第7章 原生质体的培养
第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合
4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融
合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。 6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
融合过程中细胞膜变化
类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法
物理法、化学法及生物法 。
原理 增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法
在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。 膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
原理与过程
灭活后的病毒颗粒结合到原 生质体表面。两受体细胞开 始凝聚。 两细胞的膜紧密结合。病毒 被膜与受体细胞的浆膜融合 。病毒颗粒周围的膜脱离整 个膜，产生破口，在两细胞 间形成细胞质通道（37℃下 1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为 H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后 引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发 生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻
原生质体的培养
原生质体的培养原生质体（Protoplast）:指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。
一、原生质体的应用由于没有细胞壁，原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了极为有利的试验材料。
原生质体可以用于下面几种研究。
用作细胞杂交服务于作物改良用作遗传转化的对象研究细胞壁的发生过程筛选突变体膜的结构、运输、激素接受位点等的研究用于分离细胞器和大分子种质资源保存二、原生质体分离、纯化原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。
（一）分离方法机械法分离缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力酶法分离Cocking最早开展这方面研究，克服了机械法分离的缺陷，可分为直接法和顺序法两种。
酶法可在短时间内获得大量原生质体，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用。
（二）影响原生质体分离的因素（酶法）从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体。
但是对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。
原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。
1. 外植体来源:生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。
用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物（Suspensioncultures）、原球茎、花瓣和叶表皮等。
叶肉细胞是常用的材料,因为叶片很易获得而且能充分供应。
取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。
另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒. 选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。
一般在继代后的第三天游离原生质体。
植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合
202X
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第 七 章 植物原生质体培养及细胞融合
陈传红 制作 2007 / 5
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本章内容提要： 原生质体培养的发展与意义 原生质体的分离 原生质体的培养 植物细胞的融合 体细胞杂种鉴定方法
1975年柑桔原生质体培养成功；
2
现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。
3
陈传红 制作 2007 / 5
番茄+马铃薯？
陈传红 制作 2007 / 5
3、融合方法
01
02
1、机械分离（Machanical isolation）
Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.
高度液泡化的细胞
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离（Enzymatic isolation）
双子叶外植体/培养细胞
单子叶植物胚性细胞
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。
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清新立春时节
什么是原生质体（Protoplast）？
1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
细胞工程原生质体的概念及培养的流程
细胞工程原生质体的概念及培养的流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养
方法：
1.撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使 叶片漂浮在酶溶液中； 2.把叶片或组织切成小块，投入到酶溶液中，可与真 空渗入相结合。
3、酶处理
分离植物细胞原生质体所必须的两种酶是纤维素 酶和果胶酶，后者的作用主要是细胞间的果胶质 降解，前者是消化细胞壁纤维素。
对于某些组织来说,除了纤维素酶和果胶酶外可能
Hemicellulase 63178,USA
酶处理效果
酶解时间
酶浓度
酶解温度
酶浓度
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离 原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而 悬浮细胞则用酶量较大。
酶解时间\酶解温度
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶 尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离 原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶 解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游 离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以 一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活 性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在 40~50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一 般都在25℃左右进行酶解。
1沉降法镍丝网滤出液置于离心管离心23分钟原生质体沉于离心管底部残液碎屑悬浮于上清液弃去上清液再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中反复3次常用的清洗培养基cpw盐溶液成mgl转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍悬浮在上清液中为准一般500800rm的转速下离心35min
1、Protoplast A cell from which the entire cell wall has been removed Isolated protoplasts have been described as "naked" cells because the cell wall has been removed by either a mechanical or an enzymatic process. In the isolated protoplast the outer plasma membrane is fully exposed.
