动态显色法内毒素检测鲎试剂盒使用说明书
细菌内毒素检查操作程序
细菌内毒素检查操作程序1 概述：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/mL的灭菌注射用水。
2 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理检测的方法。
2.1 材料准备2.1.1 0.1ml/支规格及灵敏度的鲎试剂，细菌内毒素检查用水以及细菌内毒素国家标准品或工作标准品。
2.1.2 恒温器、旋涡混合器、试管架、计时器、剪刀、封口胶布、砂轮片、酒精棉球、酒精灯、灭菌的1ml玻璃注射器、烘箱。
2.2 实验操作2.2.1 接通恒温器电源，将温度调节至37℃±1℃。
2.2.2供试品稀释2.2.2.1 当供试品需要控制的内毒素限值大于鲎试剂灵敏度时，需要对供试品进行稀释，计算公式如下：MVD＝L/λMVD：供试品的最大有效稀释倍数L：供试品需控制的内毒素限值（EU/mL）λ：鲎试剂灵敏度值（EU/mL）2.2.2.2[举例]某供试品需要控制的内毒素限值为5EU/ml，使用灵敏度λ＝0.25EU/mL 的鲎试剂作细菌内毒素检查.MVD＝5EU/ml / 0.25EU/mL＝20倍。
即供试品需作1:20稀释后再作检查。
若检查结果为阳性，表明供试品内毒素含量≥5EU/ml，超过限值；若检查结果为阴性，表现供试品内毒素含量＜5EU/ml，低于限值。
2.3 检查操作2.3.1供试品溶液制备：取0.2g糖粉，加入2ml检查用水稀释，混匀，备用。
2.3.2 取0.1ml/支规格的鲎试剂8支，折断（或割断）安瓿颈，其中2支作为供试品管，2支作为阴性对照管，2支作为阳性对照管。
2支供试品阳性管。
2.3.3 阴性对照管加入0.2ml水，其余各管加入0.1ml水复溶；供试品管各加入0.1ml 供试品溶液，阳性对照管加入0.1ml2.0λ浓度的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml供试品阳性对照溶液[用被测供试品溶液将同一支细菌内毒素工作标准品制成2.0λ浓度的同毒素溶液。
鲎内毒素(endotoxin)说明书
鲎内毒素内毒素（（endotoxin ）酶联免疫酶联免疫分析分析试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围检测范围：： 96T0.03Eu/L – 0.8Eu/L使用目的使用目的：：本试剂盒用于测定鲎血清、血浆及相关液体样本中内毒素（endotoxin ）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鲎内毒素（endotoxin ）水平。
用纯化的鲎内毒素（endotoxin ）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入内毒素（endotoxin ），再与HRP 标记的内毒素（endotoxin ）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的内毒素（endotoxin ）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中鲎内毒素（endotoxin ）浓度。
试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（1.6Eu/L ） 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6显色剂B 液6ml ×1/瓶12密封袋1个标本标本要求要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
细菌内毒素检查法和操作规程
******有限公司标准操作规程目的建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。
适用范围所有原料、成品的细菌内毒素检查。
责任人QC检验员内容1 简述1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。
1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。
供试品检测时可使用其中任何一种方法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.3 本规范适用于凝胶法检查。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。
1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素******有限公司标准操作规程的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
2实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。
2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。
鲎试剂使用说明书
凝胶法鲎试剂使用说明书一、检测步骤1、标准品稀释：开启后加入检查用水（W）1.2ml，置漩涡混合器上混合5min，得到浓度为10EU/ml的内毒素溶液，标记为（E10），其余各梯度稀释方法如下：0.3ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5mlE10 －－－→E1－－－→E0.5－－－→E0.25－－－→E0.125－－－→E0.06－－－→E0.032.7mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW此步骤为新开启标准品者操作，各梯度做好标记，其余操作人员可直接使用。
