RT-PCR实验心得
PCR学习心得（优秀范文六篇）
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第一篇：实习学习心得作为一名即将奔赴教师岗位的大学生，学习科学发展观，更要结合自身实际情况，要认真贯彻执行胡同志提出的：发展要有新思路，改革要有新突破，开放要有新局面，各项工作要有新举措，顶岗实习教师科学发展观学习心得。
我们要把学习践行科学发展观与执教工作结合起来；与谋划好今后与学生交往结合起来；着力提升我们的教师职业道德水平和专业素质。
实践已经充分证明，当代教育需要新的理念新的方式，教学改革的口号也越喊越响亮，这就更需要我们这些即将从事教师职业的顶岗实习生充分利用好实习这个锻炼的机会，以新的理念新的方式来组织教学，提高自己的教学能力，同时锻炼自己管理学生的实践能力，心得体会《顶岗实习教师科学发展观学习心得》。
通过近期的学习，我对科学发展观理论有了进一步的理解，我明白了科学发展观无处不在，无处不可以应用。
从人类个人、国家，乃至整个世界；从经济、政治到环境保护等等。
我们应该从现在起就将科学发展观应用于我们实习教师的学习、生活、思想、工作上，在实习工作中以科学的理念来完善自己的各项能力。
我更加深刻感受到这次学习实践活动的意义，明白更多认识问题、解决事情的方法，凡事要全面地协调地去看待问题。
第二篇：实习学习心得第一天，进入焊接实验室之前，老师简要地给我们讲解了一下实训的要求，让我们对收音机有一个大概的了解，在进行实训的时候心中更加有数。
在实训前，老师给我们发下了中夏S66E六管超外差式收音机实验套件。
接下来几天我们的工作就是将这套套件安装成一个合格的收音机了。
我们每个人拆开套件之后对照元件清单仔细检查了各个元件有无缺失，损坏。
在进行焊接元件之前，我们用废弃的电路摸板练习，掌握烙笔的用法。
刚刚开始自己练习的时候，我们的焊点可谓“抽不忍赌”，有的同学甚至在焊接的时候会出现手颤抖的现象。
RT-PCR的操做经验分享
RT-PCR的操做经验分享在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。
因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。
这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RN A酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
RT-PCR经验浅谈
RT-PCR经验浅谈Hxwuchina做RNA病毒基因的RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备。
本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增，设计方案是将全基因组分成7个片段，0.6kb-3.3kb不等，分别进行RT-PCR扩增，刚开始的三个月，我们课题组三个人辛辛苦苦，什么招都想过了，结果连一个片段都没有拿到。
后来有一个周末，我一个人安安静静做了一天，PCR跑胶的结果足以让我兴奋一个月：一下子隐隐约约出了3个片段！！！紧接着把胶里的弱带切下，水溶并后做二次扩增(注：跑胶总会吧，在UV下，参照marker，将特异性高，且与预期大小相同的DNA带切出，放在一个ep管里，加入适量无菌水，用枪头将胶反复搅碎，高速离心，小心吸取2ul上清用作模板，进行第二次PCR扩增)很快，三个预期的片段都得到了理想的扩增。
不到一个月，12kb的全基因组各片段全部收归囊下。
我这次成功的关键在于：提取RNA时，收集沉淀这一步。
离心速度不要低于13000rpm （r=5cm），提高离心速度、延长离心时间，在离心前的沉淀也尽可能在低温下长时间进行，这些时我本人总结出来的经验。
在后来的实验中，几乎每次RT-PCR都非常顺利，除了材料本身就没有目标基因。
这一次谈一下逆转录酶和逆转录反应的问题，在一般的逆转录反应中，较常用的是MMLV（鼠源的）和AMV（禽源的）两种，现在更有各家公司推出的耐热的（50-60度）、超长片段的逆转录酶，这方面具有专长的数gibco（现在并购于invitrogen）。
我们实验室使用的一般是MMLV，鼠源的酶，虽然活性比较低一点，但是对应的RNaseH 活性也很低，在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。
对于从细胞培养物中利用RT-PCR方法扩增mRNA丰度低的基因也很有效。
但是AMV也有其自身的优点，酶的活性很高，扩增1kb以下的基因时比较常用，我知道临床上血液检测中有时使用AMV，省时，也省试剂。
半定量RT-PCR试验心得
1、抽提出高质量的RNA。
要求：实验器材和用品做好抑制RNA 酶
