柯萨奇病毒A组16型病毒株VP1基因序列测定及进化分析研究
柯萨奇病毒A16型VP1区基因变异和进化分析
Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ，Ｊ ｉ ｎ ａ ｎ ２ ５ ０ ０ ２ ２，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
Ｃｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐｏ ｎ ｄｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ：ＺＨＡＮＧ １ ２一 ｈ ａ ，Ｅｍａｉ ｆ ：ｚ ｌ ｈ６ ８ １３＠ １ ２６ ．ｃ ｏ ｎ ｒ
【 Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ 】 Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｔ ｈ ｅ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ ｖ ａ ｒ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｅ ｖ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｖ Ｐ １ ｒ ｅ ｇ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ
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中华实验和 临床感染病杂志（ 电子版 ） ２ ０ １ ３ 年 ２月 第 ７ 卷 第１ 期 Ｏｌ ｉ ｎ Ｊ Ｅ Ｗ Ｃ ｌ ｉ ｎ Ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ Ｄ ｉ ｓ（ Ｈｅ ｃ ｔ ｒ ｎｉ ｏ ｃ Ｅ ｄ ｉ ｉ ｔ ｏ ｎ ） ， Ｆ ｅ ｂ ｒ ｕ ａ ｒ ｙ ２ ０ １ ３， Ｖ ｏ ｌ ７， Ｎ ｏ ． １
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临 床 论 著
柯萨奇病毒 Ａ １ ６型 Ｖ Ｐ １区基 因变异 和进 化 分 析
任倩 王世 富 张忠 于爱 莲 张 乐海
【 摘要 】 目的 分析 ２ ０ １ ０ ～ ２ ０ １ １ 年本院分离 的 ２ 株柯 萨奇病毒 Ａ １ ６ （ Ｃ ｏ ｘ １ ６ ） Ｖ Ｐ １区核 苷酸 （ 氨
ａ ｎ ｄ ２ ０ １ １ ｉ ｎ ｏ ｕ ｒ ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ １ ．Ｍ ｅ ｔ ｈｏ ｄ ｓ Ｔ ｗｏ ｔ ｈ ｒ ｏ ａ ｔ ｓ ｗ ａ ｂ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｃ ｈ ｉ ｌ ｄ ｒ ｅ ｎ ｗ ｉ ｔ ｈ ＨＦ ＭＤ ｃ ａ ｕ ｓ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｃ ｏ ｘ Ａ１ ６ ｗ ｅ ｒ ｅ
2011～2013年杭州市手足口病病原谱流行特征及柯萨奇病毒A16型VP1区基因变异研究
2011～2013年杭州市手足口病病原谱流行特征及柯萨奇病毒A16型VP1区基因变异研究郑书发;谢国良;崔大伟;杨先知;余斐;王忆吟;陈瑜【摘要】目的了解杭州市手足口病病原谱流行特征及柯萨奇病毒A16型(CA16)分离株的VP1基因变迁规律.方法采集杭州市2011 ～2013年手足口病患者的2 197份临床标本,用通用引物进行肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测,对阳性标本进行分型,对部分CA16感染阳性重症患者标本测定VP1基因序列并进行同源性比对和系统进化树分析.结果杭州地区肠道病毒通用型核酸检出率为56.0％(1 317/2 197),肠道病毒71(EV71)、CA16和其他肠道病毒的检出率分别为24.1％(530/2 197)、13.9％ (306/2 197)和22.8％ (501/2 197).在咽拭子和粪便标本中EV71检出率均最高,分别为23.9％(301/1 258)和23.6％(148/627),而在疱疹液标本中其他型肠道病毒检出率最高,为32.6％(76/233),脑脊液标本中无CA16检出.咽拭子标本和粪便标本在发病初期的检出率较高,发病后第5天和第6天后检出率低于发病初期检出率,而脑脊液和疱疹液不同病程阶段的检出率无统计学意义.9株CA16分离株VP1基因的核苷酸同源性为90.8％～99.7％,分属于B1b亚型和B1a亚型.结论 2011 ～2013年杭州地区手足口病患者主要病原体以EV71和CA16为主,样本类型和采样时间是影响肠道病毒检出率的重要原因.杭州地区CA16毒株VP1区基因的变异程度较低,需进一步加强开展手足口病的监测.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2015(033)002【总页数】4页(P104-107)【关键词】手足口病;肠道病毒;柯萨奇病毒A16型;VP1【作者】郑书发;谢国良;崔大伟;杨先知;余斐;王忆吟;陈瑜【作者单位】浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003【正文语种】中文【中图分类】R512.5手足口病(hand-foot and mouth disease, HFMD)是全球性的传染性疾病，普通病例主要表现为发热以及手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹等，重症病例会出现中枢神经系统损害，严重危害儿童的身体健康和生命安全。
江苏2012年柯萨奇病毒A组16型基因特征分析
江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型基因特征分析单军，嵇红，包林，付建光，王慎骄，汤奋扬，周明浩，朱叶飞*（江苏省疾病预防控制中心急性传染病防制所，江苏南京21009）[摘要] 目的: 了解江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型(CA16)分离株VP1区基因特征。
方法: 选取江苏省2012年14株CA16病毒分离株, 用1对特异性引物进行VP1区核苷酸序列扩增，对扩增产物进行测序，利用生物信息学软件对序列进行分析，结果与CA16参考株序列进行同源性比较并构建基因进化树。
结果: 14株CA16分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%~100%和98.7%~100%，与国际CA16标准株G10的核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5%~76.7%和91.6%~92.3%。
江苏省2012年的CA16分离株全部属于B1基因亚型，同时包含B1a 和B1b 两条进化分支。
结论: 江苏省2012年有CA16病毒的B1a与B1b两种进化分支共同存在与循环，且呈现以B1b基因亚型为优势型别、B1a基因亚型为辅助型别的传播模式；无论是优势型别还是辅助型别，均各自呈现密切的亲缘关系。
[关键词] 手足口病；柯萨奇病毒A组16 型；VP1基因；基因型[中图分类号] R373.2 [文献标识码] AAnalysis on genetic character of Coxsackievirus A16 strains isolated in Jiangsu Province in 2012SHAN Jun, GI Hong, BAO Lin, FU Jian-guang, WANG Shen-jiao, TANG Fen-yang, ZHOU Ming-hao, ZHU Ye-fei*(Department of Acute Infectious Disease Control and Prevention , Jiangsu Provincial Center for Disease Prevention and Control, Nanjing 210009, China）[Abstract] Objective: To analyze the genetic characteristic of Coxsackievirus A16 (CA16) strains isolated from Jiangsu Province in 2012. Methods: 14 CA16 strains isolated from the samples of hand-foot-mouth disease (HFMD)patients were selected to conduct VP1 gene amplification using specific primers, and then sequenced.The homology and phylogenetic analyses were conducted between the 14 isolates and other CA16 strains downloaded from Genbank, based on the sequence of VP1 gene. Results: The sequence analysis showed that the homogeneity of the nucleotide and amino acid of VP1 gene were 90.5%~100% and 98.7%~100%, respectively among 14 isolated CA16 strains.The nucleotide and amino acid homologies of VP1 gene were 75.5%~76.7% and 91.6%~92.3%, respectively among the prototype ( G10) and Jiangsu CA16 strains. All of the 14 CA16 isolated strains fell within genogroup B and they were divided into 2 branches:B1a and B1b. Conclusions: The transmission mode was showed to be one dominant subgenotype of B1b and one secondary subgenotype of B1a co-circulated together. Both two subgenotypes showed close phylogenetic relationship in their own subgenotype respectively.[Key Words] Hand-foot-mouth disease; Coxackievirus A16; VP1 gene; Genotype[基金项目] 江苏省临床医学中心（高技术平台）(ZX201109)*通讯作者，E-mail：**************；单军和嵇红为并列一作手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD)是一种常见的传染性强、传播途径复杂、在短时间内可引起大规模流行的感染性疾病，其主要病原体是肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16，CA16）。
柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及纯化
柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及纯化潘朋歌;李克生;杜惠芬;曾潮宁【摘要】[目的]原核表达并纯化柯萨奇病毒A组16型(CVA16)VP1蛋白.[方法]根据GenBank CVA16 VP1基因序列,合成VP1全基因,连接到载体pET30a,构建原核表达质粒pET30a-CVA16-VP1.将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白.[结果]成功构建重组质粒pET30a-CVA16-VP1,表达蛋白经SDS-PAGE显示分子量约为38.7 kDa,目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白经复性、纯化,纯度达90％以上;经Western Blot检测,证实表达的蛋白为VP1蛋白.[结论]成功获得了高纯度的VP1蛋白,为此抗原用于临床诊断打下了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2018(046)030【总页数】3页(P99-101)【关键词】柯萨奇病毒A组16型(CVA16);VP1蛋白;原核表达;纯化【作者】潘朋歌;李克生;杜惠芬;曾潮宁【作者单位】宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室/宁夏回族自治区生殖与遗传重点实验室,宁夏银川750004;甘肃省医学科学研究院医学生物技术研究中心,甘肃兰州730050;甘肃省医学科学研究院医学生物技术研究中心,甘肃兰州730050;兰州雅华生物技术有限公司,甘肃兰州730050【正文语种】中文【中图分类】R373.2+3柯萨奇病毒(coxsackie virus,CV)属于小核糖核酸病毒科，肠道病毒属，可导致多种人类疾病，如呼吸道感染、手足口病、结膜炎、疱疹性咽颊炎、发热性皮疹、心肌炎、急性弛缓性麻痹及脑炎等[1-2]。
柯萨奇病毒被分为A、B两组，其中 A组16型(CVA16)作为引起儿童手足口病的主要肠道病毒之一而备受关注[3]。
肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析
肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析张建华;江炳福;程险峰;游贤惠;孟继鸿【期刊名称】《东南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(032)002【摘要】目的:探讨苏皖地区手足口病(HFMD)患者肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)分离株的VP1基因特征.方法:采集南京市、马鞍山市2009至2010年HFMD患者临床标本进行病毒分离和RT-PCR鉴定;扩增并测定VP1基因序列;从GenBank中选取EV71和CA16不同基因型参考毒株,利用生物信息学软件进行同源性比对和系统进化树分析.结果:共分离到9株EV71和4株CA16,EV71分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.5% ～99.8%和99% ～100%;CA16分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性为96.2% ～98.5%和99.3% ～100%;系统进化树分析显示,9株EV71全部属于C4a基因亚型,而4株CA16则全部属于B1b基因亚型.结论:2009至2010年苏皖地区分离到的EV71和CA16毒株分别属于C4a和B1b基因亚型,与国内其他地区HFMD病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究.%Objective: To investigate genetic characterization of the capsid protein VP1 of enterovirus 71 ( EV71 ) and coxsackievirus A16( CA16 ) strains. Methods: EV71 and CA16 strains were isolated using Vero cells from the anal and throat swab specimens collected from HFMD patients. The full-length VP1 genes of all isolated EV71 and CA16 strains were amplified by RT-PCR and then sequenced. The nucleotide and deduced amino acid sequences of VP1 gene were analyzedby biological software. Phylogenetic trees were constructed. Results: Nine EV71 strains and four CA16 strains were isolated from HFMD patients. The homogeneity of the 9 EV71 strains shared 96. 5%-99. 8% in nucleotide acid identity and 99%-100% in amino acid identity,and belonged to EV71 C4a subgenotype. The homogeneity of the 4 CA16 strains shared 96. 2%-98. 5% in nucleotide acid identity and 99. 3%-100% in amino acid identity,and belonged to CA16 B1b subgenotype. Conclusion: These EV71 and CA16 strains isolated from Jiangsu and Anhui provinces in 2009 and 2010 belong to EV71 C4a and CA16 B1b subgenotype respectively, which are closely related to those isolated from other provinces in China.【总页数】7页(P173-179)【作者】张建华;江炳福;程险峰;游贤惠;孟继鸿【作者单位】东南大学,医学院,江苏,南京,210009;绍兴文理学院,医学院,浙江,绍兴,312000;东南大学,医学院,江苏,南京,210009;东南大学,医学院,江苏,南京,210009;南京市儿童医院,江苏,南京,210008;东南大学,医学院,江苏,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】R512.5【相关文献】1.西安市手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征分析 [J], 付建军;王海峰;马超峰;雷彩虹;黄嘉丽;邓慧玲2.一起儿童病毒性脑炎暴发肠道病毒ECHO6型分离株VP1基因特征分析 [J], 陈前进;曹春远;吴水新;杨秀惠;罗招福;何云;廖亦红3.柯萨奇病毒A16型VP1基因和病毒生物物理学分析 [J], 刘杨;郭春艳;张西嫔;郑利茹;赵向绒;郭华;胡军4.肠道病毒71型六安地区分离株VP1基因的生物信息学分析及B细胞表位预测[J], 俞海洋;王明丽;陈伟;倪德群;常宏伟;王林定;汤仁树;陈灵芝;丁晓娟;陈敬贤5.2016年上海市普陀区手足口病病原谱及EV71和Cox A16病毒分离株VP1基因特征分析 [J], 李晓君;唐海丰;何鑫;胡焰;顾文超因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
柯萨奇病毒A组6型中国株的分子进化和时空传播分析
柯萨奇病毒A组6型中国株的分子进化和时空传播分析贾永涛;唐佳婕;王惠;董长征
【期刊名称】《宁波大学学报(理工版)》
【年(卷),期】2024(37)1
【摘要】柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是手足口病的主要病原体,可引起非典型手足口病和中枢神经系统疾病,对儿童造成严重的疾病负担,尚无上市的疫苗和抗病毒药物.基于3288条CV-A6中国株VP1序列,利用Nextstrain 平台的augur病原体生物信息分析包,构建了CV-A6的时间尺度分子进化树,确定了进化分支和分支突变,分析了分支突变与抗原表位之间的联系.进一步分析了CV-A6中国株各分支在中国七大地理区域的时空分布和优势分支,绘制了主要分支的时空传播路线.结果发现,CV-A6中国株主要分为B、C和D三个进化分支以及D2、D3a和D3b三个子分支,抗原表位处的突变形成了新的进化分支,促进了病毒的流行.华南和华东是CV-A6中国株的主要起源地,华南和华东相互输出、华东输出全国是中国株的主要传播模式.对CV-A6中国株的分子进化和时空传播分析,为CV-A6引起的手足口病等疫情的监测、预警和防控提供了重要支持.
