复旦大学细胞生物学实验教案07鼠肾细胞原代培养
动物细胞的原代培养【学习资料】
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取脾细胞融合前3天加强免疫一次，以活化 B淋巴细胞
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The End
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去毛
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碘酒消毒
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脾脏免疫－5
剪开外皮
剪开腹膜
找到脾脏
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脾脏免疫－6
注射抗原
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脾脏免疫－7
缝合伤口
注射双抗
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每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次
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第三次免疫之后10天，将小鼠断尾取血， 用ELISA方法，检测血清效价。
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骨髓瘤细胞的培养
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骨髓瘤细胞
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消化数分钟
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中止消化、吹散细胞
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收集细胞、离心
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计数
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细胞传代 37℃、5％CO2培养
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小鼠的免疫实验
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市售绵羊血整细胞浓度
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用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥 向肾门，去肾外膜及脂肪，
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剪碎组织
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接种组织块
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移入培养箱中（注 意贴有组织块的一 面朝上），
静止2～3小时， 然后将细胞培养瓶 轻轻翻转，继续静 止培养。
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观察
24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已 被污染；
小鼠肾脏原代细胞的分离和计数
一小鼠肾脏原代细胞的分离及细胞计数(一)原理细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作1．取材用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化30分钟，每隔5分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清。
4．制备单细胞悬液向含有经消化的肾组织的离心管中加入2-3 ml PBS，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。
5．细胞计数1 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。
4 计算原细胞悬液的细胞数（按照下面公式计算细胞密度）：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
细胞生物学小鼠细胞培养实验报告
广州大学综合设计性实验报告学院生命科学学院课程细胞生物学实验实验项目细胞培养实验题目小鼠肝细胞的原代培养专业生物技术年级、班别生技142 姓名徐嘉宽学号 1414300030 任课教师陈鲲细胞培养——小鼠细胞的原代培养摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。
方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。
（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。
脑和肾直接进行组织块培养。
）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。
结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。
关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法1前言初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。
学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。
细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。
当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。
了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。
结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。