准备；操作过程中避免RNA酶污染；提取的组织细胞样品不能太多（可能裂解不充分等）。
2、选用高质量的RT酶。
女口Promega Invitrogen公司等。
3、引物设计正确。
尤其注意动物种属、至少包含1个内含子、参
考文献的质量等。
4、P CR扩增中循环次数恰当。
过少的循环次数条带出不来，过高的
循环次数条带太亮看不出差异（达到平台期后也不准确）。
5、M g2+浓度和Taq酶含量适度。
过高容易引起非特异性条带。
6、建议在RT逆转录前可以对样品进行DNA酶处理，以纯化提取
的样品RNA。
7、图像定量分析时尽量选择浅条带，太亮的条带不可靠。
我在做半定量Rt-Pcr如下图。
跑出来发现平行样的亮度差异颇大。
实验设计：
共有4个cDNA的样本,分别命名为A,B,C,D，检测其中某基因表达的差异。
为了准确每个样本设3个平行样，也就是说A1, A2 ,A3均是从同一管（A管）取等量的（3UL）cDNA，加入同样的反应系统（先配好反应系统再分装到各per管中），用同一次per反应跑出来的。
发现平行样的亮度差异颇大。
尤其是A和C系列，几乎相差两倍。
请问各位大侠，PCR中平行样的误差真有这么大吗？？还是我的操
作有问题？？
请各位大侠帮忙
我用的是50ul的反映系统，条件是：94 C 30秒，55 C 60秒, 72 °C 60 秒。
25次循环。
RT-PCR实验方法总结大全
RT-PCR实验方法总结大全第一篇：RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE 我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
RT-PCR实验报告
逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
pcr个人小结
pcr个人小结PCR个人小结PCR（聚合酶链反应）是一种重要的生物技术手段，广泛应用于分子生物学、医学诊断和基因工程等领域。
通过PCR可以在短时间内扩增目标DNA片段，具有高度敏感性和特异性的优点。
在我的学习和实践中，我深切体会到了PCR的重要性和应用价值。
PCR技术可以应用于基因检测和诊断。
在医学领域，PCR可以用于检测疾病相关基因的突变，如遗传性疾病、感染病原体等。
通过PCR扩增目标基因片段后，可以进行序列分析和基因突变检测，从而准确判断患者是否携带致病基因，并进行个体化的治疗和预防措施。
此外，PCR还可以用于人类DNA指纹鉴定，用于刑侦和亲子鉴定等领域。
PCR技术在分子生物学研究中具有重要作用。
PCR可以快速、高效地扩增DNA片段，为后续的克隆、测序和基因表达研究提供了可靠的基础。
在基因工程中，PCR被广泛应用于基因克隆、基因组重组、建库和突变体构建等方面。
通过PCR扩增的基因片段可以进行限制性酶切、连接、转化等操作，从而实现对目标基因的操作和研究。
PCR技术还可以应用于环境监测和食品安全检测等领域。
在环境科学研究中，PCR可以用于快速检测环境中的微生物和生物多样性，从而了解环境中的微生物组成和功能。
在食品安全领域，PCR可以用于检测食品中的致病菌、转基因成分和食品伪造等问题，保障公众健康和食品安全。
在实践中，我发现PCR技术的成功与否受到多个因素的影响。
首先是反应体系的设计，包括引物的设计和浓度、模板DNA的纯度和浓度、引物和模板的配对、反应缓冲液和酶的选择等。
合理设计反应体系可以提高PCR的特异性和效率，避免非特异性扩增和非特异性产物的产生。
其次是PCR条件的优化，包括反应温度、环境条件和反应时间等。
适当调整PCR条件可以提高PCR反应的效率和特异性，避免产物污染和非特异性扩增。
此外，实验操作的技巧和严谨性也是PCR成功的关键，包括引物和模板的添加、PCR管的密封和反应体系的准备等。
总结来说，PCR是一项重要的分子生物学技术，具有广泛的应用前景和研究价值。
RT-PCR实验心得
RT-PCR实验心得■提取RNA(我做细胞的)1.取中号培养瓶(100ml培养瓶注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次，弃尽PBS后加2mlTRIzo l（量大无防！）,细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个1.5EP管中.2.颠倒摇晃10下，室温5分钟.3.在2个EP管中各加入0.2 ml氯仿。
盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。
4.在2—8°C下用不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。
离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。
