胞外多糖的提取与测定
超声提取细黄链霉菌胞外多糖工艺与抗氧化活性研究
超声提取细黄链霉菌胞外多糖工艺与抗氧化活性研究李堆淑【摘要】以细黄链霉菌胞外多糖的浓度为指标,采用单因素和响应面分析法对细黄链霉菌胞外多糖浓度的提取条件进行优化,然后用邻二氮菲法和DPPH法测定了细黄链霉菌胞外多糖的抗氧化活性.结果表明,影响细黄链霉菌胞外多糖浓度的单因素试验的最佳条件为乙醇体积分数70％,乙醇沉淀时间12 h,超声功率420 W.向应面法优化得到超声波提取细黄链霉菌胞外多糖的最佳工艺为:乙醇体积分数70.32％,乙醇沉淀时间12.06 h,超声功率417.12W,细黄链霉菌胞外多糖浓度为4.945 g/L,与预测值相差0.142％.细黄链霉菌胞外多糖对·OH和DPPH·均具有较强的抗氧化活性.%Using EPS of Streptmyces microflavus as the index,the extraction conditions of EPS from Streptmyces microflavus were optimized by single factor analysis and response surface analysis.Antioxidant activities of EPS of Streptmyces microflavus were determined by phenanthroline Fe2+ methodand and DPPH · assay.The results by single factor experiment showed that the optimum conditions of effecting EPS of Streptmyces microflavus were:ethanol volume fraction 70％,ethanol deposition time12h,ultrasontic power 420W.With response surface methodology,the optimum technology of the ultrasonic extraction of EPS from Streptmyces microflavus was:ethanol volume 70.32％,ethanol deposition time 12.06 h,ultrasontic power 417.12W.EPS of Streptmyces microflavus was4.945g/L,which was 0.142％ lower than predictive value.EPS of Streptmyces microflavus had fairly strong antioxidant activity of · OH and DPPH· radical.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2016(042)005【总页数】6页(P253-258)【关键词】细黄链霉菌;胞外多糖;响应曲面法;抗氧化活性【作者】李堆淑【作者单位】商洛学院生物医药与食品工程学院,陕西商洛,726000【正文语种】中文微生物多糖具有化学结构简单、来源丰富、生产周期短、不受季节限制、安全、低毒等的优良特质，可作为乳化剂、保鲜剂、抗衰老剂、抗癌医药品、抗氧化剂、抗辐射剂等广泛应用于化工、食品、制药等领域[1-2]，微生物胞外多糖是微生物在代谢过程中分泌到细胞壁外的多糖高聚物[3]。
产胞外多糖的乳酸菌的简便筛选与鉴定
取１ｍＬ稀释样品，分别浇注于ＭＲＳ培养基、Ｅｌｌｉｋｅｒ培养基和Ｍ１７培养基，在适宜条件下培养，用于样品中乳酸菌的分离［１１．２．２分离菌株的分离和保存将１．２．１得到的菌落在相应的平板培养基上划线纯化得到纯培养物，进行革兰氏染色，接触酶实验。
纯化菌株在ＭＲＳ斜面上４℃短期保存，置于３０％（Ｗ／Ｗ）无菌甘油中在一７０℃超低温冰箱中长期保存‘１１．２．３利用茵落拉丝法初步筛选产胞外多糖的乳酸菌将分离纯化菌株在ＭＲｓ筛选培养基上进行划线分离，在２５℃厌氧培养４８ｈ，观察并记录菌落特征。
用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，然后在２ｓ内垂直离开以在培养基表面形成连续的拉丝，重复操作５—６个菌落，每个菌落平行做２次，测量菌落拉丝的最大长度（伽ｎ），结果以“平均值士标准方差”表示。
１．２．４乳酸茵胞外多糖的提取将１．２．３得到的菌株接种于筛选ＭＲＳ液体培养基中，３０℃发酵２４ｈ，取１０ｍＬ培养物，沸水浴１０ｍｉｎ，冷却至室温，加质量分数为８０％的三氯乙酸至终浓度为４％，４℃静置过夜，１２ｏｏｏｇ离心２０ｍｉｎ，轻倾上清液于透析袋中，对流水透析２４ｈ，再对双蒸水透析３６ｈ，４次换水，定容，待用。
