蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程
胶内酶解
1.2.2 蛋白质谱鉴定（1）胶内酶解斑点切取：用剪刀将200 μL枪头尖端剪掉约1-2cm，孔的直径约为2-3 mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中（离心管灭菌后浸泡于75%乙醇，用时取出自然干燥）。
操作时注意减少污染，戴帽子手套操作，尽量减少所切取蛋白质点周围的凝胶体积，勿使样品干燥。
脱色、脱水：每管加入100 μL脱色液（50% 乙腈，25 mM 碳酸氢铵），室温放置30 分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。
加入60 μL 乙腈使凝胶脱水10 min，丢弃上清液。
酶解：每块凝胶加入约8 μL（浓度为12.5 ng/μL）溶于100 mmol/L 碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃ 吸胀1 h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12 h。
加入10 μL 5% 三氟乙酸，1 h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。
加入10 μL 2.5% 三氟乙酸，1 h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。
将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。
用0.2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。
保存？？？（2）质谱鉴定①点靶：将冻干肽混合物中加入2μL 0.2% 三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。
取每个样品0.6 μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
再取0.6 μL饱和基质α-手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800 Proteomies Analyzer)。
②质谱鉴定：样品用4800串联飞行时间质谱仪4800 Proteomies Analyzer 进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。
肽指纹图谱（PMF）质量扫描范围为800-4000Da，且一级质谱强度最大的 5 个峰进行串级质谱分析。
谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。
imc空间蛋白质组流程
IMC空间蛋白质组流程是一种基于质谱的蛋白质组学技术，它利用离子迁移谱（IMS）和质谱（MS）的结合，对蛋白质混合物进行高分辨率和高灵敏度的分析。
以下是该流程的简要介绍：
蛋白质提取和分离：首先，从样本中提取蛋白质，然后使用凝胶电泳或色谱等方法将蛋白质进行分离，以获得不同蛋白质的混合物。
酶解：将蛋白质混合物酶解成肽片段，以便后续的质谱分析。
常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
肽段标记：使用稳定同位素标记技术对肽段进行标记，以便在质谱分析中进行相对定量。
常用的标记试剂包括TMT、iTRAQ等。
IMS分离：将标记后的肽段通过IMS进行分离，得到不同肽段的迁移时间和谱图。
IMS能够根据肽段的电荷状态和大小进行分离。
MS分析：将IMS分离后的肽段通过质谱进行分析，获得肽段的序列信息和相对丰度。
常用的质谱技术包括MALDI-TOF、ESI-Q-TOF等。
数据解析：将质谱数据解析成肽序列和相对丰度，然后进行蛋白质的鉴定和相对定量。
生物信息学分析：将鉴定的蛋白质进行功能分类、相互作用网络构建等生物信息学分析，以获得蛋白质组的全面信息。
通过以上流程，IMC空间蛋白质组流程可以对蛋白质混合物进行高分辨率和高灵敏度的分析，为研究蛋白质表达和功能提供有力手段。
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缺点：
•可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。 • 肽段分子量精确度往往不够理想，影响鉴定结果。肽段分子质量在 2000以上时，在MALDI-TOF-MS中的分辨率会有所下降 。 •无法进行混合蛋白质鉴定 •翻译后修饰鉴定能力稍低
LTQ（ESI-MS/MS）
由于该质谱具有高效液相分离与MS/MS结构分析功能，可以获得检测到 的每一肽段的序列。根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱 (MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。 优点：
