荧光定量 CR 方法 探针法 VS 染料法
荧光定量PCR办法探针法VS染料法
荧光定量PCR办法探针法VS染料法精⼼整理荧光定量PCR⽅法：探针法VS染料法？荧光定量PCR⼜称qPCR，是⼀项⾮常常见的分⼦⽣物学实验技术。
荧光定量PCR 荧光为基础对核酸进⾏定量分析，其应⽤⾮常⼴泛，可以⽤于检测基因的表达量（RNA 的丰度），验证表达谱芯⽚或转录组测序的数据，确定病原体的载量，对⽚段的拷贝数（CNV）进⾏分析，对基因进⾏分型等等。
⼤部分研究者主要的应⽤是对基因的表达量进⾏测定，其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数（Ct值）。
从理论上说，起始模板量和Ct值密切相关，因此我们通过判读Ct值从⽽对样本进⾏定量。
在进⾏荧光定量PCR时，从技术和产品来说，我们往往会有许多选择，尤其是⽅法的选择，对最终结果的准确性⾄关重要。
荧光定量PCR从⽅法上来说可以分为染料法和探针法两种。
探针法?染料法⼀、染料法在国内，染料法⼀般采⽤DNA染料SYBRGreenⅠ，染料法使⽤简单，成本也相对较低，因此会有很多国内研究者会选择使⽤染料法进⾏后续实验。
在染料法荧光定量PCR实验中，染料能够与双链结合，从⽽发光，⽽在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光。
所以，⼀个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈⽐列，且会随扩增产物的增加⽽增加。
但是染料法检测的是体系中的所有双链DNA,因此⼀些⾮特异性扩增或者引物⼆聚体的出现，会极⼤的影响真实结果的准确性。
为此，⼀些⼚商提供ROX作为内部荧光参考标准，⽤来校正背景，但是即便如此，染料法是否只有⼀种。
⼆、TaqMan探针法光探针。
FAM 或Hex扩增时（在延伸阶段），Taq酶的5'-3'链，就有⼀个荧光分⼦形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，这也就是探针法定量的原理。
探针法与染料法的最⼤区别在于，理论上探针法中的荧光信号只来源于⽬标序列，也就是不受⾮特异性扩增及引物⼆聚体的影响。
除此之外，⼈们还可以利⽤不同探针，在⼀个体系中使⽤不同的荧光标记同时检测多种指标，达到节省实验成本的⽬的。
实时荧光定量PCR技术
千里之行，始于足下。
Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。
染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。
荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。
目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。
三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。
荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到D NA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。
二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的T M值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量P CR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。
选择定量PC R仪的关键——由于定量PC R必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。
至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。
二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。
选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。
至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。
荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。
激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
实时荧光定量PCR原理与分析方法
实时荧光定量PCR原理与分析方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR技术的DNA定量方法，可以在实时反应过程中实时监测PCR产物的累积情况。
