蛋白-蛋白相互作用研究方法的原理
蛋白质-蛋白质相互作用,常用的原理及操作
蛋白质-蛋白质相互作用,常用的原理及操作1 蛋白质-蛋白质相互作用的重要性蛋白质-蛋白质相互作用指的是蛋白质之间的相互作用，是细胞内部调节机制中至关重要的一环。
生物体内的大多数的生物化学反应均由多种蛋白质之间的相互作用协同完成。
因此，了解蛋白质-蛋白质相互作用对于揭示生物体内的调节机制和疾病治疗具有重要的意义。
2 蛋白质-蛋白质相互作用的原理蛋白质-蛋白质相互作用有以下几种原理：1.互补性原理：蛋白质相互作用是通过其氨基酸残基间的相互作用实现的，只有当它们的结构互为补充时，分子间才能存在一定的吸引力。
2.疏水作用原理：即亲水性的氨基酸残基排列在分子的一侧，而疏水性的氨基酸残基则尽可能地向分子的另一侧聚集，这些疏水性残基之间形成的水合层会导致疏水性残基之间相互吸引。
3.电荷作用原理：氨基酸残基的电性质对蛋白质的相互作用也有很大的影响，具有相反电荷的残基之间通常会发生静电吸引，而具有相同电荷的残基之间则发生静电排斥。
4.氢键作用原理：分子内部的氢键作用可以稳定分子结构，而分子间的氢键作用可以影响到分子之间的相互作用。
3 常见的研究方法研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法有很多种，以下列出一些常用的方法：1.免疫共沉淀法：免疫共沉淀法是一种用于检测蛋白质复合物的好方法，该技术利用抗体与其特异性蛋白质结合，然后沉淀下来，在沉淀的过程中，能够被共沉淀下来的蛋白质就是与该蛋白质复合成分的蛋白质。
2.双杂交法：双杂交法通过蛋白质生物学里的两性体蛋白质（Y2H）或细胞外膜蛋白两性体蛋白质（M2H）来检测蛋白质相互作用。
3.表面等离子体共振（SPR）技术：SPR技术是目前应用最广泛的表征生物分子间相互作用的技术，它结合了光学和生物学等多种科学的优点。
4.荧光共振能量转移（FRET）技术：FRET技术是一种检测蛋白质相互作用的不错方法，其原理是可以监测到两个不同的荧光染料之间的能量转移过程，从而确定蛋白质复合物的形成。
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋⽩-蛋⽩间相互作⽤的经典⽅法，属于免疫沉淀技术的⼀类，常被⽤于鉴定特定蛋⽩复合物的中未知蛋⽩组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设⼀种已知蛋⽩是某个⼤的蛋⽩复合物的组成成员，那么利⽤这种蛋⽩的特异性抗体，就可能将整个蛋⽩复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进⽽可以⽤于鉴定这个蛋⽩复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第⼀是天然状态，第⼆是蛋⽩复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋⽩质相互作⽤技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相⽐，免疫共沉淀鉴定的相互作⽤蛋⽩是在细胞内与⽬的蛋⽩发⽣的天然结合，避免了⼈为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋⽩可信度更⾼。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建⽴在蛋⽩复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋⽩组分很可能检测不到；2. 由于蛋⽩质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使⽤某⼀种pull-down抗体，⽆论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到⼀半的⽬标蛋⽩复合物沉淀出来，如有必要最好使⽤多种不同抗体分别进⾏CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋⽩复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋⽩复合物成员也会越来越庞⼤；4. 如果使⽤Western Blot的⽅法检测的蛋⽩复合物中的⽬标蛋⽩，则需要在试验前进⾏预测，具有⼀定的冒险性；当然如果将蛋⽩复合物直接进⾏质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较⾼纯度和浓度的蛋⽩复合物样品也⾮易事，并且成本较⾼；5. CoIP鉴定得到的蛋⽩间相互作⽤可能是直接作⽤也可能是间接作⽤，进⼀步区分还需要进⾏GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使⽤复合物的不同成员分别独⽴进⾏CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使⽤复合物的任⼀成员进⾏CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的⼀般操作流程（中英⽂对照）：成⼲扰。
蛋白质相互作用预测方法的研究
蛋白质相互作用预测方法的研究一、本文概述蛋白质是生命体系中的关键分子，它们在细胞的各种生命活动中发挥着至关重要的作用。
蛋白质之间的相互作用是许多生物过程的基础，如信号转导、基因表达、细胞代谢等。