【总页数】9页(P84-92)
【作者】贾永涛;唐佳婕;王惠;董长征
【作者单位】宁波大学医学部;浙江省病理生理学技术研究重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R373.2;R511
【相关文献】
1.柯萨奇病毒A组16型病毒株VP1基因序列测定及进化分析研究
2.148株柯萨奇病毒A组16型的多序列比对及遗传进化分析
3.柯萨奇病毒A组2型分离毒株序列及遗传进化分析
4.云南省5株柯萨奇病毒A组9型进化分析
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1株人感染柯萨奇病毒A组16型B1b亚型的分离和鉴定
[J]．A n a e r o b e,２０１６,９(２):７８Ｇ８０．[１１]N A G YE．A n a e r o b i c i n f e c t i o n s:u p d a t eo n t r e a t m e n t c o nＧs i d e r a t i o n s[J]．D r u g s,２０１０,７０(７):８４１Ｇ８５８．[１２]B R O O K I．S p e c t r u m a n dt r e a t m e n to fa n a e r o b i ci n f e cＧt i o n s[J]．J I n f e c tC h e m o t h e r,２０１６,２２(１):１Ｇ１３．[１３]MA D S E NIR,J U S T E S E N U S．B a c t e r e m i aw i t hB a c t eＧr o i d e s p y o g e n e sa f t e rac a tb i t e[J]．J C l i n M i c r o b i o l,２０１１,４９(８):３０９２Ｇ３０９３．(收稿日期:２０２０Ｇ０９Ｇ０２㊀修回日期:２０２０Ｇ１２Ｇ２３)个案分析１株人感染柯萨奇病毒A组１６型B１b亚型的分离和鉴定∗杜加亮,刘㊀艳,于晴川,张㊀永,赵荣荣,赵㊀岩,韩㊀菲,刘悦越ә中国食品药品检定研究院,北京１０２６２９㊀㊀关键词:柯萨奇病毒;㊀手足口病;㊀乳鼠;㊀R D细胞D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０２１．１０．０２９中图法分类号:R４４６．５文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０２１)１０Ｇ１２７６Ｇ０５文献标志码:C㊀㊀柯萨奇病毒A１６(C VＧA１６)是小R N A病毒科肠道病毒属的成员,是引起婴幼儿手足口病(H F M D)的常见病原体之一[１].C VＧA１６是含有约７．４k b基因组的正义单链R N A病毒,其基因组包含５ᶄ端非翻译区(５ᶄU T R)㊁结构蛋白编码区P１㊁非结构蛋白编码区P２/P３及３ᶄ非翻译区(３ᶄU T R).P１编码４种结构蛋白(V P１㊁V P２㊁V P３㊁V P４),P２和P３分别编码７种非结构蛋白(２A㊁２B㊁２C㊁３A㊁３B㊁３C㊁３D)[２].随着研究的不断深入,在分子流行病学方面,基于V P１基因的完整序列,C VＧA１６可以在系统发育上分为A㊁B㊁C和D４个基因组[３Ｇ６].基因组B可以进一步分为B１~B４这４个基因亚型,其中B１基因亚型还可以细分为B１a~B１d[３,７].在基础研究方面,利用反向遗传学技术构建感染性克隆[８],能够在体外对病毒基因组进行突变㊁缺失㊁嵌合等操作后,获得表型㊁性状发生变化的拯救病毒,为研究其基因的结构与功能㊁病毒复制机制㊁致病机制及筛选候选疫苗提供了崭新的途径.在疾病预防控制方面,单价肠道病毒７１型(E VＧA７１)疫苗无法预防其他病原体引起的H F M D及其他相关疾病,应研发多价H F M D疫苗[９],而E VＧA７１和C VＧA１６交替或共同流行可引发世界多个国家或地区H F M D暴发.本研究从C VＧA１６的分离㊁鉴定㊁系统进化分析㊁检测方法建立和全基因组克隆构建等方面进行了一系列研究,以期为C VＧA１６病毒的分子流行病学和基础研究提供有利的工具.１㊀材料与方法１．１㊀细胞㊀R D细胞为人恶性胚胎横纹肌瘤细胞,为本实验室保存.细胞培养液为含有１％(v/v)LＧ谷氨酰胺(２００mm o l/L)㊁２．５％(v/v)N a H C O３溶液(７．５％)㊁１０％(v/v)胎牛血清和１％(v/v)双抗的G i bＧc oDＧM E M培养液.１．２㊀材料㊀一步法荧光定量P C R试剂盒(R R０６４)和一步法反转录P C R(R TＧP C R)试剂(R R０５７)购自T a K a R a公司,Q I A a m p V i r a lR N A M i n i试剂盒购自Q I A G E N公司.粪便处理液为含有终浓度为５００U/ m L青霉素和５００μg/m L链霉素的磷酸盐缓冲液(P B S).１．３㊀病毒分离㊀粪便标本来源于临床诊断为H F M D 和实验室诊断为C VＧA１６感染的患者.取粪便标本１g加入１０m L粪便处理液中,涡旋混匀３０s,４０００r/m i n离心３０m i n,取上清,除菌过滤后接种于R D细胞.在倒置显微镜下每日观察细胞病变情况,７d后观察若未出现细胞病变,盲传两代,直至出现超过７５％的细胞病变后,将其在 ７０ħ以下冻存.１．４㊀分离毒株的分子生物学鉴定㊀步骤１．３中的冻存液反复冻融３次后,吸取２００μL,按照Q I A a m p V iＧr a lR N A M i n i试剂盒说明书的步骤提取病毒R N A.按照一步法反转录P C R试剂(R R０５７)说明书,利用C VＧA１６特异性引物C AＧV P１ＧF和C AＧV P１ＧR(终浓度均为１０μm o l/L),进行一步法反转录P C R扩增V P１基因(反应条件为９４ħ预变性５m i n;９４ħ变性３０s㊁５０ħ退火３０s㊁７２ħ延伸１m i n㊁３５个循环;７２ħ充分延伸７m i n),探针引物信息见表１.目的条带经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定后测序验证,并参照文献与G e n B a n k中的已知基因型和亚型的毒株序列进行比对,利用M e g a软件构建N e i g h b o u rＧj o i n i n g系统进化树.１．５㊀病毒滴度检测㊀将长成致密单层的V e r o细胞６７２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d,M a y２０２１,V o l．４２,N o．１０∗基金项目:国家科技重大专项(２０１８Z X０９７３９Ｇ００２).ә㊀通信作者,EＧm a i l:y y l i u＠n i f d c．o r g．c n.㊀㊀本文引用格式:杜加亮,刘艳,于晴川,等．１株人感染柯萨奇病毒A组１６型B１b亚型的分离和鉴定[J]．国际检验医学杂志,２０２１,４２(１０):１２７６Ｇ１２８０．用０．２５％胰蛋白酶消化,制成浓度为２ˑ１０５/m L 的细胞悬液备用;同时将待测病毒进行１０倍系列稀释,取稀释度为１０－１０~１０－３的病毒液按每孔５０μL 接种细胞,每个稀释度设置８个复孔;然后立即将细胞悬液按每孔５０μL 加入９６孔板;同时设置细胞对照(１００μL 细胞悬液＋１００μL 病毒稀释液),３６ħ培养７d 后观察细胞病变.以能使细胞发生病变的病毒最高稀释度作为终点.在显微镜下观察到细胞病变记为 ＋ ,否则记为 － .按B e h r e n s ＧK Är b e r 公式计算出分离病毒株的病毒滴度(l o g C C I D ５０)＝L d (S ０．５),其中:L＝实验中使用的最低稀释度的l o g值;d ＝稀释梯度的l o g 值;S ＝终判时阳性部分的总和(即出现C P E 的细胞孔所占的比例之和).１．６㊀分离毒株对乳鼠的致病性㊀将增殖后的病毒悬液反复冻融３次,然后在４ħ㊁１２０００r /m i n 条件下离心１０m i n ,取上清液.实验用７d 龄B a l b /c 乳鼠由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供,同时设实验组和对照组,５只/组,实验组注射病毒液２０μL (１００C C I D ５０),对照组注射等量培养液,颅内注射,逐日观察并记录乳鼠发病情况.１．７㊀全基因组克隆构建㊀参照步骤１．４中的方法提取病毒R N A ,利用分片段引物(见表１),扩增全长基因.目的条带经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定回收后,与pE A S Y ＧT ３载体连接.转化D H ５α大肠埃希菌感受态后,经过蓝白斑筛选㊁酶切鉴定和测序验证,提交G e n B a n k.根据全长序列酶切位点分析,选择合适的酶切位点将全长序列分两段扩增克隆至p V A X 载体,构建全基因组克隆,酶切鉴定和测序验证.１．８㊀检测方法建立１．８．