与传统的终点PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度和准确性，可以定量检测非常低浓度的目标DNA。
实时荧光定量PCR的原理是利用荧光染料与PCR产物结合发出荧光信号，通过监测荧光信号的强度来测定PCR产物的数量。
qPCR有两种常用的检测方法：SYBR Green I染料法和探针法（如TaqMan探针法）。
SYBR Green I染料法是一种简单而常用的qPCR检测方法。
SYBR Green I是一种DNA结合荧光染料，在PCR反应过程中会与PCR产物的DNA结合，从而产生荧光信号。
这种方法的优点是简便、经济，但缺点是非特异性，可能产生假阳性结果。
探针法是一种更为特异和准确的定量PCR方法。
在这种方法中，需要设计一对特异性引物和一个包含荧光探针的引物。
在PCR反应过程中，引物与目标DNA特异性结合，探针结合在引物的靶区上，当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq聚合酶会切割探针上的荧光标记，导致断裂，这样就分离出信号的发射荧光信号。
探针法具有高特异性和准确性，能够避免假阳性结果。
无论是SYBR Green I染料法还是探针法，实时荧光定量PCR的分析方法都是通过构建标准曲线并计算目标DNA的模板数量来定量分析样品中的目标物质。
首先，需要用已知浓度的目标DNA制备标准品，根据不同浓度标准品的CT值（荧光信号阈值）绘制标准曲线。
然后，将样品DNA与引物一起进行PCR扩增反应，监测荧光信号强度并记录CT值。
利用标准曲线可以计算出样品中目标物质的浓度。
实时荧光定量PCR技术原理
实时荧光定量PCR技术原理一、PCR反应：PCR反应是qPCR的关键步骤，它利用DNA聚合酶酶及其附加的DNA 引物扩增靶序列，产生大量特异性放大的DNA片段。
PCR的过程包括三个主要阶段：变性、退火和扩增。
1. 变性（Denaturation）：在94-96℃的高温下，DNA双链解旋为两条单链，使其变性成为模板。
2. 退火（Annealing）：将反应体温降至40-65℃， DNA引物与目标序列的互补部分结合，引物与模板序列的退火温度由其碱基组成决定。
3. 扩增（Extension）：将反应体温升至67-72℃，DNA聚合酶酶依托DNA引物的引导进行DNA链合成，合成一个新的DNA链。
PCR通过不断的循环变性、退火和扩增步骤，每一个循环的两倍增加靶序列的数量，从而迅速放大特定的DNA片段。
二、定量方法：实时荧光定量PCR具有准确、快速、高灵敏度和高特异性的特点，可以定量分析目标序列的初始数量。
qPCR主要通过引入荧光标记和检测体系监测PCR反应的进程，并根据监测到的荧光信号的强弱来确定目标序列的起始浓度。
常用的定量方法包括SYBR Green染料和探针法两种。
1. SYBR Green染料法：这是最常用的定量方法，它利用SYBR Green 染料与DNA结合发出荧光信号。
SYBR Green染料结合到PCR反应中的靶序列上，DNA双链解旋后，SYBR Green染料就可以与靶序列结合，并发出荧光信号。
荧光信号的增加与PCR反应进行的循环次数成正比，荧光信号的曲线由荧光分析仪实时记录，通过建立标准曲线或比较Ct值（Ct，Cycle Threshold，荧光阈值周期，即荧光信号超过背景噪音的最小反应周期数）来确定目标序列起始浓度。
2.探针法：探针法需要合成特异性的探针序列，包含荧光物质和有机磷酸盐类物质。
PCR反应中，探针与靶序列的互补部分结合，作为DNA聚合酶酶的模板，聚合酶在待测的DNA靶序列上进行链合成，荧光小分子物质与酶切开的探针结合发出荧光信号，荧光信号与目标序列的起始浓度成正比。
线粒体膜电位检测方法
线粒体膜电位检测方法线粒体膜电位是细胞内线粒体膜的电压差，是维持细胞内稳态的重要参数之一。
线粒体膜电位的变化与细胞内能量代谢、细胞凋亡等生物学过程密切相关，因此对线粒体膜电位的检测具有重要的生物学意义。
本文将介绍几种常用的线粒体膜电位检测方法，希望能够对相关研究工作者提供一定的参考。
1. 荧光探针法。
荧光探针法是一种常用的线粒体膜电位检测方法。
通过使用荧光探针染色细胞，荧光信号的变化可以反映线粒体膜电位的变化。
常用的线粒体膜电位荧光探针包括JC-1、TMRE等。
这些荧光探针在不同的线粒体膜电位下会发生荧光信号的变化，可以通过流式细胞仪或荧光显微镜来检测和分析线粒体膜电位的变化。
2. 膜电位敏感染料法。
膜电位敏感染料法是另一种常用的线粒体膜电位检测方法。
通过使用膜电位敏感染料，如Rhodamine 123等，可以对线粒体膜电位进行实时监测。
这些膜电位敏感染料可以在不同线粒体膜电位下发生荧光信号的变化，通过荧光显微镜或荧光酶标仪等设备可以对线粒体膜电位进行定量检测和分析。