１．２．５硫酸－苯酚法测定乳酸茵胞外多糖（ＥＰＳ）的含量将１．２．４得到的胞外多糖样品用Ｄｕｂｏｉｓ推荐的硫酸一苯酚法［１５］测定，用葡萄糖做标准曲线（如图１），从曲线上求得ＥＰＳ的含量。
以空白培养基为对照，扣除背景干扰。
’１．２。
６·显微镜观察产胞外多糖乳酸茵细茵形态对分离菌株进行革兰氏染色，用ＭｏｔｉｃＰＭＢ５—２２３２—５摄影显微镜观察细胞形态。
１．２．７产胞外多糖乳酸茵的鉴定产胞外多糖乳酸菌的鉴定采用法国梅里埃公司鲁奎、蠢棺益图１硫酸一苯酚法测定胞外多糖含量的标准曲线的ＡＰＩ细菌鉴定系统进行，将纯菌株在ＭＲＳ琼脂培养基上３７℃微厌氧培养４８ｈ，用无菌棉拭子收集细菌，在ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条凹槽中加ＡＰＩ５０ＣＨＬ培养基并接种，用石蜡油封好，３７℃培养２４～２８ｈ，记录菌株对碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件ＡＰＩＬＡＢＰｌｕｓ进行鉴定。
胞外多糖
胞外多糖(EPS extracellular polysaccharide)早在50年代人们就认为胞外多糖可能是青枯菌的致病因子，随后围绕青枯菌胞外多糖的病理学意义进行了大量研究。
H u sain和Kelman比较了青枯菌自发无毒突变株和野生型菌株的特点，发现自发无毒突变株不产生胞外多糖，致病力丧失，因此认为胞外多糖在致病过程中可能具有重要作用l 5l。
青枯菌的胞外多糖是由多种化学物质组成的复合物，其中主要的组成成分是氮乙酞半乳糖醛酰胺。
研究发现，不同青枯菌小种的胞外多糖的组分有所不同，同一小种也存在不同类型的胞外多糖。
一些研究显示，一个称为EPS I的胞外多糖，可能与Ralstonia solanacearum的致病性最为相关I6J EPS I合成的特异突变研究显示，即使直接注入大量的突变菌细胞进入植物茎组织，与非突变菌比较，其植株的萎蔫和死亡程度也很低。
通过土壤接种试验也显示，尽管突变菌在维管组织中繁殖，但植株的发病很轻。
近年来的研究发现，胞外多糖的合成受l6 kI1的eps操纵子调控，涉及l0个调控基因产物和3个不同的调控信号，这种严谨的调控也从另一个角度说明EPS I对病原菌本身的重要性以及在病原菌对植物的致病性中的重要作用『青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearu‘)或称青枯菌引起许多重要经济作物如烟草、花生、番茄等植物的萎焉病。
主要通过土壤传染病害，它的寄主范围很广泛，有33科100多个种，危害茄科植物为最多“。
青枯菌毒力株能产生胞外多糖，用特殊固体培养基培养时形成两种菌落形态即易变的和固定的，前者产生胞外多糖有毒力，后者很少产生这种多糖。
为此，日本科学工作者研究了这种胞外多糖的组成以及它与致病性的关系。
发现这种多糖是一种混合物一主要由N一乙酸半乳糖胺(2一氨基2半乳糖)和少量鼠李糖、葡萄糖以及某些简单肤所组成。
事实上，这是同型一N一乙酞半乳糖胺葡聚糖的一个例证。
其化学性质还不清楚，但认为这种胞外多糖与毒力有关系‘，这是因为它阻滞寄主植物维管束组织，导致水分输导的困难。
产胞外多糖菌的鉴定及多糖性质研究
产胞外多糖菌的鉴定及多糖性质研究田文祥;蹇华丽;杨幼慧;廖美德【摘要】从华南农业大学杀虫植物园土壤中筛选出一株胞外多糖高产菌株PS04,根据形态学、生理生化特征以及16S rD-NA核酸序列分析结果表明,该菌属于多粘类芽孢杆菌.采用察氏培养基,pH 6.0,于37℃摇瓶培养48h,多糖产量为13.3 g/L.对其多糖性质研究表明,该多糖的性质与黄原胶类似,具有低浓度下高黏性、假塑性、耐盐性,同时对热及酸碱有较好的稳定性.%Strain PS04 producing exopolysaccharide was isolated from the soil samples that were collected from the South China Agricultural U-niversity Botanic Insecticides Garden. It was identified as a Paeniba-cillus polymyxa by its morphological, the physiological and biochemical properties and 16S Rdna sequence analysis. Using Czapek's medium, the exopolysaccharide production was up to 13. 3 g/L by fermentation under the condition of temperature 37 °C and Ph 6. 