第7章 原生质体的培养
第7章原生质体的培养和体细胞杂交（3学时）第一节原生质体的分离与纯化第二节原生质体培养第三节原生质体融合本章小结目的要求：(1)了解原生质体培养的意义(2)掌握原生质体分离的大致步骤(3)掌握原生质体培养的方法(4)掌握原生质体融合的方凑第一节原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
原生质体培养方法和再生植株的遗传与变异
压，否则细胞团不会继续生长。待 小愈伤组织长至1 -2mm时，应及时
转移至固体培养基使其进一步生长
4.植株再生
原生质体培养再生的愈伤组织可直接转移到分化培养基，一步成苗 （器官发生）。愈伤组织也可通过体细胞胚发生，先形成胚状体，再 诱导生芽、生根。不同植物种属，其再生方式不同
供体细胞的分化程度：同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，其 生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以提高原生质体的细 胞分裂频率和再生能力，并且可提高实验重复性
柑橘：叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生，只有胚性愈伤 组织来源的原生质体才能再生
起始培养密度与培养基
–起始培养密度：适宜密度为1-5×105/ml –培养基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生 –培养基营养成分完全性：越丰富越好
仙客来原生质体的再生
香蕉原生质体再生—Assani等2006 看护培养
Sugarbeet （糖 甜菜）callus and protoplast regeneration
影响原生质体培养的主要因素
基因型
– 番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析表明，其愈伤组 织再生能力受2个显性基因决定(Koornneef等1987)。Cheng和 Veilleux(1991)对芙薯(S. phureja)原生质体培养能力进行遗传 分析，证明从原生质体培养到形成愈伤组织受2个独立位点的显性 基因控制(Cheng等1991)
• 变异程度的大小与起始材料及培养过程中产生的 变异有关
• 原生质体再生植株变异可为体细胞遗传学研究和 品种改良提供有益的材料
• 从原生质体培养再生植株已选育一些新品种（体细
胞突变育种）
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第7章原生质体的培养和体细胞杂交（3学时）目的要求：(1)了解原生质体培养的意义(2)掌握原生质体分离的大致步骤(3)掌握原生质体培养的方法(4)掌握原生质体融合的方凑第一节原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。
然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。
并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。
此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。
（二）分离方法1.机械分离法1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体.2.酶法分离(1)酶的种类及特点构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。
②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。
③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。
分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
④崩溃酶：一种粗制酶⑤蜗牛酶：主要用于分离小孢子的原生质体。
纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C1，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶Cx，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。
果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。
半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。
此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。
ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶(包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等)，果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。
这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。
日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。
即二步法降解。
(2)酶液的配制①酶的配比及浓度(见表7-1)。
②渗透稳定剂及pH。
植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。
去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。
因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。
因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。
常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40～0.80mol／L。
本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。
其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。
近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。
这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。
酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。
用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5.0时，原生质体产生得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。
当pH 值提高到6.0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。
原始pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。
(3)分离原生质体①两步分离法②一步分离法分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。
采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。
酶处理目前常用的多是"一步法"，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。
每克材料用酶液10～30ml不等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。
例如，游离小麦悬浮细胞的原生质体的酶液中须加入0.55mol／L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加0.4～0.45mol／L的甘露醇，两者差别较大。
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。
去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。
如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。
对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。
对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。
酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。
但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。
酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。
对于这几种酶来说，最佳处理温度在40～50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃左右进行酶解。
若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0.53％次氯酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。
把4g叶组织置于含有200ml不加蔗糖和琼脂的培养基500ml三角瓶中。
在4℃黑暗条件下培养16～24h，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5.6，通常在酶液中使用的等渗剂为0.55～0.6mol甘露醇。
然后，酶液真空渗入叶片组织。
在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。
若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。
取悬浮细胞放人10ml的酶液中(3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5.0～6.0)，在25～33℃条件下酶解24h。
原生质体-酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。
在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。
糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。
盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。
但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。
二、原生质体的纯化和活力测定（一）原生质体的纯化1.离心沉淀法在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。
这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。
此外，还需去掉酶溶液。
以净化原生质体。
原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：（1)将原生质体混合液经筛孔大小为40-100／tm的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
（2)将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。
用吸管谨慎地吸去上清液。
（3)将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外，其他成分和酶液相同)，再次离心，去上清液，如此重复三次。
（4)用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。
一般原生质体的培养密度为104-106／ml。
2.漂浮法应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。
3.界面法选用两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体密度，一种溶液的密度小于原生质体密度。
（二）原生质提活力的测定1.形态识别形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。
2.染色识别在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。
测定原生质体活性有多种方法，如观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯(FDA)染色等。
这些方法各有特点，但现在一般用的是FDA染色法。
FDA本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质体膜。
一旦进入原生质体后，由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荧光，而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。
FDA染色测活性的方法如下：取洗涤过的原生质体悬浮液0.5ml，置于10×100mm的小试管中，加入FDA溶液使其最终浓度为0.01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。