生物制品中支原体污染及清除方法的研究进展

生物制品中支原体污染及清除方法的研究进展杜金玲，王丹娜，石磊，吕超超，王吉玮，孟姗姗，刘长辉，卢会英，赵亚荣（北京大北农动物医学研究中心，北京100097）［收稿日期］2011－09－23［文献标识码］A ［文章编号］1002－1280（2012）02－0057－04［中图分类号］S852．6［摘要］支原体是生物制品污染中较常见的一种微生物，它可以污染细胞、病毒批、血清等制品，给科研及生物制品产业带来危害。

文章简要介绍了支原体污染生物制品后带来的危害，并对清除支原体方法的研究进展进行了综述。

［关键词］支原体污染；危害；清除作者简介：杜金玲，硕士，从事动物传染病疫苗研究。

E －mail ：dujinling@163．comResearch Progress on Mycoplasma Contamination ofBioproducts and the Elimination MethodsDU Jin －ling ，WANG Dan －na ，SHI Lei ，LV Chao －chao ，WANG Ji －wei ，MENG Shan －shan ，LIU Chang －hui ，LU Hui －ying ，ZHAO Ya －rong（Veterinary Medicine Research Center of Beijing Da Bei Nong ，Beijing 100097，China ）Abstract ：Mycoplasmas always contaminate cell lines ，viruses ，serum and other materials for basic research and for manufacturing of bioproducts．It generally considered to be frequent commensals．The article briefly summarized the harm of Mycoplasma contamination in bioproducts ，and reviewed the elimination methods of Mycoplasma contamination．Key words ：Mycoplasma contamination ；harm ；elimination 支原体（Mycoplasma ）属于柔膜体纲，是介于细菌和病毒间的一类无细胞壁的原核细胞微生物，也是目前所知能在无生命培养基中生长繁殖的最小微生物，大小一般在0．3 0．5μm 之间，呈高度多形性。

在医学和兽医学上，支原体是一类重要的病原微生物，对人类、猪、牛、禽和实验动物等有广泛的致病性，也是生物制品污染物中比较常见的一种。

细胞、病毒种子批、血清等的支原体污染均给科研、疫苗生产及生物制品产业带来很多麻烦，甚至造成事故。

我国药典三部和欧洲药典都明确提出要对生物制品生产用细胞基质、病毒种子批、病毒收获液和细胞建库所用胰酶进行支原体检测［1－6］。

由于支原体高度多形性和可塑性，可通过除菌滤膜，因此支原体污染一般难于清除。

广大科研工作者在支原体清除方面进行了大量的探索和研究，试图寻求一种简单，有效的清除支原体方法，本文就支原体污染及清除方面的研究进展进行了综述，以为借鉴。

1支原体污染的危害细胞、病毒种子批、血清、鸡胚、组织、原材料等被支原体污染给科研和生产造成严重的危害［7－8］。

尤其是细胞被支原体污染更是世界性难题，在细胞培养中支原体感染发生率可达30% 50%，若不及时处理，还会产生交叉污染，造成极大的半成品和成品报废［9－10］。

目前能污染细胞的支原体多达20种以上，细胞污染支原体后，部分敏感细胞可见生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落，但多数细胞污染后无明显变化。

支原体主要是依靠附着在宿主细胞表面，通过与细胞竞争培养液中的单糖，氨基酸和核酸前体物质及产生代谢产物使细胞代谢发生一系列改变，从而使细胞表现出一些特殊的功能，而一些正常的功能则被抑制。

污染时间的长短及核酸代谢改变决定了支原体污染造成的危害程度。

某些支原体附着在细胞表面后，会与宿主细胞交换膜抗原成分，随着细胞膜成分的改变，细胞形态及抗原性发生改变，会影响细胞抗原性。

支原体污染还会干扰细胞的筛选，如污染支原体的骨髓瘤细胞会导致融合失败；污染支原体的杂交瘤细胞会使生长受到抑制或使抗体分泌能力下降以致丧失［11－12］。

细胞是制备疫苗的主要载体之一，支原体可通过污染细胞系危害各种生物制品，由于支原体与病毒大小相当，具有滤过性，可引起细胞病变，通过竞争营养和抑制干扰素分泌等机制，产生有毒的代谢产物，显著影响生产用细胞的培养及相应生物技术的发挥，干扰病毒复制，影响疫苗病毒的产量［13］，并诱导机体产生免疫抑制［14］。

在疫苗制造中，常会误以为是病毒繁殖造成的病变效应而导致虚假的效力测定结果，影响病毒真正滴度的测定，使研究结果的真实性和可靠性大大下降，给生物药剂及疫苗等的使用带来危险，甚至导致疾病的传播，直接危害人体健康［15－18］。

2支原体的清除一般在生物制品中，一经发现有支原体污染，最好是及时灭活弃之。

但对于一些无可替代或不可复得的珍贵细胞系和种毒等被污染还应尽力考虑支原体的清除［19］。

表1概括近些年广大工作者在支原体清除上做出的尝试，现就其中几种常用的方法予以介绍。

表1清除支原体方法概括作用性质具体方法物理清除法微型过滤器过滤；辐射；清洗纯化法；加温处理法化学试剂处理清除法清洁剂处理；乙醚、氯仿苯乙醇等有机溶剂处理；甲基乙酸处理；多聚对苯烯基甲醚钠处理法；6－甲基嘌呤脱氧核苷处理法免疫学清除法巨噬细胞吞噬法；裸鼠体内接种法；特异性抗支原体抗体处理法；补体结合处理法；细胞克隆化学治疗清除法抗生素处理；抗生素+免疫球蛋白/巨噬细胞；软琼脂+抗生素2．1抗生素处理法抗生素处理是清除支原体最常用也是最有效的方法，但支原体对大多数常用抗生素都能产生抗性，另外受污染后的细胞在生理、生化、遗传诸方面都已发生变化，因此选择抗生素消除支原体污染时，要根据支原体的种、株来定，所选择抗生素的某一浓度要即能消除支原体污染，又不能对细胞产生毒性。