2、取鲎试剂8支，折断安瓿瓶颈，其中2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管，做好标记。
3、阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水，每支供试品检查管另加入0.1ml供试品；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ（即0.1ml 的E0.125）内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ（即0.1ul 的E1）内毒素的供试品。
4、封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃的恒温金属浴中60min，然后取出观察结果。
在孵育期间避免任何震动！二、结果判断1、将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，若管内形成凝胶，不变形，不滑落者为阳性，记录为（+）；反之为阴性，记录为（—）。
取出试管应尽量避免受到震动造成假阴性结果！2、阴性对照管必须为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管必须为阳性，否则实验结果无效。
3、若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或检查用水货实验器具受到污染；若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价标示不准，或实验条件不满足；若供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑制反应的干扰因素存在。
内毒素LAL检测使用说明(中文版)
Page 1前协议定量检测协议ToxinSensor™显色 LAL 内毒素检测试剂盒执行所有的测试步骤，在室温下。
操作前请使用认证的内毒素免费产品。
样品制备所有材料或稀释剂用于标本收集和准备，测试试剂必须无内毒素。
在任何时候都使用无菌技术。
待测样品必须存储在所有细菌活动受阻的方式中。
例如，样品之前使用，24 小时内可以存储在 2-8 ° C，但长期使用需要冻结。
pH溶解或稀释试样用 LAL 试剂水。
由于 LAL 内毒素反应是依赖 ph的，故样品的 pH 值应为 6-8，确保良好的线性度。
因此，如有需要，我们推荐使用氢氧化钠 (0.1 N，溶解在LAL试剂水中) 或盐酸 (0.1 N，LAL 试剂水稀释)调pH 值。
I.试剂制备、鲎试剂溶解物 (LAL)再造冻干裂解液加 1.7 毫升 LAL 试剂水。
轻轻打旋每个组成30 秒，避免起泡。
再造裂解液如果存储在-20 ° C，可以保持稳定一周，不推荐tonger 存储。
避免反复冻融。
Page 2继续ToxinSensor™ 显色 LAL 内毒素检测试剂盒显色底物重建衬底加入1.7 毫升 LAL 试剂水浓度至~ 2 mM。
一旦重建，底物溶液存储在2-8 ° c可以保持稳定一个月。
防止底物溶液长时间直接接触光。
终止液重组颜色稳定剂 #1 （终止液）用 10 毫升的缓冲液。
重组终止液如果存储在 2-8° c可以保持稳定一周。
重组颜色稳定剂 #2 和 #3 : 每个添加 10 ml LAL 水。
每个重组液在 2-8 ° c下可以保持稳定一周。
标准内毒素的溶液此试剂盒中提供的冻干的内毒素标准量应参考内毒素标准液瓶上的标签。
加 2ml的 LAL 试剂水溶解冻干的内毒素。
涡漩充分混匀 15 分钟以获得内毒素贮备液。
重组后的内毒素贮备液若存储在 2-8 ° C可保持稳定一周请不要冻结内毒素贮备液。
Page3II。
内毒素检测试管定量显色基质法缩写
内毒素检测试管定量显色基质法缩写鲎试验试剂盒(试管定量显色基质法)是利用人工合成的显色基质与鲎试剂发生显色反应，定量检测内毒素。
反应时间短至16分钟，满足快速检测的需要。
该显色基质鲎试剂不依赖凝血蛋白形成凝胶，抗干扰能力强。
配用偶氮染料灵敏度高，可避免有色样品的颜色对鲎试验的干扰。
在水浴锅中孵育，检测结果可用分光光度计或普通酶标仪读取。
它可以应用于背景颜色为浅黄色的样品，如血浆和血清样品。
配套鲎试验微生物快速检测系统ELx808IULALXH可实现鲎试验微量化，自动化及标准化。
一、标准曲线做不好？是何原因？每试剂盒可做两条标曲，分别为0.1--1.0EU/ml或者0.01--0.1EU/ml；现在以0.1--1.0EU/ml为例：相应内毒素吸光度值分别是0.1、0.25、0.5、1.0EU/ml左右；①仔细阅读说明书（特别是内毒素标准品说明书，如是血液样品，外加一份样本处理液说明书），确保操作步骤无误！②内毒素是否有充分振摇？纯手摇几下或者摇床摇匀效果均不佳，内毒素摇匀要用漩涡振荡器震荡。
③鲎试剂是否剧烈振摇？鲎试剂要在**钟内用完，所以先配置好内毒素工作标准品和样品，再溶解鲎试剂，鲎试剂榕溶解后轻轻混匀静置20秒。
④温育时间与温育温度是否有保证？培养箱温育效果不好，选择水浴。