１㊀R T ＧP C R 方法建立㊀针对V P １设计引物探针,见表１,设计一步法R T ＧP C R .１ˑT a qm a nu n i Ｇv e r s a lm a s t e rm i x Ⅱ２５μL ;C A ＧF (２０μm o l /L )㊁C A ＧR (２０μm o l /L )和C A ＧP (２０μm o l /L )各５μL ,R N A５μL ;反应条件:５０ħ２m i n ;９５ħ１０m i n ;９５ħ１５s ,５５ħ１m i n ;４０个循环.１．８．２㊀质粒参考品制备㊀将V P １编码基因克隆入pE A S Y ＧT ３载体作为质粒参考品.质粒纯度符合要求吸光度(A )２６０/２８０为１．８~２．０)后作为备用参考品原液.质粒拷贝数(c o p y /μL )按照以下公式计算:(６．０２ˑ１０２３)ˑ(质粒浓度n g /μL ˑ１０－９)/(质粒长度b pˑ６６０).本研究中使用稀释至１０６㊁１０５㊁１０４㊁１０３㊁１０２c o p y /μL 的质粒作为参考品.表１㊀㊀探针引物信息名称碱基序列(５ᶄ－３ᶄ)位置长度(b p )作用C V ＧA １６ＧF １T T A A A A C A G C C T G T G G G T T G T １Ｇ２１１４２５全长扩增C V ＧA １６ＧR １G C A C C A A C C T G A C C A G G C T G １４０６Ｇ１４２５１４２５全长扩增C V ＧA １６ＧF ２G C T C A G T T C C A C T A C C T G T A T １２３８Ｇ１２５８１９０５全长扩增C V ＧA １６ＧR ２G A T G C T A A A A G T G C C C A T C A T ３１２２Ｇ３１４２１９０５全长扩增C V ＧA １６ＧF ３A C C C G C C A G C T C A A G T G T C A G２９９４Ｇ３０１４１８３２全长扩增C V ＧA １６ＧR ３C A C C T C T A T A T C G C A G T C C A T４８０５Ｇ４８２５１８３２全长扩增C V ＧA １６ＧF ４A G A G A A A G G A G T G T C T T T C A C ４６９６Ｇ４７１６１４９５全长扩增C V ＧA １６ＧR ４T A G C T G G T T T G C A T A G T G G A G６１７０Ｇ６１９０１４９５全长扩增C V ＧA １６ＧF ５A T T C T A T G A T G T G T T T G A G G G６０２２Ｇ６０４２１３８５全长扩增C V ＧA １６ＧR ５G C T A T T C T G G T T A T A A C A A A T７３８６Ｇ７４０６１３８５全长扩增C V ＧA １６Ｇ１G C G T T T A A A C T T A A A A C A G C C T G T G G G T (P m e I )１Ｇ１８３６３１全基因组克隆构建C V ＧA １６Ｇ３６３１A G C A A G C A T G A G A T G G G A T T G A T A T３６０７Ｇ３６３１３６３１全基因组克隆构建C V ＧA １６Ｇ３５７５T T T G T G G G A G C T A G T G A G T A T T A C C ３５７５Ｇ３５９９３８５７全基因组克隆构建C V ＧA １６Ｇ７４０６G G G C G G C C G C T T T T T T T T T T T T T T T G C ＧT A T T C T G G T T A T A A C A A A (N o t I )７３８７Ｇ７４０６３８５７全基因组克隆构建C A ＧV P １ＧF G G G G A T C C T A T T G C A G A T A T G ２４４１Ｇ２４６１８９１质粒参考品C A ＧV P １ＧR T C C C A A T G T T G T T A T C T T G T C ３３１１Ｇ３３３１８９１质粒参考品C A ＧF T C G C T C C T T G A C T G C G T T G C２４９１Ｇ２５１０１０７检测方法建立C A ＧRC T G T C T C C G C A G C T T G T A G T G C２５７６Ｇ２５９７１０７检测方法建立C A ＧPF AM ＧC A AG T A C T G C C T A C A G C T G C C A A C A C T G ＧT AMA R A２５０９Ｇ２５３７１０７检测方法建立７７２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d ,M a y ２０２１,V o l ．４２,N o ．１０２㊀结㊀㊀果２．１㊀人感染C V ＧA １６分离株的生物学特征㊀成功地从H F M D 患者的粪便标本中分离到１株C V ＧA １６(B J １２０８).该病毒在R D 细胞中培养时可以观察到明显的致细胞病变现象,见图１;在R D 细胞增殖后的病毒滴度为６．８l o g CC I D５０/m L ;以１００C C ID ５０(２０μL )的病毒量在B a l b /c 乳鼠颅内注射后可以观察到典型的后肢瘫痪症状,见图２.㊀㊀注:A 为人感染C V ＧA １６接种R D 细胞;B 为细胞对照.图１㊀㊀人感染C V ＧA １６分离株在R D 细胞上的细胞病变现象(ˑ１０)㊀㊀注:A 为人感染C V ＧA １６感染小鼠;B 为正常小鼠对照.图２㊀㊀B a l b /c 小鼠注射人感染C V ＧA １６分离株后的肢瘫痪症状２．２㊀人感染C V ＧA １６分离株的分子生物学特征㊀分段扩增(图３)测序后拼接获得该病毒的完整基因组序列(G e n B a n k A c c e s s i o n N o ．:J X ５０７８０８),全长７４０６b p ,包括７４５b p 的５ᶄU T R ㊁６５７９b p 的蛋白编码区(编码２１９３个氨基酸)及８２b p 的３ᶄU T R .根据C V ＧA １６V P １序列构建的系统进化树显示,该病毒分离株为B １b 亚型,且与俄罗斯２００７年分离株(K C ８７９５０１)具有最近的亲缘关系,见图４.但是与其他病毒相比,明显不同的是该分离株在V P １编码蛋白中(６８８~６９０b p 处)缺少一个蛋氨酸,见图５.但从其生物学特征来看,该缺失并不影响病毒复制和感染能力.㊀㊀注:M １为D L ２０００D N A 标记物;M ２为１k b l a d d e r ;泳道１Ｇ２㊁３Ｇ６㊁７Ｇ８㊁９Ｇ１３㊁１４Ｇ１８分别是C V ＧA １６F １~F ５５个P C R 扩增片段T A 克隆的酶切鉴定结果.图３㊀㊀C V ＧA １６B J １２０８全基因组分段扩增片段T A克隆的酶切鉴定结果２．３㊀全基因组克隆构建㊀对全基因组进行酶切位点分析,利用一个单酶切位点(E c o R V )及基因组中未含有的两个酶切位点(P m e I 和N o t I ),将基因组分成两个片段依次扩增克隆和连接至载体p V A X １中,构建全基因组克隆p V A X １ＧC A １６.经酶切(P m eI ＋E c o R V )(约３．６和６．９k b 两个片段,见图６)和测序验证了基因组克隆后未发生基因突变.㊀㊀注:һ表示本研究中的病毒分离株B J １２０８.图４㊀㊀进化树分析图５㊀㊀C V ＧA １６B J １２０８V P １编码区核苷酸比较(部分)２．４㊀检测方法㊀由４次重复检测结果可见,质粒标准品的浓度对数与循环阈值(C t 值)在１０２~１０６c o pＧ８７２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d ,M a y ２０２１,V o l ．４２,N o ．１０y /μL 呈现明显的线性相关(Y ＝－１．６０２l n (X )＋３６．８７３,R ２＝０．９９９９),可用作该毒株的定性检测和病毒增殖滴度定量检测.㊀㊀注:１为未酶切质粒对照;２为质粒经P m e I ＋E c o R V 双酶切;M 为D N A 标记物.图６㊀㊀酶切鉴定电泳图３㊀讨㊀㊀论㊀㊀本研究成功从H F M D 患者的粪便标本中分离到１株在体内(B a l b /c 乳鼠)和体外(R D 细胞)均具有典型生物学特征的B １b 亚型C V ＧA １６(B J １２０８)病毒.建立了一套从病毒分离㊁鉴定㊁系统进化分析㊁全基因组扩增和克隆到荧光定量检测方法建立的技术平台,为该类病毒的后续研究提供了参考.虽然C V ＧA ６㊁C V ＧA １０等病原体在亚洲㊁美洲和欧洲逐渐取代E V ＧA ７１和C V ＧA １６成为引起H F M D暴发或流行的主要病原体,但是传统的病原体仍然不能被忽视[１０].C V ＧA １６感染可导致多种疾病,从轻度H F M D ㊁疱疹性咽峡炎㊁上下呼吸道疾病到严重并发症,如脑炎㊁瘫痪㊁脊髓炎㊁脑膜炎,甚至死亡.C V ＧA １６的基因型和基因亚型众多,但是型别与疾病严重程度之间的关系尚不十分明确.C V ＧA １６病毒B １b 亚型在我国多个省份均有报道[１１],并且田晓灵等[１２]发现内蒙古自治区不同临床症状患者中分离出的C V ＧA １６代表株在分子基因型/基因亚型及亲缘进化关系树分布上虽无明显差异,但大部分的重症病例和死亡病例感染病毒都分布在B １b 分支中.