枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
枯草芽孢杆菌试验方案
枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案一、材料准备（1）实验仪器培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪（2）实验试剂NA培养基：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105（3）培养基配方牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。
二、实验步骤（1）制备菌液称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①；用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧;（2）进行涂板向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记；每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次；将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。
（3）菌落计数以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数：当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数；若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。
若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数；若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
活菌数的测定方法
活菌数的测定方法
一、直接计数法：
1.显微镜计数法：将样品通过适当稀释后涂布在平板上，然后在显微
镜下直接观察，将显示出的活菌数量进行计数。
2.罗氏计数室法：将适当稀释后的样品放在罗氏计数室中，通过显微
镜下观察菌落数并计数，然后根据稀释倍数计算活菌数。
3.涂布法：将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上，在适宜温度下培
养一段时间，然后观察并计算菌落的数量。
二、间接计数法：
1.白细胞计数法：用白细胞计数板进行白细胞计数，由于白细胞数与
活菌数有一定的相关性，可以通过白细胞计数的结果进行推算。
2.生物标志物法：通过检测样品中特定的生物标志物，如ATP、葡萄
糖等，间接反映出活菌的数量。
3.代谢产物测定法：通过测定样品中的代谢产物（如氧气消耗量、二
氧化碳产生量等），间接推测出活菌的数量。
以上是常见的活菌数测定方法，不同的方法适用于不同的实际应用场景。
在选择测定方法时，需要考虑样品类型、检测目的、测定时间和精确
度等因素。
另外，为了提高测定结果的准确性，还需要严格控制实验条件，如温度、湿度、培养时间等。
最后，需要注意的是，活菌数的测定方法只能提供大致数量，无法直
接得到准确的数值。
因此，在进行活菌数测定时，需要结合其他的检测方
法和数据进行综合分析。
科诺枯草芽孢检测方法
科诺1000亿枯草活芽孢检测方法1.1 鉴别试验根据菌株的生理生化特征，并结合个体形态和群体形态特征，参照《微生物分类学》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对菌株进行鉴定。
见资料性附录A。
1.2 1.0×1011活芽胞/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂芽胞数的测定1.3 枯草芽孢杆菌原药芽孢数的测定1.3.1 方法提要本孢子浓度法用来计算每克枯草芽孢杆菌原药的活芽孢数量。
1.3.2 试剂和溶液稀释液: 氯化钠18g，吐温80 2mL，蒸馏水2000mL，加热充分溶解后分装到5个500mL的三角瓶中，灭菌备用。
营养琼脂培养基与培养皿的制备：蛋白胨：10g，酵母浸粉：5g，NaCl：10g，琼脂粉：15g，蒸馏水1000mL,pH值：7.0-7.2。
灭菌后倒培养皿，备用。
1.3.3 仪器、设备警示:所有器皿必须洁净、无菌；不得使用矿质化的玻璃器皿；移液器具用前需校正。
分析天平：精度0.1mg；立式圆形压力蒸气灭菌锅；恒温培养箱；水浴锅:0-100℃；磁力搅拌器；超声波水浴器；旋涡混合器；中性瓶:250mL；试管: 18×150 mm；刻度量筒: 100 mL；移液枪：100 uL、1000 uL；移液枪头：100 uL、1000 uL；玻璃涂棒；培养皿: 90mm。
1.3.4 测定步骤1.3.4.1 样品的预处理每个样品重复检测3次。
a) 称取0.99～1.0lg(准确至0.0002g)的试样于250mL中性瓶中。
b) 再准确量取100mL稀释液倒入中性瓶中,然后把250mL中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min，之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。
c) 将已混合好试样的250ml中性瓶放入超声水浴器中（水浴器的水平面必须等同于试样液面，中性瓶应放在超声波振源处），共超声15min（7min时停止，猛烈摇动试样瓶，然后再超声8min）。