因此，研究蛋白质相互作用对于理解生命的本质和疾病的发生机制具有重要意义。
然而，由于蛋白质相互作用的复杂性和多样性，准确预测蛋白质相互作用仍然是一个巨大的挑战。
本文旨在探讨和研究蛋白质相互作用预测方法的发展和应用。
我们将首先介绍蛋白质相互作用的基本概念和研究背景，阐述蛋白质相互作用预测的重要性和挑战性。
接着，我们将综述现有的蛋白质相互作用预测方法，包括基于基因组学、蛋白质组学、结构生物学等多种方法的原理和优缺点。
我们还将介绍近年来新兴的预测方法，如基于机器学习和深度学习的预测模型，以及它们在蛋白质相互作用预测中的应用和前景。
通过本文的综述和探讨，我们希望能够为蛋白质相互作用预测领域的研究者提供全面的参考和启示，推动蛋白质相互作用预测方法的不断发展和完善。
我们也期望这些方法能够在实际的生物医学研究中发挥更大的作用，为疾病诊断和治疗提供新的思路和方法。
二、蛋白质相互作用预测方法的分类蛋白质相互作用预测方法根据其所采用的技术和策略，可以大致分为以下几类：基于基因组学的方法：这类方法主要利用大规模基因组测序数据，通过比对不同物种或同一物种不同条件下的基因表达谱，来预测蛋白质间的相互作用。
例如，基因共表达分析、基因敲除或敲降后的表达变化等，都可以为蛋白质相互作用提供线索。
基于生物化学的方法：这类方法通过生物化学实验，如酵母双杂交、免疫共沉淀等，直接检测蛋白质间的物理相互作用。
这类方法具有较高的准确性和可靠性，但通常成本较高，且难以在大规模范围内进行。
基于计算生物学的方法：计算生物学方法主要依赖于计算机算法和数学模型，通过分析蛋白质的序列、结构和功能信息，预测其可能的相互作用伙伴。
例如，序列比对、蛋白质结构预测、网络模型构建等，都属于计算生物学方法的范畴。
蛋白质相互作用研究方法
应用
一、阳性: 人为转染重组体 artificial 验证实验:进一步验证实验证明其在生理情 况下是否真的有作用。
二.确定参与结合作用的 domain 或 motif
• Ade+ Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to grow.
• His+ Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.
共聚焦显微镜法 • 也可同时进行核染色
Fig.21 Cellular localization of HPO and JAB1. COS 7 cells were tranfected with GFP-HPO or RFP-JAB1 constructs, respectively. The nuclei were stained by Hoechst 33342 (blue). All cell samples were visualized by confocal microscopy (Leica).
UASs, upstream activating sequences AD, activating domain BD, binding domain
• AD/library: A fusion of the GAL4 AD with a library cDNA/protein.
• DNA-BD/bait: A fusion of the GAL4 DNABD with a bait cDNA/protein.
Co-Immunoprecipitation (coIP)
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤蛋白质与蛋白质相互作用是生物学领域中的一个重要研究方向，可以揭示生命活动的基本机理以及药物设计和治疗疾病的潜在靶点。
本文将总结蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法以及实验步骤。
一、蛋白质与蛋白质相互作用研究方法总结：1.蛋白质-蛋白质亲和层析法：该方法通过利用蛋白质与目标蛋白质之间的亲和力，将目标蛋白质与其他非特异结合的蛋白质分离，可用于筛选靶向蛋白质的抑制剂或开发特定结合位点。
2.酵母双杂交方法：该方法是通过融合目标蛋白质与一组已知蛋白质相互作用的底物，通过检测底物报告基因（比如启动子）的表达来确定两个蛋白质相互作用的情况。
3.免疫共沉淀法：该方法通过利用抗体的特异性，将目标蛋白质和与其相互作用的蛋白质一同从细胞裂解液中沉淀下来，以证明它们之间存在相互作用关系。
4.光学双光子显微镜或荧光共振能量转移法：这些方法可以利用荧光染料标记的蛋白质，通过观察它们之间的相互作用情况来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5.表面等离子体共振（SPR）：该方法通过在金属表面固定一个蛋白质，然后观察黄金膜表面等离子体共振信号的变化来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用过程。
6.核磁共振（NMR）：该方法利用蛋白质中的^1H、^13C和^15N原子的自旋，通过一系列的波形解析来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以提供高分辨率的结构和动力学信息。
7.体外重组蛋白质表达和结合实验：利用大肠杆菌或霞赤红热单核细胞感染表达载体后表达目标蛋白质，以及通过重组技术制备的其他蛋白质，通过混合这些重组蛋白质来研究它们之间的相互作用。
二、蛋白质与蛋白质相互作用实验步骤：1.实验前准备：根据研究目的选择适当的实验方法和方法，准备相应的试剂和材料。