本研究中分离到的B １b 亚型C V ＧA １６(B J １２０８)病毒来源于重症患者的粪便标本,这提示在疾病监测过程中应重视收集基因型/亚型与疾病严重程度的关系数据,为疾病的治疗及疫苗毒株的选择提供依据.通常认为,C V ＧA １６的V P １编码区氨基酸序列相对于其他肠道病毒较为保守,且与其抗原性密切相关[１３].因此,这一区域发生的氨基酸特性改变可能对蛋白质空间结构有一定的影响,从而导致毒力的改变[１４Ｇ１７].本研究中的分离株B J １２０８虽然在V P １编码蛋白中(６８８~６９０b p 处)缺少一个蛋氨酸.但从其生物学特征和临床来看,该缺失并不影响病毒复制和感染能力.得益于反向遗传操作技术的成功应用,可以从基因型的改变来研究表型的变化.以往研究多是利用T ７聚合酶系统以线性化的重组质粒为模板进行体外转录反应得到C A １６病毒基因组R N A ,并将C A l ６基因组R N A 转染至适宜细胞获得拯救病毒.而以C MV 为启动子实现病毒拯救的策略可以利用哺乳动物细胞内天然的Ⅱ类R N A 聚合酶来实现转录,在操作上更为简捷[１８],可以用于研究基因突变㊁缺失或插入等改变对病毒性状的影响.pV A X l 是在载体p c D N A ３．１的基础上改建而成的一种新型真核表达载体,是美国食品药品监督管理局(F D A )批准的唯一一个可以用于D N A 疫苗的载体.该质粒含有的强启动子p C MV 和B G H p o l y A 信号可以在哺乳动物细胞中高水平表达重组蛋白[１９].与经典的T ７启动子相比,少了体外转录的步骤.本研究利用p V A X l 作为载体构建了全基因组克隆,下一步工作是在此基础上对全基因组克隆进行改造,如在５ᶄ和３ᶄ端增加核酶来提高剪切精确度等[２０],实现病毒拯救,以期为病毒基因型和表型关系的研究提供更便捷的工具.本研究建立了一个基于C V ＧA １６病毒的分离鉴定体系,以期为复杂多样的H F M D 病原体的相关研究提供更多的参考.参考文献[１]赵云,蔡晶娟,彭程,等．手足口病病毒核酸及抗体检测的比较研究及应用[J ]．国际检验医学杂志,２０２０,４１(１４):１６７８Ｇ１６８１．[２]MA O Q Y ,WA N G Y P ,Y A O X ,e ta l ．C o x s a c k i e v i r u sA １６:e p i d e m i o l o g y ,d i a gn o s i s ,a n dv a c c i n e [J ]．H u m V a c Ｇc i n I mm u n o t h e r ,２０１４,１０(２):３６０Ｇ３６７．[３]P E R E R A D ,Y U S O F M A ,P O D I N Y ,e ta l ．M o l e c u l a rp h y l o g e n y ofm o d e r n c o x s a c k i e v i r u sA １６[J ]．A r c hV i r o l ,２００７,１５２(６):１２０１Ｇ１２０８．[４]C A R R I O N G ,HU AMA NJL ,S I L V A M ,e t a l ．M o l e c u l a re p i d e m i o l o g y ofc o x s a c k i e v i r u s A １６s t r a i n sf r o m f o u r s e n t i n e l s u r v e i l l a n c es i t e si n P e r u [J ]．I n tJI n f e c tD i s ,２０１６,５２:８３Ｇ８５．[５]HA S S E LC ,M I R A N D A ,F A R K A S A ,e t a l ．P h y l o g e o gＧr a p h y o fc o x s a c k i e v i r u s A １６r e v e a l s g l o b a l t r a n s m i s s i o n p a t h w a y s a n d r e c e n t e m e r g e n c e a n ds pr e a do f a r e c o m b i Ｇn a n t g e n o g r o u p [J ]．JV i r o l ,２０１７,９１(１８):e ００６３０Ｇ１７．[６]WA N GJ ,T E N G Z ,C HU W ,e ta l ．T h ee m e r ge n c ea n d s p r e a dof o n eC o x s a c k i e v i r u sA １６G e n og r o u p Dn o v e l r e Ｇc o m b i n a n ts t r a i nth a tc a u s e dac l u s t e ri n g H F M D o u t Ｇb r e a k i nS h a n g h a i ,C h i n a ,２０１６[J ]．E m e r g Mi c r o b e sI n Ｇf e c t ,２０１８,７(１):１３１．９７２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d ,M a y ２０２１,V o l ．４２,N o ．１０[７]Z HA N G Y,WA N G D,Y A N D,e t a l．M o l e c u l a r e v i d e n c e o f p e r s i s t e n te p i d e m i ca n de v o l u t i o no fs u b g e n o t y p eB１c o x s a c k i e v i r u sA１６Ｇa s s o c i a t e dh a n d,f o o t,a n d m o u t hd i sＧe a s e i nC h i n a[J]．JC l i n M i c r o b i o l,２０１０,４８(２):６１９Ｇ６２２．[８]WA N G X,S H E N C,C H E N T,e t a l．I m p r o v e d p l a s m i dＧb a s e d r e c o v e r y o fc o x s a c k i e v i r u s A１６i n f e c t i o u s c l o n e d r i v e nb y h u m a nR N A p o l y m e r a s eI p r o m o t e r[J]．V i r o lS i n,２０１６,３１(４):３３９Ｇ３４１．[９]A S WA T H Y R A JS,A R U N K UMA R G,A L I D J I N O U E K,e t a l．H a n d,f o o ta n d m o u t hd i s e a s e(H F M D):e m e rＧg i n g e p i d e m i o l o g y a n d t h e n e e d f o r a v a c c i n e s t r a t e g y[J]．M e d M i c r o b i o l I mm u n o l,２０１６,２０５(５):３９７Ｇ４０７．[１０]X I EJ,Y A N G X H,HUSQ,e t a l．C oＧc i r c u l a t i o no f c o xＧs a c k i e v i r u s e sAＧ６,AＧ１０,a n d AＧ１６c a u s e sh a n d,f o o t,a n d m o u t hd i s e a s e i n G u a n g z h o uc i t y,C h i n a[J]．B M CI n f e c tD i s,２０２０,２０(１):２７１．[１１]魏雷雷,王岙,吴东林,等．２０１５ 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b o d i e s i nv a c c i n a t e d m i c [J]．F r o n t I m m u n o l,２０１９,１０:１１４５．[２０]魏国超,田文洪,王刚,等．C MV与T７启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较[J]．病毒学报,２０１２,２８(３):２３７Ｇ２４５．(收稿日期:２０２０Ｇ０８Ｇ２６㊀修回日期:２０２１Ｇ０１Ｇ０３)(上接第１２７３页)种有效工具,通过长期的横向和纵向比较,可帮助实验室监测质量水平.L I S系统使得实验室收集数据统计质量指标变得简单易行,为实验室质量改进提供了依据和可能,能够客观分析实验室质量风险来源,促进实验室信息化建设持续加强[８].