控制温育时间就要求加快加样速度且避免污染（温育时，整个试管上盖上铝箔纸即可，无需封口膜封口以节约时间）二、样本如何检测？样本初次检测需要做预实验确定样本浓度范围，建议先做0.1-1.0EU/ml标准曲线来确定样本浓度，如果测出样本超过标曲上限则选择稀释样本，若超过样本下限，则选择另一条标曲即0.01--0.1EU/ml进行检测。
确定选用标准曲线后样本还需要做干扰实验验证实验的可靠性，详见说明书或中国药典。
三、血样选择什么试剂盒？血浆样本一般为含氮化试剂的鲎变形细胞溶解物试剂盒(试管法)，抗干扰能力强。
提醒客户在进行实验前用样品处理溶液进行处理。
2005年版中国药典 《细菌内毒素检查法》
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》凝胶法鲎试剂使用说明书【名称】通用名：鲎试剂英文名：Tachypleus Amebocyte Lysate （简称TAL）汉语拼音：hou shi ji本品主要成份为B因子、C因子、凝固酶原、凝固蛋白原。
【用途】专用于细菌内毒素检查。
【性状】本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水和生理盐水中易溶。
【原理】本品为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。
【用法】1．材料和设备1.1选择所需的规格及灵敏度的鲎试剂、细菌内毒素工作品及细菌内毒素检查用水。
1.2准备若干支10ⅹ75mm玻璃反应试管（若使用0.1ml规格的鲎试剂无需准备此试管）、各种规格吸管或移液器或注射器、稀释内毒素用玻璃管、反应试管架、计时器、旋涡混合仪、恒温水浴箱（37±1℃）。
2．实验操作2.1 稀释细菌内毒素工作品：取内毒素工作品（冻干品）1支，按细菌内毒素工作品使用说明书进行操作。
2.2 TAL试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于TAL试剂中，轻轻振摇至少30S至试剂完全溶解。
注意不要引起气泡，溶解后的试剂应在短时间内使用（即配即用）。
2.3 检查操作2.3.1 取分装有0.1ml 鲎试剂溶液的10×75mm试管或复溶后的0.1ml /支规格的鲎试剂原安瓿8支，其中2支作供试品管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。
2.3.2 每支供试品管加入0.1ml供试品；阴性对照管加入0.1ml检查用水；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ内毒素的供试品。
2.3.3 封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟，然后取出观察结果。
试管在孵育期间应避免任何的振动。
[精华]鲎试剂试验方法
![[精华]鲎试剂试验方法](https://img.taocdn.com/s3/m/28cbff01caaedd3383c4d3b4.png)
[精华]鲎试剂试验方法鲎试剂实验方法鲎试剂按实验方法可分为:凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。
凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。
此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。
使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。
厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。
使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。
特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。
目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。
因此不列为独立品种。
动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。
这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。
根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
终点浊度法未见商品化产品。
动态浊度法(又称动态比浊法)是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
动态浊度法的特点为:1. 能准确定量。
2.检测范围宽，可达4个数量级。
3.灵敏度高达0.005EU/ml。
4. 操作简便，系统自动检测分析，一步即成。
5. 经济实用，试剂样品需要量少，可降至50μL。
6. 和微生物检测系统Elx808(配套IU)及专用软件TALgent使用，一次可同时检测多达96个样品。
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动态显色法内毒素检测鲎试剂盒使用说明书
货号：T7570
规格：48T/盒1.7ml
保存：阴凉处，最佳2-8ºC，避光保存。
产品说明：
鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。
在适宜的条件下(温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405）。
反应液的吸光度(OD值)增加,OD值增加的速度与内毒素浓度成正相关。