2.原料处理：获得目标蛋白质样品后，进行必要的纯化或浓缩处理，以去除其他污染物，并保持蛋白质的活性。
3.实验设计：根据研究目的设计实验方案，比如确定实验条件、控制实验和重复实验。
蛋白质相互作用(protein interaction)的研究方法
蛋白质相互作用的研究方法万维松 2016-7-23为什么要进行蛋白质研究？（1）蛋白质是细胞的功能分子（2）蛋白质表达水平受到诸多因素的调控（3）DNA/RNA水平与蛋白质水平没有正相关性（4）DNA/RNA层面无法获知蛋白质翻译后修饰（5）蛋白质是药物治疗的重要靶位（6）蛋白质研究是后基因组时代的终极目标为什么要研究蛋白质的相互作用？蛋白质控制了细胞中的所有生物系统，但是，通常它们不是“单打独斗”，绝大多数蛋白质会与其他蛋白质相互作用，一起参与生命过程。
蛋白相互作用有哪些类型？◆稳定相互作用（ Stable interactions ）指那些通常以多亚基复合物（ multi-subunit complexes ）纯化得到的相互作用蛋白，这些亚基可以是相同的，也可以是不同的。
Eg:血红蛋白（αβ）；核心RNA聚合酶（α2ββ’ ）◆瞬态相互作用（ Transient interactions ）被认为控制了主要的细胞过程，它们的相互作用是暂时的，并需要一定的条件来促进相互作用，如甲基化、磷酸化、构象改变等。
瞬态相互作用可强可弱，可快可慢。
蛋白相互作用的研究方法◆In Vivo 体内方法◆In Vitro 体外方法◆In Silico 生物信息学方法常用研究技术Method Interactions type Property Adhibition Co-IP Stable or strong 内源筛选互作蛋白Pull-Down Assay Stable or strong 外源筛选互作蛋白TAP Stable or strong 标签筛选互作蛋白SILAC-PAP Stable or strong 标签筛选互作蛋白BioID Transient 、weak orinsoluble 内源筛选互作蛋白Far-Western BlotAnalysisModerately stable 外源验证互作蛋白IP Stable or strong 内源验证互作蛋白BiFc Transient or weak 内源验证互作蛋白IP/Co-IP(内源)IP/Co-IP (内源)Endogenously expressed FBXW7 and HSF1 interact.(a ) Native FBXW7 was immunoprecipitated (IP) from cell extracts with anti-FBXW7 antibody , followed by immunoblotting as indicated.Rabbit IgG was used as control. Arrow indicates FBXW7 in input.BaitInteracting proteinGST Poly HisIP、Co-IP and Pull-Down比较AP(标签)◆AP：Affinity Purification◆TAP：Tandem Affinity Purification ◆PAP：Parallel Affinity PurificationTAP (Flag-SBP/HA)◆TAP是Co-IP的“近亲”，两者在寻找诱饵蛋白的互作蛋白以及纯化互作蛋白的原理类似。
蛋白质与蛋白质、DNA相互作用研究方法加实例
蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法
一.酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 二.免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) 三.GST pull-down 技术 四.荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET）
两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
3.2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确 的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA 表达得到的未知蛋白）
2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4º C 2h
1.5 酵母双杂交技术的弱点：
1. 假阳性：自激活、多因子参与…… 2. 3. 假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白…… 低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况
酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括： 1. 体外相互作用验证 体外亲和纯化（GST pull-down）、体外免疫共沉淀…… 2. 哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀……
1.3 应用
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋
白质相互作用的技术。主要有二类载体: a 含 DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-
activating domain的载体。另外还需要特殊的酵
母菌株如GAL4缺陷型。
•
它可用于：
– – – 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
蛋白质相互作用的研究方法与原理
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请简述常用蛋白质相互作用研究技术的种类及基本原理。
请简述常用蛋白质相互作用研究技术的种类及基本原理。
蛋白质相互作用研究在生物学领域有着重要的作用。
得益于不断发展的技术，研究者们可以研究蛋白质的结构和功能，以及不同蛋白质间的相互作用关系。
目前，常用的蛋白质相互作用研究技术种类有质谱技术、原位免疫沉淀技术、二硫键蛋白质结合技术、蛋白质组学技术、荧光生物学技术、生物物理技术等，下面将对这些技术的基本原理做简要介绍：
1、质谱技术：质谱技术是利用质谱仪检测蛋白质结合位点或者其他化学变化，判断蛋白质之间的交互作用。
该技术可以检测蛋白质之间结合的Kd值，从而获取相关信息。
2、原位免疫沉淀技术：原位免疫沉淀技术是利用抗体对指定的蛋白质进行免疫定位，获取蛋白质的结合信息。
其原理是当抗体结合指定的蛋白质时，二者就会形成稳定的复合物，这种复合物会凝结沉淀，使得活动的蛋白质被相互定位。
3、二硫键蛋白质结合技术：二硫键蛋白质结合技术是利用二硫键修饰技术，使指定的蛋白质之间形成一种化学键，从而检测两个蛋白质之间的结合及相关结构信息。
4、蛋白质组学技术：蛋白质组学技术是利用分子杂交技术，以及高通量的测序技术，研究基因组中蛋白质的表达量及结构特征，以及它们之间的相互作用关系。
5、荧光生物学技术：荧光生物学技术是利用多种荧光探针，检测蛋白质之间的结合及其相关信息。
6、生物物理技术：生物物理技术是利用生物物理学测量原理，研究蛋白质结合及相关结构及动力学信息。
以上就是常用蛋白质相互作用研究技术的种类及基本原理，帮助研究者们更好地分析蛋白质及蛋白质之间的相互作用关系。
研究蛋白质相互作用的方法及原理
研究蛋白质相互作用的方法及原理蛋白质相互作用是生命科学研究中的重要问题，因为蛋白质在细胞内发挥着许多生物学功能，如信号转导、代谢调控和基因表达等。
在研究这些生物学过程时，了解蛋白质相互作用的方法和原理非常重要。
本文将介绍几种常见的研究蛋白质相互作用的方法及其原理。
1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中纯化出来的方法。
该方法利用目标蛋白质与其相互作用的配体（亲和剂）固定在填充层析柱中的树脂上，将混合物加入层析柱中，通过蛋白质与配体的特异性相互作用，使目标蛋白质与填充层析柱中的树脂结合，从而将其分离出来。
亲和层析法可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子等相互作用。
2. 免疫沉淀法免疫沉淀法是一种利用抗体特异性结合目标蛋白质的方法。
该方法将抗体固定在磁珠或凝胶颗粒上，将混合物加入其中，抗体与目标蛋白质特异结合，将其从混合物中沉淀出来，从而实现目标蛋白质的纯化。
免疫沉淀法可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸等相互作用。
3. 双杂交技术双杂交技术是一种检测蛋白质相互作用的方法。
该技术基于贝尔-拉布实验，将目标蛋白质的DNA序列与另外一种被称为“活化因子”的蛋白质DNA序列连接起来，形成一个双杂交体。
当该双杂交体与另一种包含另一个蛋白质DNA序列的双杂交体结合时，它们可以通过激活报告基因的表达来检测相互作用。
双杂交技术可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
4. 表面等离子共振(SPR)技术表面等离子共振技术是一种实时监测蛋白质相互作用的方法。
该技术基于利用表面等离子共振技术将一个蛋白质固定在芯片上，然后通过流动另一个蛋白质溶液，可以精确地测量这两个蛋白质之间的相互作用。
通过测定反应速率和平衡常数等参数，可以定量分析蛋白质相互作用的强度和亲和力。
表面等离子共振技术可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子等相互作用。
总之，以上这些方法可以帮助研究人员深入了解蛋白质相互作用的机制和原理，在生命科学中有着广泛的应用。
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Capturing these momentary contacts to study which proteins are involved and how they interact is a significant goal of proteomics research today.
蛋白质-蛋白质相互作用 研究法的原理简介
张海燕 20101102
Why study protein interaction?
¾ Genome sequences identify tens of thousands of genes: linking these to 200-300 core biological processes will make their study manageable.