5.用移液枪分别转上层水相（约500-600μl）于另二个1.5mlEP管中,加等体积异丙醇（约500-600μl），混匀室温10分钟来沉淀RN A→在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。
注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
6.舍弃上清,用75%的乙醇(用DEPC水处理的,临时十分钟配,预冷保存于4°C或-20°C) 1 ml来洗涤RNA沉淀→在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。
;离心前注意放管的方向,注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年!7 弃上清，置于卫生纸上，自然晾干（不能完全干燥）,用20-50μl DEPC水溶解。
(建议装于0.6的EP管中.)8紫外光度检测注:该步后,可保存于-70℃超低温冰箱,或算好计量建立体系立即用于逆转录.■ RT反应体系注意事项1.RT试剂盒中试剂解冻后,摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在冰上操作.2 PCR仪预热到50°C,在放PCR管于PCR仪上(之前在冰上!)开始逆转录.3反应体系准备:比原体系大10%;建立25ul的反应体系;先按总反应体系混合总体体系反应物,在分装于PCR管中(分装前宜离心!),再分别加 RNA和引物/内参;4 RNA的量宜大2ug/reaction!5 要有要有逆转录(50℃,30min)和初始热活化(95℃, 15 min);反应体系要搞清!//(-)5'-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3'扩增片段长度为407bpGAPDH条件为预变性94℃ 3 min，94℃ 40 s、59度40 s、72度1 min 7个循环，94℃ 40 s、56度40 s、72度1 min 25个循环，72℃延伸5 min。
半定量RT-PCR试验心得
半定量RT-PCR小结（一）试验原理半定量PCR是用于确定目的基因mRNA表达的量，通常以一个管家基因作为参照，传统的方法是将RNA逆转录获得cDNA，然后使用等量的cDNA作为PCR模板，用特异引物进行扩增得到目的基因和管家基因的片段，由于不同组织或细胞等来源的目的基因表达量不同，在同一个PCR体系条件下扩增得到的产物不同，而管家基因的表达则相同（理论上，实际可能在不同组织，细胞周期或者外界因素如药物处理后也会有差异），然后使用灰度扫描软件（如Totallab 或Bandscan）对目的基因的扩增条带进行灰度扫描，得到各条带的灰度，经过内参矫正后，得到一个相对值。
用凝胶成像系统自带的分析软件分析目的条带和内参照的平均密度值，也称为灰度值。
用目的条带的平均密度值除以内参照的平均密度值，即所需要的RATIO，看density 与area 的乘积。
而两个基因可以进行同管扩增，有时无法同管扩增，则分管扩增。
同一次实验中，这个相对值理论上与其对应RNA的量成正比。
这个方法是比较粗糙的，结果也受多方面的影响，可信度并不高。
如果有条件的话建议做Northern blot 或Realtime PCR。
首先要保证PCR过程处在它对数期，第二要保证每管扩增的效率相同，第三电泳点样、凝胶成像的分辨率等等。
与经典的检测基因的表达方法如Northern 印迹、RNase 保护分析、原位杂交及S1 核酸酶分析等相比,半定量RT-PCR 法具有灵敏度高(比杂交法高1 000～10 000 倍) 、专一性好、快速简便、所需样品量少及耗费较低等诸多优点。
然而,已有的研究表明,由于用半定量RT-PCR 法分析基因表达水平的影响因素较多,导致该法目前只能用于粗略比较样品间的基因表达水平。
（二）试验步骤<1>总RNA抽提总RNA提取时，根据大鼠发育时期及总RNA量，研磨小脑组织加入适量Sol D；总RNA沉淀过夜后，用适量Sol D重悬并加入等体积异丙醇保存于-80度；<2>模板cDNA制备取出总RNA用于制备cDNA时，可以根据EP管内沉淀量判断总RNA量的多寡，视反应需要沉淀适合体积总RNA，如果沉淀量较多，一般吸取100 ul其内即含数ug 总RNA即可进行一两个反转录反应；多余的总RNA重悬加入适量Sol D重悬并加入等体积异丙醇保存于-80度；注：RT反应体系为Takara公司推荐体系，本次RT-PCR试验中，由于天气热/冰箱有点问题、试剂盒用了许久，造成其中的dNTP、酶、oligoDT降解严重，以至于严重地影响试验进行；王老师让我将dNTP、酶、oligoDT的反应量均增加为原来的1.5倍；这样使总RNA 能更充分地用于反转录为cDNA。
RTPCR实验方法总结大全