通过对检验报告不正确率的监控可及时发现检验质量的偏离,确保检测工作的质量,尽量在实验室分析前或在检验结果审核中识别出标本错误,结合既往结果及时与临床沟通,避免存在干扰因素.如果在临床反馈结果不符时调查分析出的标本错误,应及时汇总,必要时保存相关临床联系/咨询/投诉三联表或不良事件/不合格工作二联表,请医务处和护理部等部门协助解决,在工作实践中不断探索,寻找有效的持续改进方法,提高质量.参考文献[１]中国合格评定国家认可委员会．医学实验室质量和能力认可准则:C N A SＧC L０２[S]．北京:中国合格评定国家认可委员会,２０１２．[２]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会．临床检验专业１５项医疗质量控制指标(２０１５版):国卫办医函[２０１５]２５２号[S]．北京:中国标准出版社,２０１５．[３]I n t e r n a t i o n a lF e d e r a t i o no fC l i n i c a lC h e m i s t r y a n dL a b oＧr a t o r y M e d i c i n e(I F C C)W o r k i n g G r o u p o n L a b o r a t o r y E r r o r s a n dP a t i e n t S a f e t y(WGＧL E P S)．I n t e r n a t i o n a l f e dＧe r a t i o n o f c l i n i c a l c h e m i s t r y a n d l a b o r a t o r y m e d i c i n ew o r k i n gg r o u p＂l a b o r a t o r y e r r o r sa n d p a t i e n tS a f e t y＂．MQ I s u p p o r tＧr e v i s i o n１[E B/O L]．(２０１７Ｇ０１Ｇ０１)[２０２０Ｇ０３Ｇ１６]．h t t p://w w w．i f c cＧm q i．c o m/M q i W e b/r e s o u r c e s/d o c/ Q u a l i t y I n d i c a t o r s_S u p p o r t_P r o c e s s e s．P d f．[４]郭翀,刘子杰,宋贵波,等．对１５项临床检验专业质控指标５年统计与分析[J]．中华检验医学杂志,２０１６,３９(１):２９Ｇ３３．[５]黄钰竹,王薇,赵海建,等．临床检验结果解释性注释的研究进展[J]．临床检验杂志,２０１８,３６(１２):９２０Ｇ９２２．[６]张鸿伟,李芜婷,吴菊芬,等．急诊检验不正确报告管理措施的探索[J]．实验与检验医学,２０１９,３７(４):６４９Ｇ６５１．[７]王治国,费阳,王薇,等．理解临床检验质量指标,抓质量从实验室内部做起[J]．中华检验医学杂志,２０１６,３９(１):４Ｇ６．[８]郭野,陈倩,吴卫,等．实验室信息管理系统在检验质量关键指标管理中的应用[J]．中华医学杂志,２０１５,９５(１２):８９８Ｇ９０２．(收稿日期:２０２０Ｇ０９Ｇ１６㊀修回日期:２０２０Ｇ１２Ｇ２９)０８２１ 国际检验医学杂志２０２１年５月第４２卷第１０期㊀I n t J L a bM e d,M a y２０２１,V o l．４２,N o．１０。
浙江省柯萨奇病毒A16 VP1基因特征分析及B细胞抗原表位预测
浙江省柯萨奇病毒A16 VP1基因特征分析及B细胞抗原表位预测徐莉;陈瑜;崔大伟;戴玉柱;王磊;杨先知;谢国良;郑书发;孙长贵;成军【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2017(35)1【摘要】Objective To understand the genetic characteristics and the variation pattern of the VPI gene among the Coxsackievirus A16 (CA16) strains isolated in Zhejiang province,and predict the possible B lymphocyte antigen epitopes in the VP1 protein.Methods All the VP1 gene sequences of 35 CA16 strains isolated in Zhejiang and 69 genotyped reference strains were retrieved from GenBank.MEGA6.0 software was used to compare these sequences and constructed phylogenetic tree to determine the genotypes of the CA16 strains isolated in Zhejiang,and the analysis of homology consistency of nucleotide and mutation of amino acid were performed.DNA Star Protean module was used to predict the possible B lymphocyte antigen epitopes in the VP1 protein.Results There were 2 genotypes among the CA16 strains in Zhejiang province,i.e.,B1 genotype (34 strains) and A genotype (1 strain).B1b subtype (24 strains) dominated in B1 genotype,followed by B1a subtype (10 strains).The homology consistency of nucleotide and amino acid of VP1among all the CA16 strains in Zhejiang were 75.5％ to 100％ and 89.5％ to 100％respectively.The amino acid sequences of VP1 among the CA16 strains inZhejiang were highly conserved,but there were also some variations among them.There were 13 possible B lymphocyte antigen epitopes (amino acid peptides) in the VP1 protein,i.e.,10-20,30-38,57-62,73-79,98-106,118-123,159-168,173-177,184-189,240-246,265-273,274-284 and 289-295.Conclusion Two genotypes,A and B1,in CA16 strains were isolated in Zhejiang.B1b and B1a were the major subtypes.The amino acid mutation degree of VP1 protein of CA16 strains in Zhejiang was quite low.The prediction of 13 B lymphocyte antigen epitopes in the VP1 protein could provide scientific reference foundation for the development of the vaccine against CA16 strain.%目的了解浙江省柯萨奇病毒A16(CA16) VP1基因特征及其变迁规律并预测VP1蛋白上B细胞抗原表位.方法在GenBank检索并下载35个浙江省CA16流行株及69个已知基因型CA16参考株的VP1基因序列,使用MEGA 6.0软件进行比对分析和构建种系进化树,确定浙江省CA16流行株的基因型,并分析VP1核苷酸和氨基酸同源性及氨基酸变异;运用DNAStar中的Protean模块预测VP1上可能的线性B淋巴细胞抗原表位.结果浙江省CA16病毒基因型为B1基因型(34株)和A基因型(1株).B1型中以B1b亚型(24株)占绝对优势,其次为B1a亚型(10株).