换言之，OD值上升某一预设限值(启动OD)所需要的时间(定义为启动时间)与内毒素浓度成负相关，启动时间的对数与内毒素浓度的对数成线性关系，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。
试验所需材料和器材：
内毒素工作标准品、鲎试剂、显色基质、细菌内毒素检查用水、除热原试管、除热原吸头、除热原96孔微板（或可拆式板条）、旋涡混合器、移液器、试管架、带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件，例如，微板鲎试仪ELx808及软件TALgent或Gen5。
注意事项：
①该试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。
②接触试剂及供试品的所有器皿必须是除热原的。
试验过程应防止微生物的污染。
该说明书中的除热原指内毒素浓度小于0.005EU/ml。
③供试品的pH值应在6.0–8.0之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1M氢氧化钠或0.1M
盐酸调节。
④当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验，参见【供试品的干扰试验】。
操作步骤：
1、动态光度测定仪器的设定，以鲎试验微生物快速检测系统ELx808IU为例：
预热仪器，设置温育温度为37ºC。
设置模板及程序。
设定读板波长为405nm，设定动力学参数：读板120分钟，每30秒读一次。
2、内毒素标准溶液配制（浓度10，1，0.1，0.01EU/ml）
2.1、取内毒素工作标准品1支，用砂轮沿安瓿颈部划痕，开启，加入适量（建议在0.5ml-1.2ml
之间）细菌内毒素检查用水，置旋涡混合器上剧烈振摇5分钟。
2.2、将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释成所需浓度，每稀释一步均应在旋涡混合器
上剧烈振摇1分钟。
稀释的内毒素溶液静置时间超过10分钟，用前在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟，放置4小时以上的内毒素溶液应丢弃。
(参见《内毒素工作标准品使用说明书》)。
3、阴性对照为细菌内毒素检查用水。
4、鲎试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻摇晃溶解显色基质，再将溶解的
显色基质全部加入到鲎试剂中，轻轻摇晃使鲎试剂完全溶解。
注意不要用旋涡混合器剧烈振摇。
溶解的鲎试剂应在10分钟内使用。
若采用多道移液器，将溶解的鲎试剂转移到除热原加样槽，并轻轻摇匀。
5、实验操作
取除热原微板，在各孔中分别加入100μl细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。
将微板放置于鲎试验微生物快速检测系统ELx808IU中，37ºC预热10分钟。
预热结束，用移液器或多道移液器每孔加入100μl鲎试剂（避免产生气泡!)，中速振摇10秒混匀，于37ºC温育120分钟，并且在405nm波长处，每30秒读一次OD值。
6、数据处理
设定启动OD为0.2，软件自动给出其启动时间(T)。
建立标准曲线：lgT=b lgC+a，其中T为启动时间，C为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截
距。
当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效：
①标准曲线的浓度点≥4，标准曲线的相关系数r≤-0.980，
②标准曲线最低点的T值小于阴性对照的T值，
③供试品平行管的平均值在标准曲线的区间内。
【供试品的干扰试验】
①当对新药或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，必须进行干扰试验；
②当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变，或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，必须重新进行干扰试验；
③当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验。
步骤如下：
1.选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素
浓度，如采用标准曲线为10，1，0.1，0.01EU/ml系列时,可以用供试品配制0.1EU/ml内毒素浓度作为实验的供试品阳性对照。
2.用供试品溶液配制浓度为λm的内毒素溶液（即含λm内毒素的供试品阳性对照），测量出该溶液的
内毒素浓度,称为Cs；
3.测量出未添加外源内毒素的供试品溶液内毒素浓度,称为Ct；
4.计算该试验条件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm×100％
5.当R在50％～200％之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在明显干扰作用。
6.当R在50％～200％之外，需对供试品进行系列稀释或进行其它处理消除干扰,每一稀释溶液都重复
步骤2-4,直到内毒素的回收率R在50％～200％之间。
选择回收率R最接近100％的稀释倍数进行内毒素检测。
(参见《中华人民共和国药典》2010版中《细菌内毒素检查法》)。