0. The properties of the polysaccharide were investigated. Like Xanthan Gum, this polysaccharide was distinguished by its high viscosity with low concentration, pseudoplasticity and salt-tolerance, at the same time, the polysaccharide was stable to heating, acid and alkali.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2012(028)001【总页数】4页(P162-165)【关键词】多粘类芽孢杆菌;胞外多糖;16S rDNA;鉴定;黏度性质【作者】田文祥;蹇华丽;杨幼慧;廖美德【作者单位】华南农业大学食品学院,广东广州 510642;广东-方制药有限公司,广东佛山 528244;华南农业大学食品学院,广东广州 510642;华南农业大学食品学院,广东广州 510642;华南农业大学资源与环境学院,广东广州 510642【正文语种】中文微生物胞外多糖是指微生物在生长代谢活动中分泌到细胞壁外的多糖或多糖混合物。
lab-2-3酵母胞外多糖的液体发酵、胞外多糖的提取与测定
甘露糖标准曲线的制作 取6支干净试管，分别加入100µg /ml甘露糖标准溶液0、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，不足1ml管用蒸馏水补足至 1ml，各管再加6%苯酚溶液1.0ml ，摇匀，再加入浓硫酸 5.0ml,混匀静置10min后在25～30℃水浴中放置20min，取 出。用1cm 玻璃吸收池，以空白管溶液为参比，在波长 490nm处依次测定各管溶液的光密度值（OD）。 样品测定 取样品液1.0ml，同制作标准曲线步骤操，注意控制好供测样品的稀释倍数。
五、思考题
1、为什么在高碳氮比的液体发酵培养基中及高通 气量进行发酵有利于菌株多糖的合成？ 2、用苯酚—硫酸法测定多糖有何优缺点？
2、多糖的提取及测定 粗多糖的提取及测定样品液的制备 发酵液用蒸馏水稀释3倍，3500r/min离心 15min除菌体。取上清液1ml，调pH至6.0，加95% 乙醇3ml，氯化钾饱和液1滴，混匀。静置让多糖 充分沉淀，然后在3500r/min离心10min，弃上清液。 沉淀用75%乙醇洗至无还原糖反应，经洗涤后的 沉淀即为胞外粗多糖。将其溶于水并稀释至适当 浓度（样品液）。
三 材料与器材
菌种：斯达油脂酵母（Lipomyces starkeyi）2. 1390. 试剂： （1）无机盐溶液：MgSO4.7H2O 0.4 % ， MnSO4.H2O 0.2 %， FeSO4.7H2O 0.2 % ，NaCl 0.2 % （2）种子培养基：蔗糖2%，酵母膏0.5%， pH6.5. （3）摇瓶发酵培养基：蔗糖8%，蛋白胨0.3% ， K2HPO4 0.35% ，KH2PO4 0.35% ，无机盐溶液5mL/L pH6.5. 种子培养基和发酵培养基装量为250 mL 三角瓶30 mL， 8层纱布塞于瓶口，并用牛皮纸包扎，培养基121 ℃灭 菌20 min。
冠突散囊菌胞外多糖含量测定及提取工艺研究
ｔｅ ｏ ｔ ｌ ｏ ｄｔ ｎ ｆｒ ｔｅ ｅ ｔａ ｔ ｎ ｔｃ ｎｑ ｅ ｗ ｒ ５ ％ ｅｈ ｏ ｅ ｏ ｉ ｏ ｒ ０ ｈ ａ ｌ ｈ ｐｉ ｍａ ｃ ｎ ｉ ｏ ｈ ｘｒｃｉ ｅ ｈ ｉｕ ｅｅ ９ ｉ ｏ ｏ ｔａ ｌｄ ｐ ｓｔ ｎ ｆ １ ｓ ｗｅｌ ｎ ｉ ｏ
液体深层发酵 ， 并对其产生 的胞外 多糖提取条件进行 了正 交试验 。 试验 结果表 明， 最优 的多糖提取条件为 ： 突散 囊 冠
茵液体发酵液浓缩至原体 积的 １ ， ／ 乙醇浓度 ９ ４ ５％， 乙醇沉淀时间 １ 。 ０ ｈ 关键词 ： 冠突散 囊茵； 茯砖 茶； 液体发 酵； 胞外 多糖
作者简介 ： 龚淑俐 （９ ２ ） 汉 ）硕士研究 生， １８一， 女（ ， 研究方 向： 品资源开发与利用 。 食 ・ 通讯作者 ： 明 ， 。 邓放 教授
将其纯化后冻干 ， 提高稳定性和保存期 ， 更有效地提 高方法准确性和灵敏度 。 ‘
３３ 不 同农 药对植 物 酯 酶 的抑制 强 度不 同 ， ． 有 待与 动物 性 的 乙酰胆 碱酯 酶进 行进 一 步 比较研
ａ ｅ ｒ ｔ １４ ｓ ｔ ａｉ ：． ｈ ｏ
Ｋｅ ｒ ｓ Ｅｕ ｏｉ ｍ ｒ ｔｔ ｍ ；Ｆ ｚ ｕ ｒｃ ｅ ；ｌ ｕｄｆｒ ｅ ｔｔ ｎ；ｅ ｔａ ｅｌｌｒ ｏｙａ ｃ ａｉｅ ｙ ｗｏ ｄ ： ｒｔｕ ｃ ｉ ａｕ ｓ ｕ ｈ ａ ｂ ｋｔａ ｉ ｉ ｅ ｎ ｉ ｑ ｍ ｎａｉ ｏ ｘｒ ｃ ｌ ａ ｐ ｌｓｃ ｈ ｒｄ ｕ