3. 膜电位探针法。
膜电位探针法是一种新型的线粒体膜电位检测方法。
通过使用膜电位探针，如刚果红等，可以对线粒体膜电位进行高灵敏度的监测。
这些膜电位探针可以在不同线粒体膜电位下发生颜色的变化，通过比色法或光谱法可以对线粒体膜电位进行定量检测和分析。
4. 膜电位记录仪法。
膜电位记录仪法是一种直接记录线粒体膜电位变化的方法。
通过使用膜电位记录仪，可以实时监测线粒体膜电位的变化情况。
这种方法对线粒体膜电位的变化有较高的时间分辨率和灵敏度，可以对线粒体膜电位的动态变化进行准确的记录和分析。
总结。
以上介绍了几种常用的线粒体膜电位检测方法，包括荧光探针法、膜电位敏感染料法、膜电位探针法和膜电位记录仪法。
这些方法各有特点，可以根据具体的实验要求和设备条件选择合适的方法进行线粒体膜电位的检测。
希望本文对相关研究工作者有所帮助，促进线粒体膜电位的研究和应用。
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荧光定量 PCR 方法：探针法 VS 染料法？
荧光定量 PCR 又称 qPCR，是一项非常常见的分子生物学实验技术。
荧光定量 PCR 荧光为基础对核酸进行定量分析，其应用非常广泛，可以用于检测基因的表达量（RNA 的丰度），验证表达谱芯片或转录组测序的数据，确定病原体的载量，对片段的拷贝数（CNV）进行分析，对基因进行分型等等。
大部分研究者主要的应用是对基因的表达量进行测定，其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数（Ct 值）。
从理论上说，起始模板量和 Ct 值密切相关，因此我们通过判读 Ct 值从而对样本进行定量。
在进行荧光定量 PCR 时，从技术和产品来说，我们往往会有许多选择，尤其是方法的选择，对最终结果的准确性至关重要。
荧光定量 PCR 从方法上来说可以分为染料法和探针法两种。
?探针法? 染料法
一、染料法
在国内，染料法一般采用 DNA 染料 SYBRGreenⅠ，染料法使用简单，成本也相对较低，因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。
在染料法荧光定量 PCR 实验中，染料能够与双链结合，从而发光，而在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光。
所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链 DNA 量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。
但是染料法检测的是体系中的所有双链 DNA,因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现，
会极大的影响真实结果的准确性。
为此，一些厂商提供 ROX 作为内部荧光参考标准，用来校正背景，但是即便如此，染料法特异性的问题依旧无法与探针法相比。
另外染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段，对于复杂序列，如果难以扩增的话，也会受到脱靶效应（如引物二聚体）的影响。
在这种情况下，就需要在实验前期进行熔解曲线分析，判断扩增所得产物是否只有一种。
二、TaqMan 探针法
TaqMan 探针法 PCR 扩增时，在加入一对扩增引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。
Taqman 探针为一段线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（FAM 或 Hex 等）和一个荧光淬灭基团，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；当 PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' -3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也就是探针法定量的原理。
探针法与染料法的最大区别在于，理论上探针法中的荧光信号只来源于目标序列，也就是不受非特异性扩增及引物二聚体的影响。
除此之外，人们还可以利用不同探针，在一个体系中使用不同的荧光标记同时检测多种指标，达到节省实验成本的目的。
在样本量比较大的情况下，成本甚至可以低于染料法。
因此我们可以看到，在选择荧光定量实验时，探针法在特异性和准确性方面远远优于廉价的染料法，但在实际使用时，TaqMan 探针高昂的价格常常让人望而却步。
目前，上海捷瑞生物工程有限公司在强大的探针合成能力的前提下，推出了探针法荧光定量 PCR 服务，以染料法的价格，享受探针法的服务，在相同的经费情况下，提高实验的准确性和特异性。