浙江省CA16流行株VP1核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5％～ 100％和89.5％～ 100％;VP1区氨基酸序列高度保守,但也存在部分变异.VP1中可能的B细胞抗原表位(氨基酸肽段)有13个,分别为10-20、30-38、57-62、73-79、98-106、118-123、159-168、173-177、184-189、240-246、265-273、274-284和289-295.结论浙江省CA16流行株存在A、B1 2个基因型,B1b和B1a为主要基因型,其VP1区氨基酸变异程度较低,VP1中13个预测的B细胞抗原表位可为CA16疫苗的研制提供科学依据.【总页数】7页(P65-71)【作者】徐莉;陈瑜;崔大伟;戴玉柱;王磊;杨先知;谢国良;郑书发;孙长贵;成军【作者单位】浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室,杭州310003;中国人民解放军第一一七医院检验科,杭州310013;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室,杭州310003;中国人民解放军第一一七医院检验科,杭州310013;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室,杭州310003;中国人民解放军第一一七医院检验科,杭州310013;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室,杭州310003;中国人民解放军第一一七医院检验科,杭州310013;中国人民解放军第一一七医院检验科,杭州310013【正文语种】中文【中图分类】R512.5【相关文献】1.猪细小病毒自然弱毒N株VP1蛋白二级结构及B细胞抗原表位预测 [J], 李斌;赵武;梁家幸;梁保忠;姚瑞英;黄安国;何颖;蒋玉雯2.柯萨奇病毒A10型VP1蛋白的线性B细胞表位预测 [J], 沈红元;陈玉蓉3.衣原体噬菌体Chp3衣壳蛋白Vp1二级结构及B细胞抗原表位预测 [J], 姚卫锋;刘原君;李燕;齐蔓莉;田敬群;刘全忠4.人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型B细胞线性表位的生物信息学预测 [J],高柳莺; 祝苗; 戎浩; 董长征5.新型鸭呼肠孤病毒QY株σB蛋白基因特征、二级结构预测及其细胞抗原表位分析 [J], 吴阳开; 范文胜; 张雪莲; 李智丽; 郭锦玥; 李文锋; 黄淑坚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
2011～2012年武汉地区柯萨奇病毒A16型VP1基因的遗传进化分析
2011～2012年武汉地区柯萨奇病毒A16型VP1基因的遗传进化分析伍仕敏;项杰;周虹;吴志强;李虹泽;刘为勇;吴建国【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2014(32)4【摘要】目的了解武汉地区手足口病(HFMD)患儿柯萨奇病毒A16型(CA16)的基因型及重组特点.方法收集2011年4月至2012年3月武汉地区1 844例HFMD 患儿的咽拭子标本,用实时荧光定量PCR检测CA16核酸,阳性标本进行病毒分离,对分离株进行VP1基因序列测序,选择2株来自重症和1株来自轻症患几的CA16病毒株构建VP1序列系统进化树并分析其全基因组序列的重组特点.结果 1 844例HFMD患儿的咽拭子标本中分离出42株CA16,VP1序列系统进化分析显示,所有分离株均属于B1亚型,其中13株属于B1a亚群,29株属于B1b亚群.重组分析表明,3株CA16分离株均为亲本株CA16 A型毒株FY18/AH/CHN/2008和EV71 A 型毒株Hubei-09/HB/CHN/2009型间重组所产生,重组交叉位点为基因组P2区2A和2B基因交界处.结论武汉地区的CA16分离株均为B1亚型,其中B1b亚群占明显优势,且CA16分离株存在亲本株CA16A型和EV71 A型毒株的型间重组.【总页数】5页(P272-276)【作者】伍仕敏;项杰;周虹;吴志强;李虹泽;刘为勇;吴建国【作者单位】武汉市医疗救治中心检验科,武汉430032;武汉市医疗救治中心检验科,武汉430032;武汉市医疗救治中心检验科,武汉430032;武汉市医疗救治中心检验科,武汉430032;武汉市医疗救治中心检验科,武汉430032;武汉大学生命科学院,武汉430072;武汉大学生命科学院,武汉430072【正文语种】中文【中图分类】R725.1【相关文献】1.柯萨奇病毒A16型VP1基因和病毒生物物理学分析 [J], 刘杨;郭春艳;张西嫔;郑利茹;赵向绒;郭华;胡军2.2011～2012年武汉地区肠道病毒71型VP1基因的遗传进化分析 [J], 伍仕敏;项杰;周虹;吴志强;李虹泽;刘为勇;吴建国3.肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析 [J], 张建华;江炳福;程险峰;游贤惠;孟继鸿4.2011年～2012年G9型猪轮状病毒流行病学调查及VP7基因遗传进化分析 [J], 王璐;时洪艳;陈建飞;张鑫;史楠;石达;刘随新;张莎;冯力5.2020年广东肇庆地区鹅细小病毒VP1基因遗传进化分析 [J], 赵丹;陈德成;胡楚坪;朱婉君;陈济铛;张济培因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
柯萨奇病毒A组16型衣壳蛋白VP1的原核表达及初步活性测定
［ 要 ］ 目的 ： 核 表 达 柯 萨 奇 病 毒 Ａ组 １ （ Ｖ ６ 衣 壳 蛋 白 Ｖ １ 以便 于 研 制 血 清 学检 测 试 剂 。方 法 ： 基 因库 摘 原 ６型 Ｃ Ａ１ ） Ｐ ， 在 中钓 取 Ｃ Ａ ６ Ｖ １的全 长 序 列 ， Ｖ １一 Ｐ 采用 Ｐ Ｒ逐 步 合 成 法合 成 其 全 长 基 因 ， 序 正确 后 克 隆 到 表 达 载 体 ｐ Ｔ ８ （ ） ， Ｃ 测 Ｅ ２ａ＋ 中 构建 重组表达质粒 ｐ Ｔ ８（ ） Ｐ ， 化大肠杆菌 Ｂ ２ ， Ｔ Ｅ ２ａ＋／ １转 Ｖ Ｌ １ Ｉ Ｇ诱 导 表 达 ， 用 Ｎ 亲 和 层 析 柱 对 重 组 蛋 白进 行 纯 化 ； Ｐ 利 ｉ
研 究 报 告
柯 萨 奇 病 毒 Ａ组 １ 衣 壳 蛋 白 ＶＰ 的 原 核 表 达 及 初 步 活 ６型 １ 性 测 定
张 向颖 ， 芳 ， 刘 谢立 。， ‘ 陈垄 戴振 华 ， ， 修冰 水 张贺秋 。 ，
１ ．首 都 医科 大 学 附 属 北 京佑 安 医 院 ， 京 １０ ６ ；２ 北 ０ ０ ９ ．北 京 市 肝 病 研 究 所 ， 京 １０ ６ ；３ 北 ０ ０ ９ ．军 事 医 学 科 学 院 基
达 ； 重 组 蛋 白抗 原检 测 ， ０ 手 足 口病 患 儿 阳 性 血 清 中 有 ４ 阳性 ， 中 １ 同 时 为 肠 道 病 毒 ７ 型 （ Ｖ １ Ｖ １阳 用 ２ 份 份 其 份 ｌ Ｅ ７）Ｐ
性 ， ０份 阴性 血 清 无 反 应 。 结 论 ： 实现 了Ｃ ３ ＶＡ１ 一 ６ ＶＰ１的 高 效 表 达 ， 步 结 果 显示 重组 蛋 白具 有 较 好 的抗 原 性 ， 初 为柯
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·546· E-mail:zgqkyx@•论著•柯萨奇病毒A组16型病毒株VP1基因序列测定及进化分析研究李小平1*，吴亦栋2，周俊2，周林福3，樊凯1，钱苗苗1【摘要】 目的 通过检测分析2015年杭州市柯萨奇病毒A组16型（CA16）病毒株VP1区核苷酸序列，掌握杭州市CA16的流行情况及种系进化关系，为手足口病的预防和治疗提供支持，同时为CA16疫苗株的选择提供依据。
方法 收集2015年杭州市儿童医院256例临床资料齐全且临床诊断为手足口病患儿的粪便或咽拭子，利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增CA16病毒株VP1区核苷酸序列（约1 020 bp），测序后利用DNASTAR和Primer Premier 5.0进行序列比对分析，并用Mega 3.1软件建立检测样本VP1区序列与GenBank上CA16参考毒株VP1核苷酸序列的系统发育树。
结果 共分离到80株CA16阳性病毒。
序列比对分析结果显示，CA16分离株的核苷酸同源性为90.8%～100.0%，氨基酸同源性为99.5%～100.0%。
系统发育树分析结果显示，17株CA16全部属于B1基因亚型，并且同时存在B1a和B1b两个进化分支，其中4株属于B1a亚型，13株属于B1b亚型。
结论 2015年杭州市CA16病毒株属于B1基因亚型，与国内外某些地区手足口病病原学及分子进化研究结果一致，有望成为疫苗候选株作进一步研究。