2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。
小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。
2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。
用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。
9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。
操作时要小心，避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。
建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。
《一、动物细胞培养经历原代培养和传代培养》教学设计
《一、动物细胞培养经历原代培养和传代培养》教学设计一、教学目标1. 知识与技能目标- 学生能够准确说出动物细胞培养的概念、原理和过程，包括原代培养和传代培养的特点与区别。
- 理解动物细胞培养在现代生物工程中的应用，如生物制药、疾病治疗等方面的实例。
- 掌握动物细胞培养过程中所需的条件，如无菌环境、营养物质、温度、pH值等。
2. 能力目标- 通过观察图片、视频和实验模拟等活动，培养学生的观察能力和分析归纳能力。
- 以小组讨论动物细胞培养的应用案例为契机，提高学生的合作学习能力、交流表达能力和解决实际问题的能力。
- 让学生尝试设计简单的动物细胞培养实验方案，锻炼学生的实验设计能力和创新思维。
3. 情感态度与价值观目标- 激发学生对生物技术领域的兴趣和探索欲望，培养学生积极投身科学研究的热情。
- 让学生认识到动物细胞培养技术在生命科学发展和人类健康保障方面的重要意义，增强学生的社会责任感。
- 在小组合作学习过程中，培养学生相互尊重、团结协作的团队精神。
二、学情分析1. 已有知识基础- 学生在之前的学习中已经对细胞的基本结构和功能有了一定的了解，这为理解动物细胞培养过程中的细胞代谢和生长奠定了基础。
- 他们也学习过微生物培养的一些基本知识，如无菌操作技术，这对动物细胞培养中的无菌环境要求有一定的借鉴作用。
2. 学习能力- 高中学生具备一定的逻辑思维能力和自主学习能力，但对于较为复杂的生物技术过程，如动物细胞培养，还需要教师进行详细的讲解和引导。
- 学生在分析实验数据和现象方面还有待提高，需要通过具体的实例和练习来加强。
3. 兴趣爱好- 大部分学生对生物技术领域比较感兴趣，尤其是那些与人类健康和现代科技相关的内容，如基因治疗、生物制药等。
这可以作为激发学生学习动物细胞培养知识的切入点。
4. 学习风格- 学生比较喜欢直观的教学方式，如图片、视频展示等。
同时，小组合作学习和探究性学习也能够提高他们的学习积极性和参与度。
原代细胞培养操作(鼠胎组织细胞培养为
细胞冻存方法
• 1．预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO， DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞； • 2．取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,
用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)；
• 3．加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和 冷冻日期。
慢冻程序
• 标准程序：
•
• • •
当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min
当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中
• 简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过 线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，
在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
• 将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向 每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二 氧化碳培养箱中，继续进行培养
细胞计数： 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计
数板之间。
3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和
•
压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广
•
•
电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃
器皿消毒
•
•
滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
酶液等均采用滤过法除菌
• •
4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面
积的比例为0.2-0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培 养液（ 2mm ）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的 培养液（5mm）中生长较好。
小鼠肾脏细胞系的建立
细胞工程实验方案设计题目：小鼠肾脏上皮细胞系的建立设计者：班级生物1101姓名马聪冲学号 20113087指导教师：陈晓明日期： 2013年11月11日西南科技大学生命科学及工程学院目录一、基本原理（一）基本概念二、准备工作（一）实验所需试剂及材料（二）实验所需的器材及设备（三）基本用液的配置（四）器材清洗、干燥及消毒三、实验步骤（一）取材（二）原代培养（三）传代培养（四）细胞纯化（五）细胞系的建立（六）细胞冷冻保存（七）冻存细胞的复苏四、注意事项小鼠肾脏上皮细胞系的建立一基本原理动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
这个实验方案就是选取小鼠肾脏上皮利用动物细胞培养技术建立细胞系。