d) 在超声之后，再次用磁力搅拌混合60min。
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测是确保饲料添加剂的质量和安全性的重要环节。
以下是一种常用的检测方法：
1.样品准备：从混合型饲料添加剂中取得适当的样品量，确
保样品代表性。
将样品进行适当处理，如研磨或稀释等，以便后续的分析操作。
2.菌落计数：使用枯草芽孢杆菌特异性培养基（如PYG，
Plate Count Agar等），将样品接种于培养基表面，利用平板计数法进行枯草芽孢杆菌的菌落计数。
3.PCR检测：使用枯草芽孢杆菌的特异性引物和探针进行
PCR（聚合酶链式反应）检测，通过扩增枯草芽孢杆菌的DNA片段来确认其存在。
4.实时荧光定量PCR：使用荧光探针和枯草芽孢杆菌特异性
引物进行实时荧光定量PCR（qPCR），检测和定量枯草芽孢杆菌的DNA，同时可以根据标准曲线计算样品中的枯草芽孢杆菌数量。
5.基因测序：对样品进行基因测序，通过分析样品的DNA
序列来确认枯草芽孢杆菌的存在和鉴定特定菌株的种属。
需要注意的是，枯草芽孢杆菌的检测方法可以根据实际需要进行选择，并结合相关标准和法规要求。
同时，实验室应该有足够的设备和技术来执行这些检测方法，并参考相关的操作指南和质量控制要求，以确保检测的准确性和可靠性。
枯草芽孢杆菌活菌计数方法
枯草芽孢杆菌活菌计数法
1.实验器材
培养箱,超净台,灭菌锅
90mm培养皿,玻璃涂布棒,三角瓶,5ml、1ml、100μl移液枪及枪头,试管架,
试管,无菌水(器具耗材均需提前高温高压灭菌)。
2.实验方法
1)配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨1%
牛肉膏0.3%
氯化钠0.5%
葡萄糖1%
琼脂2%
121℃高压灭菌20分钟。
2)接种
a)将已灭菌的营养琼脂培养基倒入已干灭好的培养皿中,约25mL/90mm培养皿,待凝固后备用。
b)以准确称取检样0.1g(或1.00mL)放入含有100mL无菌水的玻璃三角瓶中,
充分溶解,即配制成1:1000的稀释液。
c)取0.1mL 1:1000的稀释液注入含有9.9mL无菌水离心管中,涡旋混匀,此为10-5的稀释液。
d)按上述操作顺序做10倍递增稀释液,每稀释一次,换用一个1mL无菌吸头,根据对样品菌落生长情况的预实验,选择合适的稀释
度,最终选择10-7,10-8,10-9 三个稀释梯度。
e)吸取0.25mL稀释液于营养琼脂平板上,用涂布器将菌液涂布均匀,每个稀释度做3个平皿,倒置于30℃恒温培养箱中,培养24h 后取出,计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
3 计数
计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
菌种测定方法
附录 A（规范性附录）枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的计数和杂菌率的测定A.1 原理每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应样品的单位活菌数。
A.2 培养基除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的三级水或相当纯度的水。
按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。
A.2.1 枯草芽孢杆菌培养基A.2.1.1 成分营养琼脂 33g；蒸馏水 1000mL。
A.2.1.2 制法将33g营养琼脂溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。
A.2.2 酿酒酵母菌培养基A.2.2.1 成分孟加拉红培养基 36.6g；蒸馏水 1000mL。
A.2.2.2 制法将36.6g孟加拉红培养基溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121℃灭菌20min。
A.2.3 植物乳杆菌培养基A.2.3.1 成分蛋白胨 10g；牛肉膏 10g；酵母提取物 5g；磷酸氢二钾 2g；柠檬酸三铵 2g；乙酸钠 5g；葡萄糖 20g；吐温-80 1mL；七水硫酸镁 0.58g；四水硫酸锰 0.25g；琼脂粉 20g；灭菌碳酸钙 3g；蒸馏水 1000mL。
A.2.3.2 制法将上述试剂依次溶解于蒸馏水中，七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中，最后加入琼脂粉，定容至1000mL；121℃灭菌20min。
A.2.4 麦康凯培养基A.2.4.1 成分蛋白胨 17g；脙胨 3g；猪胆盐（或牛、羊胆盐） 5g；氯化钠 5g；琼脂 17g；蒸馏水 1000mL；0.01%结晶紫水溶液 10mL；0.5%中性红水溶液 5mL。
A.2.4.2 制法A.将蛋白胨、脙胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。
将琼脂加入600mL蒸馏水中，加热溶解。
将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。
一种枯草芽孢杆菌的计数方法
一种枯草芽孢杆菌的计数方法说实话一种枯草芽孢杆菌的计数方法这事，我一开始也是瞎摸索。
我试过好多办法呢。
最开始我想直接用显微镜去数，想着就一个个把那些菌给找出来数清楚。
哎呀，这可麻烦大了。