目前市场已有的产品如BM－cyclin、MC－210及Ciprofloxacin、M－Plasmocin 等，这些药单独或联合使用，在抗支原体方面取得一定效果，但由于价格昂贵来源有限，很难广泛推广使用。

此外enrofloxacin（恩诺沙星）、sparfloxacin （司氟沙星）、卡那霉素、四环素、庆大霉素、链霉素、金霉素、氯霉素、新霉素B、巴龙霉素等应用也较广泛，作用效果良好。

在实际应用中，多是联合使用几种抗生素，切记长时间使用同一抗生素，以防抗药性产生。

通常将细胞培养在无抗生素的培养基中，加入各种针对支原体的抗生素，连续培养7d，做为一个循环，一般需3个或更多个循环。

培养结束时，再进行支原体检测，连续数次均为阴性，即可证明支原体已被清除［20－25］。

2．2化学介质克隆法克隆法即有限稀释法，将污染支原体的细胞以6－MPDR（6－甲基嘌呤脱氧核苷）进行有限稀释，浓度为20μmol/L时最佳，接种于96孔培养板，使每孔只接种一个细胞，经连续三次的克隆化培养，每次克隆化期间，间隔2 4d 换半量培养液，进行再克隆，通过稀释分离出未受支原体感染的细胞传代。

此法实际并非是真正清除支原体，而是通过有限稀释和检测，从污染的细胞株中分离出未受污染的细胞再重新克隆传代，所以有可能获得性状未发生变化的克隆化细胞株，因此具有重要意义。

2．3清洗纯化法离心洗涤法是利用离心力、细胞和支原体质量及悬液的浮力差达到清除支原体的目的。

主要是通过换液降低单位污染量，由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液，使其中潜在的支原体数量降低至极限。

一般常采用PBS等缓冲液冲洗细胞，冲洗后可以见不少小黑点被去掉了，再经600r/min3min，大部分的细胞会被离心下来，然后再结合敏感抗生素的抑杀作用和重复的清洗传代，可达到清除支原体的目的［26］。

2．4加温处理法支原体耐热性较差，在56ħ条件下，30s内半数死亡；在45ħ环境中，15 30min 内全部死亡。

以支原体和培养细胞之间对温度耐受性的差别为基础，将污染了的细胞培养物在41ħ持续加温，依据支原体种类的不同，加温时间亦有所不同，直至支原体死亡，培养细胞虽也会发生形态的变化，但降到正常温度后可复原。

买霞等［27］将污染了支原体的人胃低分化粘液腺癌细胞系（MGC80－3）放入41ħ温箱中，每隔2h在倒置光显微镜下观察细胞形态变化，加温作用8h细胞表面的支原体较对照组有所减少，随作用时间的延长，支原体治疗的效果更加明显，作用16h时细胞表面及其周围的支原体几乎消失。

另外Kotani［28］利用软琼脂技术，经50ħ加热（4 6min）灭活污染细胞的支原体，再于37ħ培养13d，使琼脂中抗生素与支原体进一步作用，使热灭活的支原体彻底被清除。

苏国华［29］在相对湿度为88%，温度45ħ的条件下经过48h的热处理，结果彻底消除了种蛋中的支原体，而且热处理对孵化率无明显影响。

宁宜宝等［30］连续报道了以热力清除普通鸡蛋中支原体污染在实际中的应用，经热力处理过的鸡胚用于制造疫苗，不影响疫苗效力，其血凝也较同批对照组高1 4倍。

因此加温处理法也成为解决普通蛋制苗中支原体污染的一个简便易行的方法。

2．5特异性血清处理法血清中含有一些天然的抗微生物成份，未灭活的血清对污染细胞中的支原体有杀灭作用。

多克隆的抗血清更是有可以消除细胞中的多种支原体污染。

采用人及动物血清中的补体或抗支原体抗体与污染细胞株于体外培养，使之与支原体结合并裂解破坏支原体。

杨吉成等［31］用5%的兔支原体免疫血清去除支原体污染，经抗血清处理后11d即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

2．6接种动物法如果是肿瘤细胞和杂交瘤细胞被支原体污染，则将细胞接种到同种系动物皮下或腹腔，或接种于裸鼠腹腔，利用动物体内免疫系统杀伤支原体。

常用的动物裸鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠，其T细胞缺陷导致特异性细胞免疫功能丧失，B细胞功能正常，非特异性细胞免疫系统NK细胞活力强，故可用于肿瘤细胞的污染清除。

通常待肿瘤长至1．0 1．5cm时，利用肿瘤组织重新进行培养，获得细胞系。

刘玉琴等［17］将两种污染支原体的人鼻咽癌CNE22Z和小鼠前胃癌MFC 细胞，接种到裸鼠，新获得的细胞经PCR法支原体检测均为阴性。

2．7巨噬细胞吞噬法利用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬法处理支原体污染的细胞简便效果好，而且取材容易且经济，适用于救治受支原体严重污染的各种珍贵细胞系或细胞株，一般经过连续二至三轮巨噬细胞吞噬处理后，即使受支原体污染严重的细胞亦可以完全消除污染，使细胞恢复原有的生长活力和正常形态。