RTPCR实验方法总结大全.docRT-PCR实验方法总结大全引言逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）是一种分子生物学技术，它结合了逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）和聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）两种方法，用于从RNA模板中合成cDNA并进行扩增。
RT-PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、克隆和基因功能研究等领域。
实验原理逆转录: 逆转录酶将RNA模板转录成cDNA。
PCR扩增: 利用特定的引物对cDNA进行特异性扩增。
实验流程1. 样本准备收集样本，如细胞、组织或血液。
提取RNA，确保纯度和完整性。
2. 逆转录设计并合成特异性的逆转录引物。
将RNA与逆转录引物混合，加入逆转录酶。
在特定温度下进行逆转录反应。
3. PCR扩增设计并合成特异性的PCR引物。
将cDNA与PCR引物、聚合酶、dNTPs等反应体系混合。
进行PCR循环，包括变性、退火和延伸。
4. 结果分析通过凝胶电泳或实时定量PCR（qPCR）分析PCR产物。
根据条带大小或荧光信号判断扩增效果。
实验关键点引物设计引物应具有特异性，避免非特异性扩增。
引物长度通常为18-25个核苷酸。
避免引物二聚体和发夹结构。
逆转录酶的选择选择高保真度和高效率的逆转录酶。
考虑逆转录酶的热稳定性。
反应条件优化优化逆转录和PCR反应的温度、时间和循环次数。
调整反应体系中的Mg2+浓度。
避免污染使用无菌技术操作。
使用负对照和正对照验证实验结果。
数据分析使用适当的软件分析qPCR数据。
通过凝胶电泳分析PCR产物的特异性。
常见问题与解决方案1. 非特异性扩增优化引物设计。
调整Mg2+浓度。
减少循环次数。
2. 低效率逆转录检查RNA质量和完整性。
更换逆转录酶。
3. PCR产物不清晰优化PCR条件。
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RT-PCR实验心得
■提取RNA(我做细胞的)
1.取中号培养瓶(100ml培养瓶注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次，弃尽PBS后加2mlTRIzol（量大无防！）, 细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个管中.
2.颠倒摇晃10下，室温5分钟.
3.在2个EP管中各加入ml氯仿。
盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。
4.在2—8°C下用不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。
离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。
5.用移液枪分别转上层水相（约500-600μl）于另二个管中,加等体积异丙醇（约500-600μl），混匀室温10分钟来沉淀RNA→在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。
注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
6.舍弃上清,用75%的乙醇(用DEPC水处理的,临时十分钟配,预冷保存于4°C或-20°C) 1 ml来洗涤RNA沉淀→在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。
;离心前注意放管的方向,
注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年!
7 弃上清，置于卫生纸上，自然晾干（不能完全干燥）,用20-50μl DEPC水溶解。
(建议装于的EP管中.)
8紫外光度检测
注:该步后,可保存于-70℃超低温冰箱,或算好计量建立体系立即用于逆转录.
■RT反应体系注意事项
试剂盒中试剂解冻后, 摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在冰上操作.
2 PCR仪预热到50°C,在放PCR管于PCR仪上(之前在冰上!)开始逆转录.
3反应体系准备:比原体系大10%;建立25ul的反应体系;先按总反应体系混合总体体系反应物,在分装于PCR管中(分装前宜离心!),再分别加RNA和引物/内参;
4 RNA的量宜大2ug/reaction!
5 要有要有逆转录(50℃,30min)和初始热活化(95℃, 15 min);
反应体系要搞清!