【关键词】 手足口病；柯萨奇病毒感染；柯萨奇病毒A组16型；VP1；系统进化分析【中图分类号】 R 512.5 【文献标识码】 A DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.099李小平，吴亦栋，周俊，等．柯萨奇病毒A组16型VP1基因序列测定及进化分析研究［J］．中国全科医学，2018，21（5）：546-550.［］LI X P，WU Y D，ZHOU J，et al．VP1 sequence determination and phylogenetic analysis of coxsackievirus A16 strains［J］. Chinese General Practice，2018，21（5）：546-550.VP1 Sequence Determination and Phylogenetic Analysis of Coxsackievirus A16 Strains LI Xiao-ping1*, WU Yi-dong2, ZHOU Jun2, ZHOU Lin-fu3, FAN Kai1, QIAN Miao-miao11.Hangzhou Dianzi University, Hangzhou 310018, China2.Hangzhou Children's Hospital, Hangzhou 310014, China3.Faculty of Basic Medicine, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310058, China*Corresponding author:LI Xiao-ping,Associate chief technician;E-mail:1019717619@【Abstract】 Objective To determine the VP1 sequence of coxsackievirus A16(CA16) strains from Hangzhou, China in 2015, and based on this, to investigate the prevalence and phyletic evolution of CA16 in this district,in order to provide a referencefor the prevention and treatment of hand, foot and mouth disease(HFMD) and the selection of prophylactic vaccine against HFMD related to CA16. Methods A total of 256 children who were diagnosed as HFMD and received treatment in Hangzhou Children's Hospital in 2015 and had complete clinical data were enrolled.Their culture test results of throat swabs or stool samples were collected.By RT-PCR, VP1 sequencewas amplified (about 1 020 bp).DNASTAR and Primer Premier 5.0 were used for comparative analysis of the amplified products and the complete CA16 sequences in the NCBI database. Mega 3.1 software was used to establish VP1 sequences and GenBank CA16 reference strain VP1 sequence phylogenetic tree.Results Totaled 80 strains of CA16 virus were isolated. Compared with the CA16 sequences in the NCBI database, the nucleotide homology, amino acid homology for CA16 sequences from Hangzhou were 90.8%-100.0%, 99.5%-100.0%, respectively. Phylogenetic tree analysis showed that, all the 17 CA16 strains belong to B1 subtype, including 2 evolutionary branches, B1a(4 strains) and B1b(13 strains). Conclusion The CA16 strains from Hangzhou in 2015 belong to B1 subtype, which is consistent with the results of molecular 基金项目：2015年浙江省教育厅科研资助项目（Y201533677）1.310018 浙江省杭州市，杭州电子科技大学2.310014 浙江省杭州市，杭州市儿童医院3.310058 浙江省杭州市，浙江大学医学院基础医学系*通信作者：李小平，副主任技师；E-mail：1019717619@ E-mail:zgqkyx@·547·手足口病是以手、足、口腔、咽、软腭、颊黏膜、舌、齿龈出现疼痛性粟粒至绿豆大小水疱为特征的急性传染病，10岁以下婴幼儿易发此病［1］。
手足口病致病原因是患儿感染肠道病毒。
肠道病毒种类众多，易引发手足口病的常见肠道病毒有肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）。
多数手足口病患儿可自愈，少数患儿可引起肺水肿、心肌炎、无菌性脑炎等并发症。
不同类型的肠道病毒感染所致手足口病症状临床表现类似，因而难以区别。
其中，由EV71感染的手足口病，易引发肺水肿、无菌性脑膜炎和神经系统疾病等，甚至危及患儿生命［2］。
与EV71相比，CA16感染通常不引起严重的中枢神经相关疾病，但有研究表明其可能与心肌炎、心肌病、心包炎及其他严重疾病具有相关性［3-4］。
本研究通过测定分析杭州市CA16病毒株VP1核苷酸序列与国内外常见参考毒株和标准毒株的差异，研究CA16的遗传学背景和种系进化关系，进而掌握其流行情况，为其所致疾病的预防和治疗提供支持。
此外，接种疫苗对于预防手足口病暴发的意义重大，本研究亦可为CA16疫苗株的选择提供可靠依据。
1 材料与方法1.1 标本来源 选取2015年在杭州市儿童医院收集的256例临床资料齐全且临床诊断为手足口病患儿的粪便或咽拭子。
纳入标准：（1）病例临床诊断及临床分型均符合《手足口病诊疗指南（2010年版）》［5］，其中轻型病例表现为手、足、口腔、咽、软腭、颊黏膜、舌、齿龈出现皮疹、溃疡等；重型病例分为重型和危重型，重型患儿表现为精神烦躁、头疼等神经性症状，且伴有恶心呕吐、四肢颤抖、眩晕惊厥等，危重型患儿表现为频发性抽搐、呼吸困难、发绀甚至休克。
（2）实验室诊断符合CA16感染的病原学诊断。
排除标准：病史资料不全和/或实验室诊断不符合以下3项中的任意一项：（1）CA16特异性核苷酸检测阳性；（2）分离出肠道病毒，并鉴定为由CA16引起手足口病；（3）急性期与恢复期血清CA16肠道病毒中和抗体升高>4倍。
1.2 RNA提取 从临床样本中提取病毒RNA，根据不同的样本类型加入不同比例的0.9%氯化钠溶液：（1）粪便样本按照1∶10的比例加入0.9%氯化钠溶液充分振荡混匀；咽拭子样本加入1 ml 0.9%氯化钠溶液充分振荡混匀；（2）以13 000 r/min离心10 min，离心半径22 cm，后取200 μl上清液，根据罗氏High pure viral RNA kit的操作说明提取病毒RNA，提取RNA的方法与笔者前期研究［6］相同。
1.3 引物设计 在NCBI核苷酸序列数据库中搜索CA16病毒株VP1基因全序列，利用DNASTAR和Primer Premier 5.0软件进行比对分析，引物设计方法与笔者前期研究［6］相同，通过设计筛选出最佳的简并引物，引物序列见表1。
表1 反转录聚合酶链反应扩增用引物序列Table 1 Primer sequence for RT-PCR amplification of CA16引物名称引物序列(5'→3')产物（bp）参考毒株(GenBank序列号）CA16-VP1-F AAGAACTTYACYHTRAARWTKTGCAAGG 1 020CA16 Tainan/5079/98 CA16-VP1-R RGTRGCVAGTRGYCKRTTKACCACT 1 020AF1779111.4 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增 利用成品试剂盒（大连宝生物公司TaKaRa One Step RT-PCR）对提纯的样本RNA进行反转录扩增。