PCR详细讲解
高三生物pcr知识点
高三生物pcr知识点PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、DNA指纹分析等领域。
高三生物学生需要掌握PCR的相关知识点，下面将详细介绍PCR的原理、步骤和应用。
一、PCR原理PCR是一种体外的DNA复制技术，通过在一定温度条件下，利用酶的催化作用使DNA的复制反应反复进行。
PCR主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，将反应体系升温至94-96℃，使DNA双链解链成单链。
这一步骤中，DNA双链断裂，并且其中的氢键被破坏，使得DNA单链解开，形成两个模板链。
2. 退火在变性步骤完成后，将温度降至50-65℃，引入引物（寡核苷酸引物，即引导DNA复制的短链DNA）来与特定DNA序列互补结合。
引物结合于DNA模板的3'端，以提供起始点供DNA合成酶进行反应。
3. 延伸将温度调节至72℃，引入高温下活性较好的DNA合成酶（如Taq聚合酶），使DNA在引物的引导下进行延伸。
在这个步骤中，DNA合成酶从引物的3'端开始向5'端进行合成，合成一个新的DNA链。
通过不断重复这三个步骤，即可获得大量特定DNA片段的复制产物。
二、PCR步骤PCR通常需要以下步骤：1. 反应体系的制备将引物、DNA模板、dNTPs（四个脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液等混合制备反应体系。
2. 变性升温至94-96℃，使DNA双链解链成单链。
3. 退火降温至50-65℃，引入引物与模板DNA互补结合。
4. 延伸升温至72℃，引入聚合酶使DNA链延伸。
5. 反应周期重复2-4步骤多次，通常需要进行25-35个循环，以获得足够的产物。
6. 终止和保存制备PCR产物后，通常会升温至70-80℃，使聚合酶停止合成反应，并保存PCR产物。
三、PCR应用PCR技术在生物学研究和医学诊断中具有广泛的应用。
1. 基因检测PCR可以被用于检测和分析DNA样本中的特定基因，以了解其表达和突变情况。
简述PCR原理及过程的步骤
简述PCR原理及过程的步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA（脱氧核糖核酸）序列的重要技术。
它在生物医学研究、基因工程以及医学诊断中得到广泛应用。
本文将简要介绍PCR的原理和步骤。
1. PCR原理PCR原理基于DNA的复制机制，在体外繁殖大量DNA分子。
PCR通过将DNA反复加热（解链）、退火（引物结合）和延伸（DNA合成）的循环反应，使得DNA序列倍增。
这一过程包括以下几个主要步骤。
2. PCR步骤2.1 解链（Denaturation）PCR反应开始时，将待扩增的DNA样本加热至高温（通常为94-98摄氏度）。
高温能够打破DNA双螺旋结构，使双链DNA分离成两个单链。
2.2 引物结合（Annealing）在下一个步骤中，PCR反应体系被冷却至较低的温度（通常为50-65摄氏度）。
在这个温度下，由于引物（寡核苷酸片段）的存在，引物会与待扩增DNA的互补序列结合。
2.3 DNA合成（Extension）引物结合后，温度会被升高至大约72摄氏度。
这个温度下，Taq DNA聚合酶（一种特殊的DNA合成酶）会开始合成新的DNA链。
Taq DNA聚合酶能够使用已结合的引物作为起始点，向前方向合成新的DNA分子。
2.4 重复循环一次PCR循环包括了上述三个步骤，通常需要进行20-35次循环，以保证足够的DNA序列倍增。
在每次循环后，DNA的数量会成指数级增加。
3. PCR的应用领域PCR技术在许多领域得到广泛应用，包括：•分子生物学研究：PCR可以扩增特定的DNA序列，用于基因测序、基因突变检测等研究。
•法医学：PCR可用于DNA鉴定，如刑事案件的嫌疑人辨识等。
•医学诊断：PCR可用于检测病原体的DNA，如病毒、细菌等，用于感染病原体的快速诊断。
•遗传学：PCR可用于基因检测、遗传疾病筛查、基因多态性分析等。
总结PCR技术的发展和应用使得科学家们可以在短时间内扩增大量目标DNA序列。
PCR 在许多生物医学研究领域具有重要作用，其简单、高效、可靠的特点使其成为现代生命科学研究中不可或缺的工具。
PCR详细讲解
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
引物设计的基本原则
2、避开易形成二级结构的模板序列区域。
基本原理
PCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促动力学原 理，开始的循环内扩增产物呈指数积累，产物与
模板呈线性关系。半定量 RT-PCR 技术正是利用产
物与模板量的这一线性关系，通过扩增产物来对
比总RNA中目的基因的表达。
基本流程
注意的问题
RNA的提取
• 做RT前必需测RNA浓度，常用500ng或1ug。
逆转录引物：
（1）随机六聚核苷酸引物
仅长6个核苷酸，每个核苷酸位点上随 机加入4中不同的脱氧核苷酸，因此是46中 不同引物的集合体。 所有RNA分子均可以充当模板，合成的 cDNA中有96%来自rRNA。
逆转录引物：
（2）Oligo（dT） 仅由dTTP构成，长度一般为1824个核苷酸。 识别mRNA的3’端poly（A）尾， 因此仅mRNA可被逆转录。
