两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定
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印染助剂
19 卷
2 结果与讨论
2. 1 显色剂的选择 本试验选用3 ,5 - 二硝基水杨酸 (DNS) ,在碱性
条件下 ,与还原糖反应 ,生成有色化合物 ,通过分光 光度计进行比色测定 ,确定低分子糖的量.
DNS 黄色试剂在碱性条件下与还原糖共热反应 生成的棕红色氨基化合物3 - 氨基 - 5 - 硝基水杨酸 为比色法的测定基础物.
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第 19 卷第 5 期 2002 年 10 月
印染助剂 TEXTILE AUXILIARIES
Vol . 19 No. 5 Oct. 2002
纤维素酶的滤纸酶活和 CMC 酶活的测定
张瑞萍
(南通工学院 , 江苏南通 226007)
摘 要 : 采用3 ,5 - 二硝基水杨酸 (DNS) 为显色剂 、滤纸或 CMC 为底物 ,测定纤维素酶的滤纸酶活 ( FPA) 和 CMC 酶活 (CMCA) .
作为底物的滤纸结构较为松散 ,可及区较多 ,非 还原性末端也较多 ,容易同时被 endo - 酶和 exo - 酶 降解 ,再由β - 葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖 . 用比色法定量测定还原糖的生成量 ,可反映纤维素 酶的总酶活 FPA. 由于 exo - 酶对纤维素链的专一性 高 ,而 endo - 酶的专一性较低. 在降解羧甲基纤维素 ( CMC) 时 ,主要是反映 endo - 酶的活力.
纤维素酶的检测方法新
纤维素酶的检测方法摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。
关键词：纤维素酶酶活测定葡萄糖回归方程一、纤维素酶及其降解原理纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。
据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。
大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。
所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。
纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。
自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。
目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。
纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。
习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。
C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。
Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。
Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。
Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。
纤维素酶活力测定方法
纤维素酶活力测定方法纤维素酶活力测定方法很多，主要原因是纤维素酶种类繁多、来源很广，不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大，其次纤维素酶作用的底物比较复杂，反应产物不同，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。
近年来随着多种交叉学科的快速发展，生物化学、分子生物学以及基因工程等相关领域的研究，促进了更多更新的纤维素酶活测定以及动力学研究方法的出现。
纤维素酶酶活测定方法——传统检测方法曾报道过传统纤维素酶测定方法很多，如微晶纤维素酶活测定方法、滤纸酶活(FPA)测定方法、水杨什酶活测定方法、、染色纤维素法、滤纸崩溃法、棉线切断法、梭甲基纤维素钠盐(CMC-Na)酶活性测定方法、棉花糖法、CMC粘度降低法、荧光定糖法平板法。
纤维素酶系总的糖化能力的测定常见有三种一是通过测定荧光物质的荧光强度的大小，来计算其还原糖含量的荧光法，其主要是根据还原糖与反应液生成荧光物质。
二是滤纸酶活(FPA)测定法，纤维素酶系总的糖化能力，通过以滤纸为底物经纤维素酶水解后生成的还原糖的量表征，因为滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料。
三是滤纸崩溃法，以滤纸完全崩溃为粉末状所需的时间来表征纤维素酶的活力，在容器内加入缓冲液和适当稀释的酶液，放入一定尺寸的滤纸条，一定温度条件下反复振荡。
外切葡萄糖什酶活力的测定有棉花糖化法方法和微晶纤维素酶活测定方法两种。
两者均采用DNS显色法，通过计算还原糖的量来表征外切葡萄糖什酶活力，主要是利用纤维素酶降解微晶纤维素、棉。
纤维素酶中内切葡萄糖什酶对CMC-Na有降解能力，因此内切葡萄糖什酶活力的表征主要为CMC-Na酶活性测定方法。
用标准葡萄糖溶液作标准曲线，通过DNS 法显色，针对内切葡萄糖什酶与CMC-Na降解生成的葡萄糖等还原糖，以每分钟生成相当于1 I} mol的葡萄糖所需酶量定义为一个酶活性单位，使用分光光度计测其吸光度。
B一葡萄糖什酶活性的测定常用方法有三种:一是将它们衍生为无荧光的底物，因为伞形酮(7一羚基香豆素)与4一甲基伞形酮具有强烈荧光的特点，使用荧光法进行测定;二是Banish和Swiain法，它以水杨什作底物，使释放出来的水杨醇显色(或DNS显色)，酶解产物用4一氨基安替比林作显色剂，再用分光光度法比色测定;三是以对一硝基苯一I}一葡萄糖什为底物进行酶解，底物水解后释放出的配基对硝基苯酚可直接在100}120nm波长范围内测定。
[知识]两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
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检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
四种纤维素酶酶活测定方法的比较
检测分析
食品研究与开发
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［!］ 值为纵坐标， 绘制标准曲线 。 "#$#$#$ 酶活测定方法的比较 配制不同浓度的标准酶液： 用去离子水 "%% &’ 来溶解 "%% &( 纤维素酶 （!"%%% )* ） ， 配制成 " &( + 酶液。测定时分别吸取 ， &’ %#" &’ %#$ &’， %#, &’， %#! &’， %#- &’， %#. &’ 上 述 酶 液 用 水 补 足 至 " &’， 即为不同浓度的酶液。 （/01） 测定方法 "#$#$#$#" 滤纸酶活 滤纸是聚合度和结晶度都居 “中 等 ” 的纤维性 材料， 以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的 量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法， 此方法 应用广泛， 它反映了 三 类 酶 组 分 的 协 同 作 用 ， 统称 滤纸酶活 2/34567 08967 1:53;35< ， /01=。 方法：取 " &’ 酶液加 " &’ %#" &>4 ・ ’?"、 9@ !#. 的醋酸缓冲液， 预热到 -% A， 加入 " 条 "B. :& 新华 滤纸 2-%C" &(=， 沸水浴灭活 -% A 保温 " D。取出， ，冷却至室温，用 试剂显色后稀释 &3E , &’ FGH , 倍， 测 IF 值2-$% E&=。IF 值越大， 说明该菌株的酶 ［"］ 。 活力越强 酶活力计算： 从标准曲线中查出葡萄糖 !&>4 数； 葡萄糖量 酶活力2J + &’=K