总离子可信度
肽段序列
实际分子量 理论分子量
起始氨基酸位置 结束氨基酸位置
肽段离子得分
肽段固定修饰
分子量误差
肽段可信度
MS-MS (SeQuest)
BuildSummary
LTQ质谱（BuildSummary软件）结果说明
唯一肽段数 鉴定的肽段数 搜索到的蛋白 蛋白鉴定覆盖率 蛋白理论分子量 蛋白理论等电点 搜索到的蛋白可能有多个gi号，取最典型的gi号，选取次序为：sp > ref > first gi_number
• MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激 光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子 或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软 电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。
• TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器 的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行 时间成正比 ，检测离子。
压力差推动质子化样品进入质 量分析器进行检测 。
实验原理
适用样品
• 一般建议样品为溶液或考染胶。若为银染胶，需要采取快 速银染（即同质谱鉴定兼容）的方法染色。 • 溶液中一般不要有SDS、CHAPS、Triton X-100、NP40及 吐温 20、40等系列的去污剂。盐浓度小于50mM • 溶液样品蛋白浓度一般不小于1mg/ml，蛋白总量不小于 10ug。
质谱法全序列检测方法
质谱法全序列检测方法质谱法是一种常用于生物样品分析的技术，可以快速、准确地测定样品的氨基酸序列和蛋白质表达水平。
下面是质谱法全序列检测方法的步骤：1.样品准备在进行质谱分析前，需要将生物样品进行处理和准备。
通常需要将样品进行蛋白酶解，将蛋白质分解为氨基酸序列，以便于后续的分析。
此外，还需要对样品进行清洗、纯化等步骤，以去除杂质和干扰物质。
2.离子化离子化是质谱分析的关键步骤之一，即将样品中的化合物转化为带电离子。
常用的离子化方法有电喷雾离子化（ESI）和基质辅助激光解吸离子化（MALDI）。
在离子化过程中，样品中的化合物会吸收能量并转化为带电离子。
3.质量分析在离子化后，需要对样品中的离子进行质量分析。
常用的质量分析器有飞行时间质量分析器和四极杆质量分析器等。
通过质量分析器，可以测定离子的质荷比（m/z），即离子的质量和电荷之比。
根据离子的质荷比，可以初步推断离子的类型和分子量。
4.谱图解析通过对离子的质荷比和相对丰度的测定，可以生成质谱图。
质谱图是一种包含大量信息的图像，可以通过谱图解析来识别和解析离子的类型和分子量。
常用的谱图解析方法有指纹图谱法和数据库比对法等。
指纹图谱法是根据样品的质谱图与已知指纹图谱进行比较，确定样品中的化合物类型；数据库比对法则是将样品的质谱数据与已知数据库中的数据进行比对，从而识别出样品中的化合物类型。
5.数据库比对在进行谱图解析时，通常需要将样品的质谱数据与已知数据库中的数据进行比对。
常用的数据库包括Uniprot、NCBI等。
通过比对，可以确定样品中存在的氨基酸序列和蛋白质表达水平等信息。
同时，还可以利用数据库中的注释信息和其他相关数据，对样品的生物学功能进行深入分析。
总之，质谱法全序列检测方法是一种高效、准确的蛋白质分析技术，可以广泛应用于生物医学领域的研究。
通过对样品进行深入的质量分析和数据库比对，可以获得样品的氨基酸序列和蛋白质表达水平等信息，为进一步研究提供重要的参考依据。
蛋白质酶解操作规程
有还原烷基化蛋白质消化操作流程1.将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板中,并记录点号及相应的位置；2.加50μL DD.H2O 洗两次，10min/次；3.加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液(考染脱色液)50μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；(若为银染, 一般不需要脱色; 若必须脱色,使用15mM K3Fe(CN)6/50mM Na2S2O3 , 轻摇直到变为淡黄色透明,再用水反复洗至无色)4.重复步骤3，直至蓝色褪去；5.加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干10min；6.加10 mM DTT（10μL 1M DTT，990μL 25mM NH4HCO3配制）20μL，56℃水浴1hr；7.冷却到室温后，吸干，快速加55 mM IAM （55μL 1M IAM，945μL 25mMNH4HCO3配制）20μL，置于暗室45min；8.