• PCR（Polymerase Chain Reaction)技术即
聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。 • 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发 明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外 DNA 分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术基本原理及相关知识PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA分子。
PCR技术革命性地改变了分子生物学的研究和应用领域，并且在医学、农业、环境科学等领域具有广泛的应用。
以下是PCR技术的基本原理及相关知识。
1. 变性（Denaturation）：将目标DNA融合成两条单链，使其成为单股DNA。
在PCR反应开始时，样本中的DNA经过高温处理（通常为95°C），使其双股DNA分离，形成单股DNA。
2. 退火（Annealing）：通过引入两个特异性引物，使其与目标DNA的靶序列互补结合。
延伸引物是由短的DNA或寡核苷酸片段（18-24个核苷酸）组成的特定DNA序列，它与目标序列的两端相互补。
在PCR反应温度较低时（通常为50-65°C），引物结合到目标DNA的两端。
3. 延伸（Extension）：通过DNA聚合酶的催化，将引物与目标DNA形成的复合物延长，生成新的DNA分子。
在PCR反应中，引物延长所需要的二倍体DNA将通过DNA聚合酶的催化作用来实现。
DNA聚合酶能够识别引物与模板DNA之间的同源性，并在引物的3'末端开始合成新的DNA链。
以上三个步骤组成一个PCR循环，每个循环将扩增目标DNA的数量。
通常，在30-40个PCR循环后，目标DNA的量将扩增到百万级。
1.DNA模板：DNA模板是PCR反应的起点，它可以是基因组DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
2.引物设计：引物的选择非常重要，引物应该与目标DNA序列的两端相互补，以确保引物的有效结合和延长。
3. DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR反应的催化剂，通常使用热稳定聚合酶（如Taq聚合酶）。
热稳定聚合酶能够在高温下保持稳定，并且具有较高的DNA聚合活性。
4.PCR缓冲液：PCR反应需要在特定的pH和离子浓度条件下进行，PCR缓冲液可以提供适宜的反应环境。
5.循环条件：PCR反应需要在特定的温度条件下进行循环反应。
PCR操作步骤及结果
PCR操作步骤及结果PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种体外放大特定DNA片段的技术，具有高效、快速和特异性的特点。
下面将详细介绍PCR的操作步骤及其结果。
一、PCR的操作步骤：1.模板DNA制备：-从样品中提取DNA，常见的提取方法包括CTAB法、盐溶法和商用DNA提取试剂盒等。
-根据实验需求，选择合适的DNA浓度作为PCR的模板。
2.PCR反应体系的配制：PCR反应体系由模板DNA、引物、dNTPs（四个单核苷酸）、缓冲液和聚合酶等组成。
-引物：引物是PCR反应中的两个短链DNA分子，分别与待扩增的目标DNA的两个互补区域序列相配对。
-dNTPs：dNTPs是脱氧核苷酸，包括A、T、C和G四种，供给聚合酶合成新DNA链使用。
-缓冲液：缓冲液用于提供合适的pH值和离子环境，维持PCR反应的正常进行。
-聚合酶：聚合酶是PCR反应的酶，能够识别引物，并在引物上逐个添加dNTPs，合成新的DNA链。
3.PCR循环反应：PCR反应主要包括三个步骤：变性、引物结合和延伸。
-变性：将PCR反应混合液加热至95°C，使模板DNA的双链解开，得到两条单链DNA。
-引物结合：将PCR反应体系降温至合适的温度（通常为45-65°C），使引物与单链DNA的互补区域结合。
-延伸：将PCR反应体系升温至聚合酶的最适温度（通常为65-75°C），聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链，延伸特定的目标序列。
4.PCR循环程序：PCR的循环程序通常分为三个阶段：变性、引物结合和延伸。
-变性：95°C，持续时间为30秒至2分钟。
用于使DNA变性，并解开双链。
-引物结合：温度通常为45-65°C，持续时间为20秒至1分钟。
用于引物与模板DNA的互补区域结合。
-延伸：温度通常为65-75°C，持续时间为0.5-2分钟。
用于聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链。
简述PCR的基本原理和步骤及步骤要点
简述PCR的基本原理和步骤及步骤要点PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它能够快速而准确地扩增DNA片段。
本文将对PCR的基本原理、步骤以及步骤要点进行简述。
