两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活

检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)

滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。

采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)

1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。

2、采用的滤纸酶活单位定义：

滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。

3、滤纸酶活力(FPA)的测定：

①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；

②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；

③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；

④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；

⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。

滤纸酶活按下面公式计算：

X=（WxNxlOOO）／（TxM）

X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。

W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。

N：为酶液稀释总倍数。

T：为反应时间。

M：为样品的体积。

4、葡萄糖标准曲线绘制方法

标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。

5、3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂

称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml 水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。

纤维素酶活力的测定——CMC糖化力法

1、定义：1毫升液体酶（或1克固体酶粉），在40℃pH﹦4.6条件下，每分钟水解羧甲基

纤维素钠（CMC-Na），产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g（u/ml）表示。

2、原理：

CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖，还原糖能将3，5﹣二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光度值A，吸光度与酶活成正比。CMC-Na糖化力主要代表内切β-1.4-葡聚糖的活力。

3、试剂：

3.1 0.1mol/LpH﹦

4.6醋酸﹣醋酸钠缓冲溶液：将49.0ml0.2mol/L醋酸钠溶液和

51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸馏水。

注意：0.2mol／L醋酸钠溶液：称取27.22g结晶乙酸钠（AR）定容至1000ml。

0.2mol／L醋酸溶液：称取冰乙酸（AR）11.5ml定容至1000ml。

3.2 3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入

21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0

克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。

3.3 葡萄糖标准溶液（1.0mg /ml）：称取1.000克葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用

蒸馏水溶解后定容至1000ml，冰箱保存备用。

3.4 羧甲基纤维素钠溶液：称2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸馏水中，加醋酸缓冲溶液

100 ml,混匀后存于冰箱内备用。配后隔天使用。

4、分析步骤：

4.1标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、

0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混

匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。

4.2 待测酶液制备：准确称取酶粉1.0克置研钵中，加入pH4.6的醋酸缓冲溶液少量溶解，

研细，将上清液小心倾入25ml刻度试管中，沉渣再加入少量缓冲液,如此捣研3-4次，最后全部移入试管中并定容至25ml，摇匀，过滤，滤液待测。

4.3 测定：取1.5mlCMC-Na溶液与0.5ml适当稀释的酶液于25ml试管中，40℃水浴保温

30min后立即加1.5mlDNS显色剂，沸水浴煮沸5min，取出立即冷却，用水定容25ml，在540nm测吸光度As。

空白样：先加1.5mlDNS试剂，后加0.5ml待测酶液，与1.5mlCMC-Na溶液，于25ml试管中，沸水浴煮沸5min，冷却后用水定容25ml，在540nm测吸光度Ack。

⊿A＝As－Ack 根据⊿A从标准曲线上查得葡萄糖含量P。

5.4 计算

酶活力（u/g）=P*K*1000/0.5*30 k：稀释倍数。