2、6×缓冲液上样缓冲液(4℃保存)
■% / %:琼脂糖凝胶的配制及用法:
找干净的容积大约为100ml的瓶子,加琼脂糖再加50ml电泳缓冲液(或:琼脂糖+100ml电泳缓冲液)，微波炉中火60秒至沸腾，取出,熔化的琼脂物冷却,用1ml 的移液枪,取琼脂糖凝胶封底后将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
(注意:加槽的注意事项(平行放;滴/泡沾缓冲液);取槽时的注意事项; 先取出凝胶盒,放侧板和梳子,在封底凝固后,到入凝胶,跑电泳时在取梳和侧板,此时凝胶和电泳液相混!注意不要有气泡! )
■PCR产物电泳
取目的基因RT-PCR产物各10μl及内参RT-PCR产物各5μl加已点在纸上的(只要干净即可!)溴酸兰(即6×缓冲液上样缓冲液)量大约1-2ul(量宜大不宜小,否则难以下沉)，反复吸打混匀(操作时注意事项:不要有气泡,关键是不要压枪到头!)用移液枪滴加到小槽内(操作的注意事项,伸入液面下,但不要碰到胶!) 后进行电泳! Maker的不加,直接移液枪滴加到小槽内.
■SYBR ■SYBR Green I染色方法
1配制: 用PH - 的缓冲液（如：TAE，TBE 或TE），按照10000：1的比例稀释SYBR GreenⅠ浓缩液，混匀，制成染色溶液。
TBE pH的要求: - (最好pH .用水配稳定性不好(要在24h内用!)!配液时双层戴手套,试剂要常温解冻,离心再配!
2.保存:塑料和tip头盒中避光保存,不要放在玻璃容器中
3.方法:将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。
室温振荡染色10-30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。
(可保存一周多,重复用4次!)
为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。
■实验前期准备
预防RNA酶污染:
* 全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
* 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。
* 在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。
塑料器皿可以在NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
其他注意事项
* 当TRIZOL用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。
* 当TRIZOL用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加
入TRIZOL和氯仿后12,000×g的离心力。
不可使用有裂缝或者破损的试管。
* 离心前小心平衡试管。
* 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧。
■RNA抽提指南
注意：用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。
避免接触皮肤和衣服。
在化学通风橱完成操作。
避免呼吸道吸入。
所有的操作应该在15 -30℃的条件下完成，试剂亦在15-30℃的条件下。
实验前准备工作：
一实验器具与材料：
1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头：1ml、200μl、20μl
3、匀浆管：5ml
4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个
5、EP管：、、100μl
6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、试管架：5ml、、20μl
10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水
11、铝制饭盒：4个
12、塑料小饭盒：1个
13、大瓷缸：2个
14、锡泊纸：一卷
15、卷纸：2卷
16、三角烧瓶：带盖，稍大
17．新开包的手套（全程戴!）
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品：（包括枪头、EP管、枪头盒、匀浆管等!）
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需
要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）
2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）玻璃器材180度干烤8小时.
3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC!）
三、试剂配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存,或提前10分配好.（其中DEPC水需先高压!）
3、异丙醇：放入棕色瓶中.
4、氯仿：放入棕色瓶中 .
注:氯仿，无水乙醇，异丙醇均需重新开瓶，最好分装于几个EP管!
5、琼脂糖.
*PBS均用用灭菌之DEPC水配制。
*Trizol，RT-PCR试剂盒
*无RNA酶的水或% SDS溶液[调配无RNA酶的水，将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至% (v/v ：体积比)。
放置过夜并高压灭菌。
SDS溶液必须用DEPC 处理过并经高压灭菌的水配制。
四、几种缓冲液的配制：
1、电泳缓冲液：
TAE
Tris 54g
硼酸
EDTA 20ml
蒸溜水1000ml
5×TBE （贮存液）
再将5×TBE稀释10倍成就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水——→500ml
■2006-9-15的收获
工作缓冲液×TBE,我的是10×TBE的浓缩液, 100ml 的10×TBE的浓缩液加入1900的三蒸水,既是为.
电泳缓冲液是
2、6×缓冲液上样缓冲液：
%溴酚蓝
%二甲苯青FF
30%甘油
6×缓冲液，4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制：
1、% / %:：
琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min 后现进行电泳。