基本原理PCR基于DNA的复制原理，通过不断重复三个基本步骤（变性、退火和延伸）来扩增特定DNA片段。
具体而言，PCR需要以下三种主要成分：DNA模板、引物和聚合酶。
1.DNA模板：PCR需要从中复制目标DNA片段的DNA模板。
该DNA可以是从细胞中提取的总DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
2.引物：引物是两个短的DNA片段，其中一个与目标DNA片段的起始位置互补，另一个与目标DNA片段的末端互补。
引物的作用是提供了PCR反应的起始点。
3.聚合酶：聚合酶是PCR反应中的关键组分，它能够在退火温度下从引物的起始点开始，沿着DNA模板链合成新的DNA链。
PCR的基本原理是通过不断重复以下三个步骤来扩增目标DNA片段。
步骤及步骤要点1.变性：在PCR反应的第一步，反应混合液中的DNA模板被加热到高温（通常为94-98℃），使DNA双链解开成两条单链（变性）。
•高温变性有助于断开DNA双链的氢键，使之成为两条单链。
2.退火：在PCR反应的第二步，反应混合液被冷却到较低的温度（通常为50-65℃），使引物与目标DNA片段互补结合。
•引物与目标DNA片段的互补配对使得引物能够定位在目标DNA片段的特定位置。
3.延伸：在PCR反应的第三步，反应混合液被加热到适合聚合酶活性的温度（通常为72℃），使聚合酶从引物的起始点开始合成新的DNA链。
聚合酶能够识别引物，在引物的3’端添加互补的核苷酸，从而合成新的DNA 链。
这三个步骤组成了一次循环，形成一个PCR循环。
每个PCR循环都会使目标DNA 片段的数量成倍增加。
通常，进行20-35个PCR循环，即可扩增到足够的DNA量以进行后续分析。
需要注意的是，PCR反应需要针对具体的目标DNA片段选择合适的引物，在设定的PCR温度条件下进行。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。
该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。
这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。
2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。
这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。
二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。
2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。
3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。
5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。
三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。
2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。
3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。
4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。
四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。
2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。
3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。
4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。
五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR（聚合酶链反应）是一种体外扩增DNA片段的技术，由Kary Mullis在1983年发明。
自那时以来，这项技术已成为分子生物学、遗传学、医学和法医学等领域的基础工具。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的原理是利用DNA聚合酶对DNA进行复制的过程。
通过循环加热和冷却的过程，将目标DNA序列扩增到数百万份甚至数十亿份。
每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
二、PCR所需材料与设备1. 材料：模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、缓冲液等。
2. 设备：PCR仪（热循环器）、离心机、电泳设备、凝胶成像系统等。
三、PCR反应体系的建立一个标准的PCR反应体系通常包含以下成分：- 模板DNA：10-100 ng- 正向引物和反向引物：各0.5-2 μM- dNTPs：每种200 μM- 缓冲液：1X- Taq DNA聚合酶：1.5-2 U- 无菌水：补足至总体积20-50 μL四、PCR反应条件设置1. 变性：94℃，1-3分钟2. 退火：根据引物Tm值设定，一般为55-65℃，持续时间15-30秒3. 延伸：72℃，持续时间1-2分钟4. 循环次数：通常为25-35次五、PCR产物分析1. 凝胶电泳：是最常用的PCR产物分析方法，可以直观地观察PCR产物的大小和数量。