性可能有所差异。
【 汪世新． ３ 】 蔬菜农药残 留速测方 法中若干 问题 的操作叨． 业环境 农
与发展，０ ２１（） ３ ２ ０ ．９２： ． ４
３ 本研究主要 以敌百虫为检测对象 ， ． ４ 由于有机磷
胞外多糖生物合成机制及应用研究
胞外多糖生物合成机制及应用研究胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）是一类由微生物细胞分泌到细胞外的高分子糖类化合物，它们在自然界中广泛存在，具有多种生物学功能和工业应用价值。
胞外多糖的生物合成机制是微生物学、生物工程和材料科学领域的重要研究课题。
本文将探讨胞外多糖的生物合成机制及其在不同领域的应用研究。
一、胞外多糖的生物合成机制胞外多糖的生物合成是一个复杂的代谢过程，涉及多种酶类和代谢途径。
在微生物细胞中，胞外多糖的合成通常由特定的糖基转移酶（Glycosyltransferases, GTs）催化完成。
这些酶将活化的糖基单元从糖核苷酸供体转移到接受体上，逐步构建多糖链。
1.1 胞外多糖的合成途径胞外多糖的合成途径可以分为几个关键步骤：糖基的活化、多糖链的延长、多糖的修饰和分泌。
糖基的活化通常由糖基转移酶完成，这些酶将糖基单元从尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）或其他糖核苷酸供体转移到多糖链上。
多糖链的延长是通过糖基转移酶的连续作用实现的，形成线性或分支的多糖结构。
多糖的修饰包括硫酸化、乙酰化等，这些修饰可以改变多糖的物理化学性质，如溶解性、黏度和稳定性。
最后，合成完成的多糖通过细胞膜上的分泌系统被释放到细胞外。
1.2 胞外多糖合成的关键酶类胞外多糖合成的关键酶类包括糖基转移酶、糖基修饰酶和分泌相关蛋白。
糖基转移酶是合成多糖链的核心酶类，它们具有高度的底物专一性，决定了多糖的组成和结构。
糖基修饰酶负责对合成的多糖链进行化学修饰，如硫酸化和乙酰化，这些修饰对多糖的功能至关重要。
分泌相关蛋白则参与多糖的跨膜运输和分泌过程。
1.3 胞外多糖合成的调控机制胞外多糖的合成受到多种因素的调控，包括环境条件、营养物质的可用性、细胞内信号分子等。
环境条件如温度、pH值、氧气浓度等都会影响胞外多糖的合成。
营养物质的可用性，特别是碳源和氮源的供应，对胞外多糖的合成具有显著影响。
此外，细胞内的信号分子如环磷酸腺苷（cAMP）和钙离子等，也可以通过调控相关基因的表达来影响胞外多糖的合成。
细菌胞外多糖提取分离技术研究进展
食品与药品 Food and Drug 2010年第12卷第05期 217细菌胞外多糖提取分离技术研究进展王桂兰1,2，凌沛学1,2*（1.山东大学药学院，山东 济南 250012；2. 山东省生物药物研究院 博士后科研工作站，山东 济南 250101）摘 要：细菌胞外多糖是当今进入工业化发酵生产的一类重要的多糖。
由于多糖种类的不同，其分离纯化工艺不尽相同。
本文综述细菌胞外多糖发酵生产中提取分离技术的研究进展，并比较了各种分离技术，介绍了针对极具商业价值的微生物多糖的几种新型提取分离技术，展望了微生物多糖研究的发展趋势。
关键词：胞外多糖；提取；分离；发酵中图分类号：Q539 文献标识码： A 文章编号：1672-979X （2010）05-0218-03收稿日期：2010-03-01作者简介：王桂兰（1986-），女，山东滨州人，硕士研究生，微生物与生化药学专业*通讯作者：凌沛学，男，研究员，博士生导师 Tel:（0531）81213003 E-mail:peixue.ling@Progress on Extraction and Isolation T echnologies of Bacterial Exocellular PolysaccharidesW ANG Gui-lan 1,2, LING Pei-xue 1,2（1. School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Post-doctoral Scientific ResearchWorkstation, Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province, Jinan 250101, China ）Abstract: Bacterial exocellular polysaccharides are important in industrial fermentation now. Because of different species, the technologies of