分子标记辅助选择的有关问题与发展策略

分子标记辅助选择的有关问题与发展策略黎裕（中国农科院作物品种资源研究所，北京100081）植物育种项目包括两方面的重要工作，首先是确定育种材料中是否存在有用的遗传变异，其次是采用有效的方法把目标基因转移到品种中。

利用易于鉴定的遗传标记来辅助选择是提高选择效率和降低育种的盲目性的常用手段。

但是在常规育种过程中基本上还是应用的是形态学标记，这类标记往往受环境影响，不利于直接选择，并且标记数目有限。

近一、二十年来迅速发展起来的基于DNA的分子标记技术给育种提供了崭新的途径，这就是所谓的“分子标记辅助选择”（marker-assisted selection，缩写为MAS）。

但在这里它不包括利用分子标记进行优异种质的鉴定筛选、亲本的确定、遗传材料的鉴定和分析、亲本的遗传多样性和亲缘关系分析等，而是指把分子标记技术应用于育种过程之中，通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种，从而达到提高育种效率的目的（Dudley, 1993；Lee, 1995）。

分子标记辅助选择是分子育种的一部分（分子育种还包括利用基因工程手段育种）。

一、分子标记辅助选择的优越性有很多理论方面的研究都发现MAS比以表现型为基础的选择更有效，如Knapp (1998)发现在分离群体中，如果目标是从最好的1－2％基因型中选出一个基因型，考虑到成本则MAS是最有效的。

MAS不仅针对主基因有效，针对数量性状位点（QTL）也有效；不仅针对异交作物有效，针对自花授粉作物也有效（特别是在QTL存在显性等位基因并处于相引相时效率更高）（van Berloo Ralph & Stam, 1998）。

MAS的优越性可以体现在以下方面：1.可克服性状基因型鉴定的困难：以下三方面的原因使基因型的鉴定带来不便，即等位基因的外在表现不明显，为隐性等位基因，或与其它基因或环境之间存在互作。

尤其对多基因控制的性状（数量性状）来说，环境变异会使不同基因型表现为部分或全部相同的表型，这使基因型的鉴定更加困难。

有些表型如抗病虫性、抗旱性或耐盐性只有在难于界定或控制的特定条件下才能表现出来。

在育种项目的初期，育种材料较少，不允许做重复鉴定，或要冒一定风险，这方面的问题更加突出。

利用分子标记技术则可部分克服基因型鉴定的困难。

2.可克服性状表现型鉴定的困难：有的性状的表现型鉴定相当麻烦，如育性恢复、广亲和性、光温敏不育和一些抗病虫性及抗逆性等，不仅鉴定费时费力，而且这些性状受环境的影响很大，直接鉴定往往不太准确。

如玉米粗缩病抗性的鉴定就存在这种情况，采用大田自然发病法需要一定环境条件，并且需要特别的田间设计，采用人工接虫法需要较高的养虫技术。

采用分子标记来鉴定就有很大的现实意义。

3.允许早期选择：有很多重要性状如产量和后期叶部或穗部病害抗性等只有在成熟植株上才能表现出来，因此采用传统方法在播种后数月或数年均不能对其进行选择。

尤其对二年生或多年生植物如树木等来说这是育种改良的主要限制因素之一。

而利用分子标记就可以在播种后数天对幼苗（甚至对种子）进行检测，这可大大节省培育植株中所浪费的人力物力和财力，因为这些植株中的绝大部分在育种项目中是被抛弃的对象。

4.允许更广泛和强度更大的选择：在早期特别是对幼苗的选择还可以允许把更多的群体纳入研究选择的对象之中，从而可以对其施加更大强度的选择压力。

同时，还可利用分子标记同时对几个性状（如几种抗病虫性和产量）进行选择。

5.可进行非破坏性性状评价和选择：很多性状是在成熟前进行评价的，这往往带来种子收获的困难。

如对植株进行病虫害抗性的评价和选择，则可能收获到的后代种子减少，甚至收获不到种子。

而利用分子标记技术只需少量叶片或其它组织，植株还可继续生长至成熟，以便育种工作者同时对该育种群体进行其它性状的选择。

6.可提高回交育种效率：把一个期望等位基因从一个材料转移到另外一个材料中的传统方法是过5-10代的回交育种。

在每个回交世代中，育种工作者不仅要选择被转移的等位基因的表型，还要选择轮回亲本的其它性状的表型。

然而，在若干代的回交之后，除目标等位基因外，还有与之连锁的相当长的染色体片断也从目标等位基因供体中转移到回交后代中。

如利用传统回交方法将一个野生种的优良基因转移到栽培品种中，回交20代以上还有可能带有100个以上的其它非期望基因（Young & Tanksley, 1989）。

如果是数量性状位点（QTL）的转移，由于上位效应问题和连锁累赘更为复杂，将更加困难。

利用分子标记可以允许选择出那些含有重组染色体（打破了连锁累赘）的个体，从而帮助减小不需要的染色体片断，从而提高育种效率至少10倍以上（Tanksley et al., 1989）。

