碱性磷酸酶的分离纯化鉴定

二、提取
加入2ml正丁醇，搅拌2min，室温放置30min。过 滤，留上清。计体积。
三、分离纯化
1、50％丙酮沉淀AKP 加入等体积丙酮，3000rpm×5min，留沉淀， 加4ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。 （取0.1ml留作B液，稀释10倍） 2、30％乙醇溶解AKP 每ml溶液中加入95％乙醇0.46ml 2000rpm×5min，留上清（记录体积） 3、60％乙醇沉淀AKP 每ml溶液中加入95％乙醇0.86ml 3000rpm×5min，留沉淀， 加3ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。 （取0.1ml留作C液，使用时稀释5倍）
溶液，这种方式最为常用。
基本组件及常见分光光度计
分光光度计的使用
1. 打开电源预热15分钟
2. 选择波长（ λmax ）
3. 光标指向Trans 4. 打开光门，调节0％；关上光门调节100％ 5. 重复4一次 6. 将光标指向ABS
7. 读数
AKP活性测定基本原理－－磷酸苯二钠法
碱性磷酸酶
磷酸苯二钠
4、33％丙酮溶解AKP
每ml溶液中加入0.33ml丙酮
2000rpm×5min，留上清（记录体积）
5、50％丙酮沉淀AKP
每ml溶液中加入0.36ml丙酮
3000rpm×15min，留沉淀，
5ml Ph8.8的Tris-醋酸镁溶解沉淀 （D液，不稀释）
四、分析及鉴定
1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法） 2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法） 3、比活性及纯化倍数计算
分光光度法 （Spectrophotometry）
根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收 （即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种 定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法 （Absorption spectrometry）。 不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来
（一）基本原理
1、光的基本知识
5
1
单位（ml） 各阶段稀释液 蛋白标准液（0.2mg/ml） 蒸馏水 BCA试剂
空白管 / / 0.1 1.5
标准管 / 0.1 / 1.5
A 0.1 / / 1.5
B 0.1 / / 1.5
C 0.1 / / 1.5
D 0.1 / / 1.5
37保温 30分钟
562nm 比色
蛋白含量（mg/ml） =
K-- 吸光系数,是物质的特征性常数。
对比法进行定量分析
A样 = K · L· C样
A标 = K · L· C标
A样 A标 K· L· C样 C样 C标
K· L· C标
C样 = A 样 · C标 / A标
Lambert—Beer定律的适用范围：
单色光、平行光（λ max）
溶液均匀、清澈、无散射
光具有波粒二相性。
波长和频率是光的波动性的特征。 紫外分光光度计（200－400nm） 可见光分光光度计（400－760nm）
红外分光光度计（760－1000nm）
2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律
A ＝ K· L· C
吸光度 (Aabsorbance,A ) 消光度 (degree of extinction,E ) 光密度 (optical density,D )
碱性磷酸酶的分离纯化
有机溶剂分步沉淀法
分离纯化的一般程序
选百度文库材料
破碎细胞
提取
分离纯化
分析及鉴定
原理：
AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中），
AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），
操
一、取材及匀浆
作
取兔肝2g，剪碎， 加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分 匀浆。 记录体积 （取0.1ml至一新EP管留作A液，测定时稀释25倍）
A样 A标
×0.2 ×稀释倍数
蛋白标准液浓度
计
算
样品的酶活性单位
碱性磷酸酶比活性（U/mg） =
样品的蛋白含量
每一步比活性 纯化倍数 = 初提液比活性
得率 =
每一步总活性
初提液总活性
每一步总活性 = 酶活性 × 每一部记录的体积数
37保温 15分钟 各管加入铁氰化钾液2ml，静置15min 510nm 比色
酶活性单位 （U/ml）=
A样 A标
×0.1 ×稀释倍数
酚标准液浓度
蛋白含量测定基本原理－－BCA法
蛋白质+Cu
2＋
碱性
Cu＋
BCA试剂
紫色化合物
二喹啉甲酸，BCA
稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ）
/
/
50
20
苯酚 + 磷酸盐
苯酚 + 4-氨基安替吡啉 + 铁氰化钾
碱性
红色醌式化合物
稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ）
/
/
25
10
5
1
单位（ml）
空白管
标准管 / 0.1 / 3
A 0.1 / / 3
B 0.1 / / 3
C 0.1 / / 3
D 0.1 / / 3
/ 各阶段稀释液 酚标准液（0.1mg/ml） / 0.1 Tris-醋酸镁 3 复合底物液
溶液性质稳定，比色皿中无化学反应
适用于稀溶液（A 0.2-0.7）
参比溶液的选择
溶剂空白： 当显色剂及所用其它试剂在测定波 长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作 参比溶液。 试剂空白： 当显色前的样品在测定波长没有吸 收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸
收时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比