饰） ¾ Certain cofactors or additional proteins needed, and etc.（需有额外蛋白或
共因子才能结合的蛋白）
Technique Extention 1
yeast mating type
Transformation is improved by using a and αhaploid.
¾ Recently developed and/or improved technologies and methodologies make studies of large complexes more feasible and informative.
General protein interaction
Protein interactions study
Captured through their interaction with a known protein
target of known function
Function of unknown protein may be discovered
cdc27） 凋亡蛋白酶活化因子1
（Apaf）
Mac2结合蛋白
STAT蛋白
Types of Protein Interactions－Stable
Types of Protein Interactions－Transient
G protein
Types of Protein Interactions
Discovery of verification of an interaction
To understanding where, how and under what conditions there protein interact in vivo
The function implication of these interaction
Strengths
Common Problems
False Positive:
Technical, ¾ BD auto-activation; ¾ AD activates the reporter gene on it own; ¾ genetic or epigenetic changes in the yeast, and etc.
Components
¾ 与BD融合的蛋白表达载 体，被表达的蛋白称诱 饵蛋白（bait）
¾ 与AD融合的蛋白表达载 体，被其表达的蛋白称 靶蛋白（prey）
¾ 带由一个或多个报告基 因的宿主菌株。
Plasmid construction
Reporter gene selection
Biosynthetic markers URA3 Uracil（尿嘧啶）
Biological,（两个蛋白是在非自然生理状态下的，例如过表达） ¾ two proteins interact in the assay, but not in their natural biological
settings (never expressed at the same time/place in vivo; overexpressed;affected by PTM or proteolysis);
¾ Method more suitable to select for binding than for efficient catalysis.
¾ Library size is limited by transformation efficiency
Applications of phage display
Application of yeast two-hybrid 1
Application of yeast two-hybrid 2
Application of yeast two-hybrid 3
Application of yeast two-hybrid 4
Genome protein linkage map
False Negative: Certain interactions can not be detected by this system, for example:
¾ Toxic proteins; (酵母致死) ¾ Subcellular localization; no location in nuclus（无法定位在核） ¾ Specific post-translational modifications required; （需经特异的翻译后修
是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质 相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报 告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏 度的研究蛋白质之间关系的技术。
Saccharomyces cerevisiae
真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组 成的,如GAL4。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特 定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活 功能。
¾ Target receptors used in affinity selection; ¾ Epitope mapping and mimicking; ¾ Identifying new receptors and natural ligands; ¾ Drug discovery; ¾ Epitope discovery --- a new route to vaccines and diagnostics; ¾ Selection of DNA-binding proteins; ¾ and etc.
Most protein interactions is transient in vivo .
¾ to control the majority of cellular processes. to be involved in the whole range of cellular processes including protein modification, transport, folding, signaling, cell cycling, etc.
Technique Extention 2
Technique Extention 3
Technique Extention 4
Technique Extention 5
Sos Recruitment Sysstem，SRS
Technique Extention 6
有5种结构蛋白： PⅢ通过与F菌毛结合感染细菌 PⅧ与噬菌体的成熟和稳定有关
¾ Proteins typically function in association with other proteins.
¾ Protein complexes are important for virtually every biological process and most diseases.
Smith GP and Petrenko VA, Phage Display, Chem. Rev. 1997, 97, 391410
Technique Extention-ribosome display
SH2结 构域
由大约100个左右氨基酸构成，含有SH2结构域的 蛋白质可以利用SH2结构域与其靶肽上磷酸化的酪 氨基酸残基的高特异性的结合为调节细胞信号转 导链，这种作用是序列特异的，且是磷酸化依赖 的
代表蛋白质 Rb结合锌指蛋白
丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶 分裂后期启动复合体亚 单位（cdc16,cdc23和
Strengths
¾ Directly linking between protein and nuclear acid; ¾ Easily screen, amplifcation and concentration;
Major Problems of Phage Display
¾ Inability of many proteins to be expressed as fusions on the phage surface (e.g. toxic proteins).
蛋白质间的相互作用力
蛋白质内部：肽键
蛋白质间：非共价键
氢键 范德华力 疏水键 离子键
蛋白质相互作用的结构基础
¾结构域-结构域：复合体的两个组分都含有预 先折叠的结构单位。
eg：G蛋白与其效应分子
¾结构域-肽：复合体的一种组分是没有折叠的 短基序（motif）。