另外，对隐性性状可以进行不间断的回交（传统回交中是隔代回交），从而提高基因的回交转移速度。

二、影响分子标记辅助选择的因素1、分子标记与目的基因或QTL之间的连锁程度很多研究表明，分子标记与基因（包括QTL）的距离越小，MAS的效率越高，主要原因是距离小则可以提高估计QTL等位基因效应的准确程度(Dudley, 1993; Edwards & Page, 1994; Hospital & Charcosset, 1997; Moreau et al., 1998; Spelman & Bovenhuis, 1998; Zhang & Smith, 1992)。

在每个QTL只有一个连锁的分子标记时尤其如此，如果有两个分子标记则这个效应减弱。

Gimelfarb & Lande (1994a,b, 1995)发现如果一条染色体上有多个标记，存在一个最适标记密度，在此之上则MAS的相对效率降低。

但是，也有研究认为连锁程度会降低效率，但影响并不太大(van Berloo Ralph & Stam, 1998)。

2、选用的分子标记数目对主基因，Tanksley (1983)建议用分别位于主基因两侧的两个分子标记同时选择可提高选择效率。

Landry et al. (1987)在莴苣的抗霜霉病基因Dm5/8两侧各有一个RFLP标记（距离均为10cM），用一个标记选择获得抗性个体的概率为90％，用两个标记则可达到99％。

对于QTL，Moreau et al. (1998)发现在少数QTL可解释大部分变异的情况下，MAS的效率更高。

事实上，在QTL作图时检测到的QTL数目要比实际的QTL 数目要少，如果QTL数目太多（如多于20），就不能假定选定的QTL之间是独立的，两个连锁的QTL会导致检测到位于它们之间的一个“幻象QTL”，而这会降低MAS的效率。

对在选择指数中引入多少个分子标记的问题，一般认为存在一个最佳数目，这与性状的遗传力有关(Gimelfarb & Lande, 1994a, 1995; Moreau et al., 1998)。

Gimelfarb & Lande (1994a)发现利用6个标记时的MAS效率高于利用3个标记时的效率，但利用12个以上的标记时，MAS的效率在低世代时反而降低，在高世代时增幅很小。

3、群体大小Lande & Thompson (1990)分析MAS的效率时曾假定群体无限大，标记无限多，在此基础上作出性状遗传力低时MAS比常规选择效率高的结论，但他们还是认为有必要研究大量个体，样本大小对加性遗传方差有一定影响，在群体很小时MAS没有多大用处。

其它一些根据计算机模拟的结果对MAS的效率进行的研究表明，群体大小是影响MAS的关键因素（Edwards & Page, 1994; Gimelfarb & Lande, 1994a, b, 1995; Hospital et al., 1997; Whittaker et al., 1995; Zhang & Smith, 1992, 1993）。

Moreau et al. (1998)也发现MAS的相对效率随群体增大而提高，但在群体小于200时MAS仍然有效。

4、性状的遗传力根据计算机模拟的结果对MAS的效率进行的研究表明，性状的遗传力也是影响MAS的关键因素，一般来说遗传力越高则MAS效率降低（Edwards & Page, 1994; Gimelfarb & Lande, 1994a, b, 1995; Hospital et al., 1997; van Berloo Ralph & Stam, 1998; Whittaker et al., 1995; Xie & Xu, 1998b; Zhang & Smith, 1992, 1993）。

Moreau et al. (1998)认为在群体大小有限的情况下，对低遗传力的性状MAS的相对效率也较高，但存在一个最适遗传力，在此限之下MAS的效率会降低。

在低遗传力（0.1-0.2）时，MAS的效率更高，但可能出现的负面试验的频率也高一些，因此利用MAS技术所选性状的遗传力在0.3-0.4之间会更好（Hospital et al., 1997; Moreau et al., 1998）。

然而，如果群体大小很大（如大于500但不是无限），最适遗传力接近于零，这一点也就没有多大意义了。

在实际利用分子标记辅助选择改良普通菜豆的抗旱性时也证实了MAS的效率与性状的遗传力有反比的关系（Schneider et al., 1997）。

三、进行分子标记辅助选择的前提1、建立尽量饱和的分子标记图谱：有人把它称之为“框架图谱”，因为真正的基因将定位于这个图谱上，并且在比较不同种的染色体组成时可以以此作为基础。

首先需要建立把分子标记以线性形式排列起来的连锁图谱，然后把这些连锁图谱与特定的染色体或连锁群联系起来，定位在染色体上。

但后一步工作对育种来说不是必须的。

建立饱和的分子图谱是对目的基因进行精密定位的前提。

目前，对大多数重要的农作物均已建立相当饱和的图谱，尤其在水稻、玉米、小麦、大麦、西红柿、马铃薯等作物上。

但对有些作物还需要在这方面做更多的工作。

2、把目标基因定位于分子图谱上：又称之为“基因标记(gene tagging)”，即建立目标基因与分子标记的连锁关系。

这里的目标基因包括控制简单遗传的性状的基因和控制数量性状的基因（QTL）。

分子标记辅助选择的可靠程度取决于目的性状座位于标记座位之间的重组频率，因此二者之间的遗传距离越小越好。

与目的基因紧密连锁的单一分子标记可以用于辅助选择，而如果在目的基因两侧均能找到与之连锁的标记，会进一步提高选择的可靠性。

由于在15－20cM的距离内很难发生两个重组事件（双交换），因此现在一般认为如果目标基因位于两个距离在15－20cM以下的分子标记之间，这两个标记便可以用于育种项目。