鲎试剂灵敏度复核记录
细菌内毒素测定技术—鲎试剂灵敏度复核和方法验证试验
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
二、鲎试剂灵敏度的复核 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于内毒素 检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
知识点：干扰试验
一、干扰试验 是为了确定供试品在多大的稀释倍数或 浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为产 品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品 的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对 照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。
编号
内毒素浓度
被加入内毒素的溶液 平行管数
A
无
供试品溶液
至少2
标准曲线的中点（或附近点
B
）的浓度（设为λm）
C
至少3个浓度 （最低一点设定为λ）
供试品溶液 检查用水
至少2 每一浓度至少2
D
无
检查用水
至少2
A 为稀释倍数不超过MVD 的供试品溶液。B 为加入了标准曲线中点或 靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A 有相同稀释倍数的供 试品溶液。C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备 标准曲线的标准内毒素溶液。D 为阴性对照。
浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml 表示。当使用新批号的 鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进 行鲎试剂灵敏度复核试验。
复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检 验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。
QC-7129B鲎试剂灵敏度复核操作规程
正文规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。
适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。
质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。
USP版附录85；CP版附录Ⅺ E 。
细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。
鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。
细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
细菌内毒素标准品：USP细菌内毒素参考标准品(RSE)或已标定的细菌内毒素工作标准品(CSE)。
反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。
一、试剂、材料与仪器设备试剂：鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。
细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。
细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。
材料及仪器设备：电热恒温水箱型号、设备编号。
电热鼓风干燥箱型号、设备编号。
漩涡混合器型号。
无热原试管规格：1075mm。
正文无热原玻璃瓶规格：25ml。
无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。
试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。
二、试验准备试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。
试验操作过程应避免微生物的污染。
三、内毒素溶液配制细菌内毒素标准品系列溶液配制取RSE或CSE 1瓶，按照使用说明书加入规定量的细菌内毒素检查用水使溶，并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。
鲎试剂灵敏度实验记录检查记录(01版)
检验编号：
一、鲎试剂
批号
标示灵敏度
EU/ml
供样单位
规格
生产单位
检验数量
检验目的
灵敏度复核
检验日期
年月日
检验依据
《中华人民共和国药典》（2005年版）二部
二、标准品
WSE批号
效价
EU
来源
BET水批号
规格
ml/支
来源
内毒素标准品复溶时的体积为ml；稀释方法为：取0.1ml内毒素标准溶液，加入0.9mlBET水，即为1→10稀释液，取1→10稀释液0.5ml，加入BET水0.5ml，即为0.5EU/ml内毒素标准溶液。
三、反应结果（温度：℃时间：分钟）
内毒素浓度
2.0λ
1.0λ
0.5λ
0.25λ
阴性对照
反应终点浓度
重
复
管
数
1பைடு நூலகம்
2
3
4
结果是否有效
计算结果
结果判断
检验员
复核员
鲎试剂干扰试验检查记录
鲎试剂干扰试验检查记录
1.0 干扰试验预试验
将内毒素检查阴性的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大稀释倍数不得超过MVD= C*L/λ0.03(0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度)。