2. 克隆和测序：对于需要进一步研究的PCR产物，可以通过克隆和测序来确定其精确序列。
六、PCR的应用1. 遗传病诊断：如地中海贫血、囊性纤维化等遗传病的基因诊断。
2. 法医鉴定：如亲子鉴定、个体识别等。
3. 病原体检测：如HIV、乙肝病毒、新冠病毒等的检测。
4. 肿瘤基因检测：如BRCA1/2突变的检测。
5. 生物科技研究：如基因克隆、基因表达分析等。
七、PCR实验常见问题及解决办法1. 无扩增产物：可能的原因有模板质量差、引物设计不合理、PCR条件不合适等。
可通过优化模板提取、重新设计引物或调整PCR条件来解决。
pcr实验知识点总结
PCR实验的深度解析引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在分子生物学中广泛使用的体外核酸扩增技术。
自1983年由Kary Mullis首次提出以来，PCR技术已经在生物医学研究、临床诊断和法医鉴定等领域发挥了重要作用。
本文将详细阐述PCR实验的相关知识点，以期帮助读者深入理解并掌握这一关键技术。
一、PCR的基本原理PCR过程主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性阶段，双链DNA被加热至90-95℃，使两条互补链分开；在退火阶段，温度降低至40-60℃，引物与模板DNA通过碱基配对结合；在延伸阶段，DNA聚合酶在适宜的温度下催化dNTPs加入到引物3'端，形成新的DNA链。
这三个步骤循环进行，使得目的基因得以指数级扩增。
二、PCR实验的主要步骤1. 设计引物：根据需要扩增的目标区域设计一对正反向引物，引物长度通常为18-25个核苷酸，Tm值一般在55-65℃之间。
2. 制备反应体系：包括模板DNA、引物、dNTPs、缓冲液和热稳定DNA聚合酶等成分。
3. PCR程序设置：设定各步的温度和时间，如变性95℃ 30s，退火55℃30s，延伸72℃ 1min，循环30-35次。
4. PCR产物检测：常用的方法有琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR等。
三、影响PCR的因素1. 引物的设计：引物的特异性和亲和力直接影响PCR的效率和准确性。
2. 反应条件：包括Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板浓度和循环次数等因素，需根据实际情况进行优化。
3. 污染控制：PCR实验对污染极为敏感，操作过程中应严格遵守无菌操作规程。
四、PCR的应用1. 基因克隆：通过PCR扩增特定基因片段，用于后续的基因克隆和表达。
2. 基因测序：通过PCR扩增目标基因，进行序列分析。
3. 病原体检测：利用PCR技术检测病毒、细菌等病原体。
4. 法医鉴定：利用STR分型技术进行个体识别。
PCR具体操作时用
PCR具体操作时用引言PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链反应，是一种在生物学和分子生物学研究中常用的实验技术，用于扩增特定DNA片段。
PCR具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用领域，因此在基因工程、医学诊断、生物学研究等领域发挥着重要作用。
本文将介绍PCR具体操作时常用的试剂和设备，以及操作步骤和注意事项。
试剂和设备试剂•DNA模板：需要扩增的DNA片段的起始材料。
•增值引物（Primers）：针对待扩增片段的两个段位特异性引物。
•dNTPs：脱氧核苷三磷酸，为PCR过程提供扩增所需的四种脱氧核苷酸。
•缓冲液：提供适宜的酶活性环境，保持pH的稳定和缓冲能力。
•DNA聚合酶（Taq酶）：常用的DNA聚合酶，能耐高温。
设备•PCR仪：用于控制反应液的温度和时间。
•离心机：用于离心反应液和分离沉淀物。
•电泳仪：用于电泳分离扩增产物。
操作步骤1.准备反应液根据PCR所需物质的浓度和体积计算，将DNA模板、引物、dNTPs、缓冲液和聚合酶按比例加入一条无菌试管中，形成PCR反应液。
2.加热将PCR反应液放入PCR仪中，按照设定的程序进行加热。
一般来说，PCR反应需要经历以下几个温度环节：变性、退火和延伸。
3.循环根据所需扩增序列的长度和反应条件，将PCR循环进行多次。
每一次循环包括温度的升高和降低。
4.检测扩增产物取出PCR反应液，通过电泳将反应液中的扩增产物进行分离。
利用染料染色或其他检测方法，观察分离出的扩增产物，并进行分析和测定。
注意事项1.实验条件和参数要准确，包括反应体系的组成、引物浓度、温度和时间的控制等。
2.手术无菌操作，防止污染物污染反应液。
3.DNA模板应纯净，避免引入其他杂质。
4.引物的设计要合理，能够选择性扩增所需片段。
5.扩增产物要进行正确的电泳和检测，确保准确性和可靠性。
结论PCR是一项广泛应用于生物学研究的重要技术。
它在医学、遗传学、生物工程等领域发挥着重要作用。