extraction and isolation are different for each polysaccharide. All the technologies applied usually at home and abroad in fermentation industry are reviewed in this paper and compared with each other. The paper also introduces some new technologies and methods for the extraction and isolation of certain valuable polysaccharides, and gives an outlook about the progress on bacterial exocellular polysaccharides.Key Words: exocellular polysaccharide; extraction, isolation; fermentation多糖在自然界高等植物、藻类、微生物及动物体内均存在，分布极广。
苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量 标准作业指导书
产品质量胞外多糖的测定
1目的
依据有关方法和标准，建立公司测量土壤中胞外多糖的标准方法。
2适用范围
本文件规定了测定胞外多糖含量的苯酚-硫酸法。
本实验采用苯酚-硫酸法，该实原理是：浓硫酸水合产生的高温快速分解多糖产生单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，生成的糖醛衍生物又与苯酚反应生成橙黄色化合物，再以比色法测定
本标准适用于蓝藻门、绿藻等藻类胞外多糖的测定。
3参考文件
无
4定义
胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS):是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。
5职责
5.1测试工程师依照国家标准的更新、或者方法的改良，不定期更新本文件。
5.2测试工程师应当对测试人员进行培训、考核、上岗认定和定期技能查验，对于技能不达标的人员予以相关处理。
5.3测试人员应当严格依照本文件方法测定相关样品的胞外多糖含量，保证安全的情况下，认真仔细地完成实验。
6程序
6.1试剂和材料
表1准备试剂和材料清单
表2混合材料和溶液配置清单
6.2仪器设备
表3仪器设备清单
6.3操作流程表
表4胞外多糖的测定操作流程表
6.4具体操作流程
表5胞外多糖的测定具体操作
7附件
附件1《实验室测试报告》。
一种微生物胞外多糖及其制备方法
一种微生物胞外多糖及其制备方法微生物胞外多糖是一类由微生物细胞合成并分泌到细胞外的复杂碳水化合物。
它们由多种糖分子通过特定的化学键连接而成，具有多样的结构和生物活性。
微生物胞外多糖具有广泛的应用领域，例如在医药、食品、化妆品等行业中被用作功能性添加剂，具有抗菌、抗氧化、免疫调节等多种生物活性。
制备微生物胞外多糖的方法有多种，下面将介绍其中一种常用的方法。
首先，需要选择合适的微生物菌株作为产生胞外多糖的来源。
常见的菌株有蓝藻、酵母菌、乳酸菌等。
选择菌株时需考虑其菌株特性、产量以及产生胞外多糖的能力。
接下来是培养菌株。
通常采用液体培养的方式，将选定的菌株接种到培养基中，提供菌株所需的养分和环境条件，如温度、pH值等。
培养过程中需要注意菌株的生长状态，及时调节培养条件以促进菌株生长和胞外多糖的产生。
在培养菌株达到一定生长状态时，需要采集菌体和胞外多糖。
一般采用离心的方法将培养液中的菌体和胞外多糖分离。
离心后，可将胞体分离出来，以获得胞外多糖。
此外，还可以通过过滤等方法将胞外多糖从培养液中提取出来。
提取的过程中需要注意对胞外多糖的保护，避免其在提取过程中受到损伤。
提取得到的胞外多糖需要经过一系列的纯化步骤，以去除其他杂质和溶剂。
通常采用离子交换层析、凝胶过滤层析等技术来纯化胞外多糖。
纯化过程中需要注意对胞外多糖分子结构的保护，避免其发生断裂或降解。
最后是对纯化得到的微生物胞外多糖进行表征和分析。
常用的方法有核磁共振（NMR）、质谱（MS）等。
这些分析方法可以确定微生物胞外多糖的分子结构、组成和理化性质，从而为进一步的研究和应用提供依据。
通过上述方法，我们可以制备得到微生物胞外多糖，并对其进行分析和表征。
制备方法的选择和优化对于获得高产量和高质量的微生物胞外多糖至关重要。
同时，制备过程中需要注意对微生物菌株的培养和胞外多糖的保护，以确保最终得到的产品具有较好的生物活性和应用性能。
微生物胞外多糖作为一类重要的生物大分子，具有广泛的应用前景。