使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。
每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照管（即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度）。
另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。
2.0 干扰试验
检验人：检验日期：复核人：复核日期：。
细菌内毒素检查记录
细菌内毒素检查记录(总3页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March四川德阳食品药品检验所细菌内毒素检查记录（首页）总页分页检品编号：检验日期：检品名称：实验地点：一、标准规定的细菌内毒素限度（L）为：二、供试品溶液的制备：1、预试验确定的MVD为倍。
2、取本品 ml，加细菌内毒素检查用水 ml，摇匀，精密量取 ml，加细菌内毒素检查用水 ml，摇匀，即得。
三、试验用细菌内毒素溶液的制备：1、取一支细菌内毒素工作标准品，加入 ml细菌内毒素检查用水 ml，使溶解，得EU/ml的试验用细菌内毒素溶液。
2、取 ml（ EU/ml），加入 ml细菌内毒素检查用水（ EU/ml）3、取 ml（ EU/ml），加入 ml细菌内毒素检查用水（ EU/ml）4、取 ml（ EU/ml），加入 ml细菌内毒素检查用水（ EU/ml）5、取 ml（ EU/ml），加入 ml细菌内毒素检查用水（ EU/ml）6、取 ml（ EU/ml），加入 ml细菌内毒素检查用水（ EU/ml）四、供试品阳性对照溶液的制备：1、取 ml（ EU/ml），加入 ml供试品溶液（ EU/ml）2、取 ml（ EU/ml），加入 ml供试品溶液（ EU/ml）3、取 ml（ EU/ml），加入 ml供试品溶液（ EU/ml）4、取 ml（ EU/ml），加入 ml供试品溶液（ EU/ml）5、取 ml（ EU/ml），加入 ml供试品溶液（ EU/ml）6、取 ml（ EU/ml），加入 ml供试品溶液（ EU/ml）检验者：校对者：室负责人：四川德阳食品药品检验所细菌内毒素检查记录（附页）总页分页检品编号：检验日期：检品名称：实验地点：仪器设备：恒温箱（型号）保温温度：保温时间：自至结论：本品按《中国药典》2005年版二部附录XI E检验依据检验，结果检验者：校对者：室负责人：。
鲎试剂灵敏度复核试验资料
文件编号：版本：鲎试剂灵敏度复核试验作业指导书修订历史记录[至多存五版的历史修订记录]1.0 目的对细菌内毒素检查试验所用的鲎试剂的灵敏度进行复核。
2.0 职责质量与法规部负责本规程的起草，QC及相关人员执行本规程。
3.0 范围适用于本公司细菌内毒素检查法。
4.0 参考文件2010年版《中国药典》二部附录ⅪE细菌内毒素检查法2010年版《中国药品检验标准操作规范》细菌内毒素检查法《细菌内毒素检查法及其应用》第一版，气象出版社5.0 定义鲎试剂灵敏度复核试验：在细菌内毒素检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度（λ），用EU/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
反应终点浓度：指鲎试剂灵敏度复核试验中，系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
6.0 设备/工具及物料6.1 设备/工具6.2 物料6.2.1 细菌内毒素工作标准品除另有规定外，使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
6.2.2 细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml（凝胶法）且对内毒素试验无干扰的灭菌注射用水。
6.2.3 鲎试剂规格一般选用0.25 EU/ml。
7.0 操作步骤7.1 提前30 min开启超净工作台，试验操作过程中不要开启风机，完毕后用75%乙醇擦拭超净工作台。
试验操作过程应防止微生物和细菌内毒素污染。
7.2 制备细菌内毒素标准溶液7.2.1 取细菌内毒素工作标准品1支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部划痕，用75%乙醇擦拭后启开，避免玻璃屑落入瓶内。
7.2.2 按照工作标准品说明书，加入细菌内毒素检查用水溶解。
封口膜封口，置漩涡混合器上混匀15 min后用细菌内毒素检查用水进行稀释，制成2.0 λ、1.0 λ、0.5 λ、0.25 λ四个浓度的内毒素标准溶液。
每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30 s。
内毒素——精选推荐
细菌内毒素检查法1 目的该SOP用来判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。
2适用范围该SOP适用于《中国兽药典》要求检查该项的药品和适合《中国兽药典》要求的其它品种的药品的细菌内毒素检查。
3职责进行该项检验的检验员应该按该SOP进行检验，检测室主任负责监督该SOP的正确执行。
4检验4.1 技术依据及原理本法系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应即内毒素在二价阳离子的参与下，作用于鲎血凝集酶系统而发生的一系列酶联反应，最后形成凝胶，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。
