细胞开始贴壁生长。原代及传代培养的神经球表达Ｎｓｎ阳性，化细胞分别表达ＮＥＧＡｅｔｉ分Ｓ、ＦＰ和ＧＬＡＣ阳性。结论应用无血清培养技术可在体外培养、扩增出神经干细胞。５％的胎牛血清可以诱导神经干
Ｅｘｐｒｍｅａｔｄｙｏｕｌｉａｉｎ，ｄｆｅｅｉｔｏｎｄｉｎｔｆｃｔｏｎｆｔｌｒｔｅｒｌｅｉｎｔｌｓｕｆｃｔｖｔｏｉｆｒｎｔａｉｎａｄｅｉａｉｎｉｅａａｓｎｕａｉ
ｓｍｅｓＩｉｎｘＷＮＧＸａｎ，ＨＮｏｇｊｎｅａ．ｅａｔｅｔｆＮｕｏｕｇｒ，ｅｔｃｌＵＪａ —ｉＡｉｏｇＺＡＧＲｎ－，ｔ１ＤｐｒｎｅｒｒｅｔｅｌＬｎ，ｕｍｏｓｙｈ
豫ＨｓｉｌＰ．ａｊ７１０．ｈｎｏｔＢｏ２０４Ｃｉａｐａｏｆｉ
ｆｅｄｕ，５ｒｅｍｅｉｍ％
ｏｈｅｗｏｂｖｎｓｒｍｗａｕｓｄｏｄｆｅｅｔａｉｎ．Ｉｆｔｍｂｏｉｅｅｕｓｅｆｒｉｒｎｉｔｏｆｍｍｕｅｌｕｒｓｅｃｎｆｏｅｃｎｅ

神经干细胞体外培养技术

神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。

文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。

此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。

根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。

基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。

本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。

二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。

（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定研究

ｔｄｐｓｔｖ１ｔｈｘｅｔｏｎｌｍｍａｉｎＴｈｏｅｓｖｒｅｒａｌｒ，ｈｒｉｈｒｔｅ１ｖｌｏｅｏｉｉｅｙｗｉｔｅｅｔｎｆｉｆａｈｔ．ｅｍｒｅｅｅｈａｔｆｉｅｔｅｍｏｅｈｇｅｈｅｅｆｏｕ
孔令胜张军臣张冉赵万巨邵彤杨全祥
（宁医学院附属医院）济
提法
要目的建立胎鼠神经干细胞体外培养方法并鉴定神经干细胞，观察神经干细胞生长特点。方
采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的无血清培养基对大鼠胚胎间脑组织细胞悬液进行培分离培养出了大量具有不断增殖的能力、达神经巢蛋白的神经干细胞，能经过诱导分化为神经元和神表并
探索神经系统疾病新的治疗方法。我们采用无血清培养、细胞克隆技术及免疫细胞化学分离并鉴定单神经干细胞，为进一步研究ＣＮＳ疾病的发病机制和治疗手段提供理论和物质基础。
１材料与方法
实验动物：孕１ｄ的ＳｒｇｅＤｗｅ（Ｄ）受４ｐａｕａｌｙＳ胚胎大鼠由我校实验动物中心提供。主要试剂：ＭＥＦ２（：）培养基（ — ＤＭ／ｔ１１Ｈｙ
第３ｚ卷第２期
Ｖｏ．２，．Ｉ３Ｎｏ２
济宁医学院学报
ＪＯＵＲＮＡＬ０ＦＪＮＩＤＩＩＮＧＭＥＣＡＬＣＬＧ０ＬＥＥ

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

ＰＡＩｌ —。
２结果
血浆ｔＡ、ＡＩｌ原含量检测见表ｌ — Ｐ —抗Ｐ。观察组血浆ｔＡ — Ｐ含量低于对照组（ｏ０）Ｐ — 量显著高于对照组（Ｐ＜．５．ＡＩｌ含Ｐ＜
０．０５）。
本文结果表明．急性脑梗死患者血浆ｔＡ含量降低，ＡＩ — ＰＩ — ｌ含量升高，内纤溶活性低。提示临床上可用ｔＡ、Ａｌ体 — Ｐ一Ｐ１的含量作为判断急性脑梗死患者纤溶活性，指导治疗的参考指标之
一
０
表ｌ两组血浆ｔＡ、ＡＩ含量比较（ ± ｓ — ＰＰ — ｌ）
参考文献
［３ＬｓａｚＢｒｕ１ｏｃｌｏＪ，ａｎｗａｄＥ．ｓｕｌｓｉｏｅｃｉａｏ（］．ＥｎｉｌＴｉｓｅｐａｍｎｇｎａｔｖｔｒＪＮｇ
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・
３・４
中国塞旦神经疾病杂志２０年１月第９０６１卷第６期ＣｉｓＪｕｎｌｆｒｃｃｌｅｏｓｉａｓｏ．０６ＶＩｏ６ｈｅｅｏｒａｏＰａｔａＮｒｕｓｓｖ２０，ｏ９Ｎ．ｎｉｖＤｅｅＮ．
显示．性脑梗死患者血ｔＡ明显低于对照组（急 — ＰＰ＜００）．５而
１２标本制备所有实验对象人院第２．ｄ空腹、卧静息平１ｒｎ后采集，血中尽量减少静脉压迫时间。血液标本按０ｉａ采ｌ：抗凝（０１Ｍ枸橼酸钠０２＋血液１８）按３０ｒ９即．３．ｍｌ．ｍ１。００／ａｎ离ｒｉ心１ｒｉ，分离血浆放人一Ｏ５ｎ取ａ８ ℃超低温冰箱保存。１３检测方法及试剂采用ＥｌＡ定量测定ｔＡ、Ａｌ．ＬＳ — Ｐ一Ｐ１水平，剂盒购自美国诊断试剂公司（Ｄ。操作过程严格按照试ＡＤ药盒说明书进行。１４统计学处理采用ＳＳ１．．ＰＳ００统计软件进行两样本均数比较的ｔ检验，＝００ “ ．５作为检验水准，据以均数 ±标准差（－数Ｘ ± ｓ表示。）

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．1神经干细胞的原代培养
1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也
可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。

2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠，
充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操
作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显
微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔
组织后，放入D．Hanks液中冲洗。

．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块，
用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。

收集细胞悬液后先后在100目和200
目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。

4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数
板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。

5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。

(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活)
．2神经干细胞的传代
大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d
后成为悬浮生长的神经球。

将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心
5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞
悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。

同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。

Nestin免疫组化检测步骤：
1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清；
2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟；
3)PBS浸洗3min 2次，去上清；
4)Triton液破膜10 min；
5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细
胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。

自然干燥，让细
胞贴在载玻片上；
6)3％I-1202浸润细胞10 min灭活内源性过氧化物酶；
7)滴入正常5％胎牛血清室温封闭20min。

甩去多余液体，不洗；
8)滴加1：300稀释后的兔抗鼠单克隆nestin抗体4。

C过夜。

PBS
洗2 min 3次；
9)将抗体轻轻甩去，用PBS缓冲液加满洗涤3次，每次5min；
10)滴加第二抗体，37℃孵育40min后轻轻甩去二抗后用PBS洗涤3
次，每次5min；
11)滴加DAB显色剂后镜下控制显色1 5min，用清水终止显色；
研究论文
12)滴加苏木素复染2min后用自来水终止DAB显色，用O．5％盐酸
酒精分化5s后立刻用自来水轻柔冲洗至玻片变蓝。

13、)分别在80％、90％、无水乙醇染色缸中各蘸一下，滴加少量二甲。