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常见问题
2.为什么出现多条非特异性条带？
①反应体系被污染。
②引物特异性差。
③退火温度不合适。
常见问题
3.为什么PCR产物很少？
①聚合酶活性过低。
②循环次数偏低。
③模板DNA浓度过低。
常见问题
4.为什么PCR产物出现片状拖尾？
①DNA聚合酶过多或酶活性差。
②dNTP和Mg2+浓度过高。
③退火温度过低，PCR循环数偏多。
逆转录PCR的原理
逆转录PCR的反应体系
1、模板RNA
2、逆转录酶
3、逆转录引物
变性
• 94℃ 30s
93-96℃，较高的温度变性 更快更彻底，尤其是对富含G+C 的靶序列而言。
退火
• 45~65℃ 30s
退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
高温变性
低温退火
中温延伸
• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。 • 实际：由于引物和底物的消耗， 酶活力的下降等因素，扩增产物 的增加，逐渐由指数形式变为线 性形式，所以实际上进行30个循 环后，扩增倍数一般可达106 ～ 107。
Easy Taq：1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min FastPfu: 2-4kb/min
循环数：
在其他参数都已优化的条件下， 最适循环数取决于靶序列的初始浓 度。一般情况下30-35个循环即可。
循环数太多：会增加非特异扩增产 物的数量和复杂性。 循环数太少：PCR产量太低。
④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。
⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非 特异扩增。
普通PCR仪
温度梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
引物设计的目的
为了找到一对合适的核苷酸片段， 使其能有效地扩增模板DNA序列。 引物是PCR特异性反应的关键，同 时也与PCR扩增的效率密切相关。 引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
延伸
• 72℃ 30s
延伸的温度通常为所以DNA聚合 酶的最适工作温度，一般为72℃； 延伸的时间主要取决于目的片段的 大小，不同种类的聚合酶的合成效 率也不同，因此还与DNA聚合酶的种 类有关。
Real-Time PCR引物设计原则
6、要特别注意避免引物二聚体和非特 异性扩增的存在。 7、Real-Time PCR引物的扩增产物应 跨外显子，最好是引物能跨外显子的 接头区，以避免基因组DNA污染影响。
引物设计常用软件
Primer Premier 5.0 Oligo 6
Primer 3（在线）
• PCR（Polymerase Chain Reaction)技术即
聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。 • 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发 明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外 DNA 分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
变性
循 环
退火
延伸
终延伸
举个例子
PC1-P20：
模板：基因组DNA；产物：506bp
PCR体系（10 μL）
模板：1 μL 上游引物：0.2 μL 下游引物：0.2 μL Easy Taq 酶：0.1 μL Easy Taq Buffer：1 μL dNTP：0.8 μL ddH2O：6.7 μL
一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR 扩增效率下降或失败。
对于20bp左右的引物：
Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引 物Tm值低5℃左右。
引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
逆转录引物：
（1）随机六聚核苷酸引物
仅长6个核苷酸，每个核苷酸位点上随 机加入4中不同的脱氧核苷酸，因此是46中 不同引物的集合体。 所有RNA分子均可以充当模板，合成的 cDNA中有96%来自rRNA。
逆转录引物：
（2）Oligo（dT） 仅由dTTP构成，长度一般为1824个核苷酸。 识别mRNA的3’端poly（A）尾， 因此仅mRNA可被逆转录。
管家基因
持家基因(house-keeping genes)：又称管家基因，是指所有细胞中均要 表达的一类基因 ,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。管家基因 表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几 乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与 RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。