4.1.1 鲎试剂灵敏度复核试验项的目的不仅是考查鲎试剂和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在将一批新的鲎试剂用于干扰试验或供试品细菌内毒素检查前应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
4.1.2 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
4.1.3检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
4.2注意事项4.2.1实验前，须用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒4.2.2实验时，须戴工作帽和口罩。
尤其在配制洗液和洗涤玻璃器皿时一定要戴手套、工作帽和口罩。
4.2.3试验应在洁净室或洁净工作台内进行。
4.2.4用移液管或刻度吸管等吸取样品时，须使用洗耳球，勿用嘴吸、吹，防止唾液溅入。
也可使用加样器等其它方法。
4.2.5 注意所用鲎试剂的批号、有效期、规格、灵敏度等。
4.2.6进行干扰实验时，标准对照和供试品阳性对照（含供试品的内毒素溶液）应同时进行。
4.2.7在进行灵敏度复核、干扰试验和供试品内毒素检查时，各个实验所要求的对照应同时进行，并在有效的条件下才能进行计算和判断。
4.3材料、仪器、试剂的准备及基本要求4.3.1天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。
鲎试剂灵敏度复核记录
鲎试剂灵敏度复核试验记录
一 仪器设备
试管恒温仪
二 鲎试剂 检验日期： 年 月 日
批号：
灵敏度： EU/mL
供养单位：
规格： mL/支（瓶）
生产单位：
有效期： 年
检验目的：灵敏度考核
检验数量： 支（瓶）
检验依据：中国药典 年版
三 标准品
NES批号：
效价： EU 来源：
WSE 批号：
NC
反应终点浓度
重 1
复 2
管 3
数 4结果是否有效计算结果结果判断检验人员
效价： EU 来源：中国药品生物制品检定所
BET水批号：
规格： mL/支 来源：福州新北化工业有限公司
内毒素标准品复溶时的体积为 mL，稀释方法为：用刻度吸管准确吸取内毒素检查用水1mL制成细菌内毒素标准液。
四 反应结果 （反应起止时间： ～ ） 室温： ℃
内毒素浓度
λ λ λ λ
（ ） （ ） （ ） （ ）
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文件名称File Name Record of Review for Limulus
Reagent Sensitivity
File Number
REC-SOP-C003059-01
-02
生效日期Effective Date 2018-10-18
有效期至
Expiry Date
2021-10-17
审批及颁发/APPROV AL & ISSUANCE
部门签名日期起草质量控制部
审核
质量控制部
质量保证部
批准质量负责人
颁发质量保证部
会审/COLLECTIVE REVIEW
部门签名日期部门签名日期/ / /
分发/DISTRIBUTION
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质量保证部质量控制部/
文件名称File Name Record of Review for Limulus
Reagent Sensitivity
File Number
REC-SOP-C003059-01
-02
生效日期Effective Date 2018-10-18
有效期至
Expiry Date
2021-10-17
变更历史/CHANGES
版本号修改简述提出人生效日期
01 由原文件RE-C003060《鲎试剂灵敏度复核记录》变
更而来；文件编码改变。
魏永红2017-06-01
02 增加所使用仪器及试剂的信息汪华2018-10-18 附：记录样张
REC-SOP-C003059-01-02
鲎试剂灵敏度复核记录
Record of Review for Limulus Reagent Sensitivity 起草人/日期审核人/日期批准人/日期执行日期
2018-10-18 制订依据SOP-C003059 《细菌内毒素检查法标准操作规程》
1 试剂鲎试剂批号：；规格： ml×支；
生产厂家：□湛江安度斯生物有限公司；□福州新北生化工业有限公司；
细菌内毒素检查用水批号：；规格： ml×支；内毒素含量： EU/ml；
生产厂家：□湛江安度斯生物有限公司；□福州新北生化工业有限公司；
细菌内毒素标准品批号：；规格：支/盒；效价：______EU/支；
生产厂家：□中国药品生物制品检定所；□；
2 仪器试管恒温仪型号：TAL-40D 编号：□QC-187 □QC-216 □QC-217
3 操作根据鲎试剂灵敏度标示值（λ）将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混匀15分钟，然后制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。
每稀释一步均在旋涡混合器上混匀30秒钟，按检查法项试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管。
保温时间： ~
浓度
2.0λ 1.0λ0.5λ0.25λ阴性对照
管别
管 1
管 2
管 3
管 4
〈注：结果判断以＋、－表示阳性、阴性〉
如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
计算公式：λc＝lgˉ1（∑X／4）
＝
＝
X为反应终点浓度的对数值（lg）
当λc在0.5λ-2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
4 结论：该批鲎试剂的灵敏度为 EU/ml。
检验人/日期：复核人/日期：。