二准备工作1.实验所需的试剂及材料健康小鼠、火柴、酒精灯、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、EDTA、稀盐酸、蒸馏水、20%新洁尔灭、70%乙醇、D-Hanks液、甲醛、高锰酸钾、甘油、滤纸、0.22滤膜、台盼蓝、培养基成分（见表）2.实验所需器材及设备培养皿、镊子、手术刀、手术剪刀、小烧杯、吸管、三角瓶、棉球、细胞计数板、滤器、毛刷、超净工作台、紫外灯、液氮、冻存管、溶液瓶、量筒、毛帕、脸盆、一次性手套3.基本用液的配置RPMI-1640培养基的制备及消毒常用的培养基灭菌方法有化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤灭菌。
因为化学药剂及培养基的一些成分作用，所以不采用；因为紫外线的穿透能力弱，所以仅用于表面消毒和空气的消毒。
所以本次实验采用湿热灭菌D-Hanks液的配制：1）溶解定容：将药品（NaCl：4.0g，KCl：0.2g，Na2HPO4·12H2O：0.06g，KH2PO4：0.3g， NaHCO3：0.15g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至500ml，摇匀即成新配制的D-Hanks溶液。
乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养
乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养目的要求一、了解细胞原代培养、传代（继代）培养的基本方法和操作过程。
二、初步掌握培养过程中的无菌技术。
三、掌握在例置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。
用品超净工作台恒温培养箱普通显微镜例置相差显微镜水浴箱、离心机解剖剪、眼科剪镊子（尖头、平头和有钩镊）烧杯培养瓶离心管吸管血球记数板酒精灯单个仪器逐个弹出在屏幕上，小器械逐个弹出在超净台上培养用品RPM1 1640培养液（含小牛血清及青、链霉素）试剂库弹出具体内容酒精冻存培养液胰蛋白霉---⎪⎪⎭⎪⎪⎬⎫75%PBS 0.25%RPM1 1640、0.25%胰蛋白霉、PBS ，冻存培养液微热字显示动物细胞及细胞系 新生乳鼠（小鼠） 中国仓鼠卵巢细胞（CHO ） 人宫颈癌细胞（HELA ）以上三个也为热字显示乳鼠肾细胞原代培养方法1—单层细胞培养法 所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰酶消化能出去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。
步骤1．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
2．点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等3．取材取新生乳鼠一只，采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠进入盛有75%酒精的烧杯中2-3秒，随即携入超净工作台内。
在超净工作台内取出小鼠，置于消毒培养皿中打开消毒器械包用镊子掀起乳鼠腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，充分暴露腹腔，用另一镊子轻轻夹起肠管，翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污再将肾组织用解剖剪剪成几块再用PBS漂洗，去净血液为止4．消化将洗净的组织块移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至0.5mm大小的组织块加入5-8倍量（体积）的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37︒C水浴中消化20-30分钟，注意应每隔5分钟振摇一次。
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实验七鼠肾细胞原代培养
一、实验目的
了解细胞原代培养的原理和方法，学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制等操作技术，观察原代细胞的形态。
二、实验原理
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的器官组织，经消化，培养成为单个细胞的过程。
用胰蛋白酶对组织进行消化获得单细胞悬液，由细胞悬液定量接种后获得原代细胞培养物。
胰蛋白酶的作用是消化除去细胞间质，蛋白酶液中可添加胶原酶以增加消化能力。
细胞培养是探索细胞生命活动规律一种基本的、十分有效的实验技术，通过细胞培养可以进行细胞的结构，细胞的生长发育等等各项研究，目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
三、实验材料
出生后一周左右的乳鼠。
四、实验器材
细胞培养箱，离心机，超净工作台。
细胞培养皿，滴管，血球计数板，吸液器，眼科剪刀，镊子，小离心管。
五、实验药品
RPMl640培养液，小牛血清，青霉素，链霉素，0．25％胰蛋白酶和0．1％胶原酶，，75％乙醇，碘酒，乙醚，PBS，EDTA。
六，实验步骤：
1. 按无菌操作技术，消毒超净工作台及双手。
2. 用乙醚麻醉法处死小鼠：将乙醚棉球放进烧杯中，然后放入小
鼠，盖住杯口片刻等小鼠死亡。
3. 碘酒消毒腹部皮肤。
4. 75％酒精脱碘2次，然后进入超净工作台操作。
5.用酒精消毒双手及台面。
6. 用第一副眼科镊及眼科剪“工”字型剪开皮肤。
7.用第二副眼科剪，剪开拉开腹膜。
8．推开肠管，在腹后壁找到肾脏，并剪取全肾。
将剪刀放入75％酒精中浸泡，待用。
9.置肾脏于灭菌的盛有PBS灭菌液的培养皿。
（直径60mm）中洗
两次。
夹取肾组织，移至灭菌1.5ml离心管内，将剪刀在无菌PBS
中洗一下，剪碎肾组织，越碎效果越好。
10. 加入0．25％胰蛋白酶+1％胶原酶lml，混合均匀。
11. 37℃作用15分钟，每五分钟轻轻弹击。
12. 无菌滴管轻轻吹打已消化组织20次，注意避免液体外溢。
13. 1000RPM，离心1分钟，沉淀未消化的组织块和残渣。
14. 吸取含有离散细胞的上清液至另一个管内。
15. 3000RPM离心2分钟，收集离散细胞。
16．弃去上清液，加入完全培养液lml，吹打均匀。
17．吸取l0µl，加入细胞计数板中，进行细胞计数。
要求数四个角的16个小格中细胞数的总和。
然后按照以下公式计算细胞密
度。
总计数结果*1000*稀释倍数=细胞个数/mL
4
18.按105细胞/ml，吸取lml细胞加lml培养液，接种到35mm
细胞培养皿中。
19. 轻轻混匀细胞，置培养皿于37℃，5％的C02培养箱中，第二天．
观察，换培养液，继续培养，第四天观察结果。