两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法纤维素是一种多糖，由若干葡萄糖分子通过β-1，4-糖苷键连接形成，具有结构特殊，难于降解的特点。
纤维素酶是能够降解纤维素的酶，广泛存在于微生物、植物和动物体内。
测定纤维素酶活力的方法因纤维素酶的种类及应用领域不同而有所区别，常用的方法包括酚-硫酸法、精胱酸法、流变法、荧光法等。
下面将介绍其中几种常用的方法。
一、酚-硫酸法酚-硫酸法是用于测定纤维素酶活力的经典方法之一、其原理是：纤维素酶通过水解纤维素生成还原糖，而还原糖可以与试剂酚和硫酸反应产生可测定的颜色。
具体步骤如下：1.准备试剂：将1%酚（重量/体积）和10%硫酸（体积/体积）混合，剧烈振荡。
2.取一个容量瓶，加入待测纤维素酶样品、适量的底物纤维素和适量的缓冲液（常用pH5.0的酸性缓冲液）。
3.进行恒温反应：将试剂和底物溶液在适当的温度下进行恒温反应。
4.终止反应：在特定的时间点，取出反应溶液，加入刚刚准备好的酚-硫酸试剂，充分混匀。
5.酚-硫酸试剂与还原糖反应产生胶体，表现为紫褐色。
通过比色计或分光光度计测定产生的胶体的吸光度，根据标准曲线或已知纤维素酶活力的对照样品，计算出待测样品的纤维素酶活力。
二、精胱酸法精胱酸法是另一种常用的测定纤维素酶活力的方法。
其原理是：纤维素酶通过水解纤维素生成还原糖，而还原糖可以与精胱酸反应产生尿糖胺，尿糖胺与酚胺反应形成可测定的色素。
具体步骤如下：1.准备试剂：将精胱酸磷酸缓冲液（常用pH4.8）和4-氨基安替比林（ABTS）或3,3'-二氮杂联苯基过氧化物（DPPH）溶液混合，剧烈振荡。
2.取一个容量瓶，加入待测纤维素酶样品、适量的底物纤维素和适量的缓冲液。
3.进行恒温反应：将试剂和底物溶液在适当的温度下进行恒温反应。
4.终止反应：在特定的时间点，取出反应溶液，加入刚刚准备好的精胱酸试剂，充分混匀。
5.精胱酸试剂与还原糖反应产生色素，根据色素的吸光度，通过分光光度计测定产生的色素的吸光度，根据标准曲线或已知纤维素酶活力的对照样品，计算出待测样品的纤维素酶活力。
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检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)
滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)
1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：
滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：
①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；
②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；
③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；
④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；
⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：
X=（WxNxlOOO）／（TxM）
X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法
标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
5、3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂
称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml 水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。
纤维素酶活力的测定——CMC糖化力法
1、定义：1毫升液体酶（或1克固体酶粉），在40℃pH﹦4.6条件下，每分钟水解羧甲基
纤维素钠（CMC-Na），产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g（u/ml）表示。
2、原理：
CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖，还原糖能将3，5﹣二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光度值A，吸光度与酶活成正比。
CMC-Na糖化力主要代表内切β-1.4-葡聚糖的活力。
3、试剂：
3.1 0.1mol/LpH﹦
4.6醋酸﹣醋酸钠缓冲溶液：将49.0ml0.2mol/L醋酸钠溶液和
51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸馏水。
注意：0.2mol／L醋酸钠溶液：称取27.22g结晶乙酸钠（AR）定容至1000ml。
0.2mol／L醋酸溶液：称取冰乙酸（AR）11.5ml定容至1000ml。
3.2 3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入
21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0
克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。
3.3 葡萄糖标准溶液（1.0mg /ml）：称取1.000克葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用
蒸馏水溶解后定容至1000ml，冰箱保存备用。
3.4 羧甲基纤维素钠溶液：称2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸馏水中，加醋酸缓冲溶液
100 ml,混匀后存于冰箱内备用。
配后隔天使用。
4、分析步骤：
4.1标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、
0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混
匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
4.2 待测酶液制备：准确称取酶粉1.0克置研钵中，加入pH4.6的醋酸缓冲溶液少量溶解，
研细，将上清液小心倾入25ml刻度试管中，沉渣再加入少量缓冲液,如此捣研3-4次，最后全部移入试管中并定容至25ml，摇匀，过滤，滤液待测。
4.3 测定：取1.5mlCMC-Na溶液与0.5ml适当稀释的酶液于25ml试管中，40℃水浴保温
30min后立即加1.5mlDNS显色剂，沸水浴煮沸5min，取出立即冷却，用水定容25ml，在540nm测吸光度As。
空白样：先加1.5mlDNS试剂，后加0.5ml待测酶液，与1.5mlCMC-Na溶液，于25ml试管中，沸水浴煮沸5min，冷却后用水定容25ml，在540nm测吸光度Ack。
⊿A＝As－Ack 根据⊿A从标准曲线上查得葡萄糖含量P。
5.4 计算
酶活力（u/g）=P*K*1000/0.5*30 k：稀释倍数。
吸光度0 0.084 0.240 0.537 0.789 1.055 浓度mg/ml 0 0.125 0.25 0.5 0.75 1。