你知道不，那些枯草芽孢杆菌小小的，看起来都密密麻麻的，而且在显微镜下有时候还会动来动去，我数着数着就晕头转向了，根本拿不准到底数了多少，这个方法失败得一塌糊涂。
后来啊，我又想利用它在培养基上生长形成菌落这个特性来计数。
我就把含有枯草芽孢杆菌的液体样品取了一些，稀释了好多好多倍。
就好比把一碗很浓的粥，兑上好多好多水，变成稀稀的，这样每个细菌就有足够的空间能在培养基上长出自己独立的菌落，不至于都挤在一起分不开。
然后呢，我就小心翼翼地把这个稀释后的样品涂到平板培养基上。
这涂的时候也得小心，就像画画的时候涂颜料，如果涂得不均匀，那长出来的菌落有的地方多有的地方少，计数肯定就不准了。
我把平板放到合适的温度下让它长菌落。
等它长好之后，这又是个麻烦事。
有一些菌落长得奇奇怪怪的，我都不确定那是不是枯草芽孢杆菌的菌落。
这就让我明白啊，要对枯草芽孢杆菌的菌落特征要特别特别熟悉才行。
那怎么熟悉呢？我就专门找了很多标准的图案，自己还分离培养了一堆确定的枯草芽孢杆菌，仔细观察它的菌落大小啊、颜色啊、形状啊这些。
再去数菌落的时候，我还是不敢大意。
我会从左上角开始，然后一行一行地数，这样就能保证不会多数或者少数。
数完之后，因为之前有稀释倍数，还得计算回来，这简单的乘法和除法我都检查了好几遍。
不过呢，我还是有点不确定这个数据到底精准不精准。
毕竟之前在培养的过程啊，稀释的时候可能都有点小误差。
可是就目前来看，这个基于菌落的计数方法，已经是我能想到和做到比较可行的了。
我还听说有一种仪器可以自动计数，但我还没有设备去尝试呢，要是有条件可得试试。
不过当下，就是这种靠显微镜和培养菌落的方法，能多仔细就多仔细，可能就能得到相对准确的枯草芽孢杆菌计数了。
QBHHS JC009-2013 枯草芽孢杆菌活菌计数办法
1检测方法
平板菌落计数法
2
准备材料2.1普通肉汤培养基：试剂名称
添加数量试剂名称添加数量蛋白胨
10克琼脂15g 牛肉膏
5克蒸馏水1000毫升
NaCl 5克配好后高压灭菌倒平板，37℃培养箱置16h（无菌检查），备用。
2.2
0.05％的琼脂生理盐水，高压灭菌2.3
1ml 枪头，高压灭菌2.4
0.2ml 枪头，高压灭菌2.5灭菌的试管
3
试验步骤3.1
向各灭菌试管中加入4.5ml 琼脂生理盐水，每个样品准备至少7支试管；3.2无菌称取0.5g 混匀的新鲜样品，加入到第1支试管，充分混匀后，吸取0.5ml 至第2支试管，同样处理，直到第后一管；
注意：每支试管一定要充分混匀，这是试验成功与否的关键！
3.3分别从最后3管用移液器吸出20μl，再分别滴种到普通肉汤培养基上，每个梯度做三个重复；
注意：一定要从后向前做！
3.4将滴好的平板正置放置30min，使其充分干燥后，再将其拿出置37℃培养箱好氧培养约12h，即可观察结果；
4计数
培养结束后，取出平板，计数每个平板每滴的细菌数量，计算三个重复的平均数，再乘以相应的稀释倍数，即得原样品中的活菌数。
检测技术规范与标准方法
编号：QB/HHS JC009-2013修订：第1版第1次修改枯草芽孢杆菌活菌计数方法起草：赵丽霞
审核：刘永垒
批准：
执行日期：2013年6月15日。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
Newly compiled on November 23, 2020
目的：建立枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程
范围：本方法适用于的枯草芽孢杆菌活芽孢的测定
责任人：
内容：
1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管
2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：
菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入90ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动60min，即成母液的菌悬液。
用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
向每个灭菌培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。
用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液，加至已凝固好的培养基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37℃的恒温培养箱内培养
18h—24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数：
以平板上出现20个——200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
若有两个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，应按两者菌落数之比值来决定。
6、结果统计与计算
根据菌落数特征判定，分别数出平板中的枯草芽孢杆菌菌数及杂菌数（杂菌是指除枯草芽孢杆菌外的其他菌种）。
统计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数（B）和杂菌数（E）。
有效活菌总数按式（1）计算；
A=10×B×C×5 (1)
式中：
A——有效活菌总数，cfu/g
B——菌落活菌数；
C——稀释倍数。
杂菌率按式（2）计算：
式中：
D——杂菌率，%
E——杂菌数。