Primer-BLAST（在线）
File
New
DNA sequence
粘贴模板序列
引物搜索
引物长度 引物位置
产物大小
Oligo
Primer BLAST
逆转录PCR的原理
由一条RNA单链转录为互补DNA （cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由依 赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完 成。
③PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功
进行特异性扩增的模板。
常见问题
1.为什么完全没有PCR扩增产物？
①试剂质量问题或者加样时出错，导致反应 体系不完整。 ②聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。 ③PCR仪温度控制不精确。 ④模板DNA发生降解。 ⑤引物或反应温度设计不合理
⑥靶片段GC含量过高或扩增对象长
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
引物设计的基本原则
2、避开易形成二级结构的模板序列区域。
PCR扩增体系
模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
扩增产物长度。
DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的机
器。扩增效率和保真性。
缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子强度，为
PCR扩增曲线
1.早期（E期）:引物在单链 DNA模板上搜索互补序列 ， 并与特定位点杂交。 2.中期（M期）：扩增反应 顺利进行，产物呈指数型增 长。 3.晚期（L期）：平台期， DNA聚合酶过度损耗或者产 物的抑制。
PCR扩增条件
预变性
• 94℃ 5min • 94℃ 30s
• 45~65℃ 30s • 72℃ 30s • 72℃ 7min
系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最
后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
灰度值（IOD值）
用凝胶成像系统自带的分析软件分析目的条带的平均密度值，也称为灰度 值。是density和area的乘积。
平台效应
PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA 片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物-模 板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物 的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡 核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
半定量 RT-PCR
基本概念
半定量 RT-PCR （ semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特 异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增， 并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。 定量RT-PCR（quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体
• A260/A280和A260/A230
– A260/A280在 1.8-2.0时，认为 RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，当 用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。 – 当 R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明 RNA已 经水解成单核酸了。 – A230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸 A260/A230的比值大于2.0 。
PCR反应条件
94℃ 94℃ 56.2℃ 72℃ 72℃ 4℃ 5min 30s 30s 30s 7min ∞
30个循环
PCR的注意事项
1.避免PCR试剂的污染 2.最适合的反应条件
3.设置对照组：
①PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。
②PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片
段代替目的模板。
引物设计的基本原则
7、引物自身及引物之间不应存在互补 序列。