依次用25 mM NH4HCO3 ( 2X10分钟)、25 mM NH4HCO3 +50％乙腈溶液( 2X10分钟)和乙腈洗(10分钟)，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干10min；9.将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10~20倍，每EP管加2~3μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO3 至总体积10-15μL置37℃，消化过夜；10.加入1%TFA终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心。
说明:1.每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。
2．如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分成约为1.5mm3大小再进行脱色，使用的各种溶液的量也相应增加。
3．实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带口罩和帽子。
4．银染蛋白质点胶内消化不要脱色，步骤3、4省略。
蛋白质酶解步骤
蛋白质酶解步骤
一、蛋白质酶解
蛋白酶解是一种常用的生物学技术，用于分离、纯化和分析蛋白质复合物。
蛋白质酶解的主要步骤主要包括：
1. 蛋白酶解液的准备：将适宜的蛋白酶（如无菌胰蛋白酶等）与抑制剂（如EDTA等）混合，将蛋白质溶液加至混合物中，使溶液缓冲至适宜的pH值，然后加入一定量的 NaCl 和蛋白酶抑制剂，如硼砂或酒石酸钙。
2. 加入酶：将适宜的量的蛋白酶（如胰蛋白酶）加入解液中，并保持恒定的温度，使酶保持活力。
3. 进行反应：解液中的酶会将蛋白质降解成小于50 kDa的低分子量的肽。
4. 时间监测：不同蛋白质所需要的酶解时间是不同的，一般最小的反应时间为1小时，最大的反应时间可达几天，最好根据指标物的酶解速率来调节反应时间，当达到最近的指标物酶解质量时，可以停止反应。
5. 浓缩和离心：进行离心，以把蛋白质复合物从反应液中分离出来，然后将浓缩液冻存，以便后续分析。
6. 过滤：将反应液过滤，以去除剩余的酶，过滤后的溶液可作为蛋白质分析的样本。
二、总结
蛋白质酶解是一种常用的生物学技术，可用于分离、纯化和分析
蛋白质复合物。
蛋白质酶解的主要步骤包括：准备蛋白酶解液，加入酶，进行反应，时间监测，浓缩和离心，过滤。
通过这几个步骤，我们可以从反应液中分离出蛋白质复合物，从而实现蛋白质的分离、纯化和分析。
脱氧胆酸钠(sdc)促进的蛋白质酶解与鉴定
在探讨脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate, SDC）促进的蛋白质酶解与鉴定这一主题时，我们首先需要了解脱氧胆酸钠的作用机制和在蛋白质酶解中的作用。
脱氧胆酸钠是一种表面活性剂，通常用于蛋白质提取和溶解。
其作用包括破坏蛋白质间的非共价键和疏水作用，从而有利于蛋白质的酶解和鉴定。
1. 脱氧胆酸钠的作用机制脱氧胆酸钠在蛋白质酶解中起到了至关重要的作用。
其主要作用包括：（1）破坏蛋白质的结构脱氧胆酸钠能够与蛋白质分子中的疏水和非极性区域相互作用，从而使蛋白质发生构象改变，暴露更多的酶切位点，有利于酶解作用的进行。
（2）改善溶解性脱氧胆酸钠可以改善蛋白质的溶解性，使蛋白质更容易与酶结合，促进酶解的进行。
2. 蛋白质酶解与鉴定蛋白质酶解是指通过蛋白酶对蛋白质进行酶解作用，将复杂的蛋白质分解为易于分析和鉴定的片段。
鉴定这些片段可以帮助科研人员了解蛋白质的结构、功能和代谢途径，为进一步的研究提供重要信息。
蛋白质酶解和鉴定通常包括以下步骤：（1）蛋白质提取和定量（2）选择合适的蛋白酶进行酶解（3）酶解条件的优化（4）质谱分析3. 脱氧胆酸钠促进的蛋白质酶解与鉴定通过脱氧胆酸钠的作用，我们可以更好地进行蛋白质酶解与鉴定。
脱氧胆酸钠的应用可以使蛋白质更容易被酶切，从而得到更多的酶解产物。
脱氧胆酸钠也能提高蛋白质的溶解度，有利于进一步的质谱分析。
总结回顾脱氧胆酸钠在蛋白质酶解与鉴定中发挥着重要的作用。
它能够通过改变蛋白质结构和提高溶解度，促进蛋白质酶解的进行，并为质谱分析提供更多的酶解产物。
在蛋白质研究领域中，脱氧胆酸钠的应用具有重要意义。
个人观点和理解我个人认为，在蛋白质酶解与鉴定的过程中，脱氧胆酸钠的作用不可或缺。
其能够提高酶解效率，使我们能够更全面地了解蛋白质的结构和功能。
然而，在应用脱氧胆酸钠时，也需要注意其浓度和作用时间的控制，以免对蛋白质酶解和鉴定产生不良影响。
通过对脱氧胆酸钠促进的蛋白质酶解与鉴定的深入探讨，我们可以更好地理解其在蛋白质研究中的重要作用。
大豆蛋白酶解实验方案
大豆蛋白酶解实验方案
一、实验目的
通过大豆蛋白的酶解实验，探究酶解对大豆蛋白的影响，为了解大豆蛋白的营养成分及其应用提供实验依据。
二、实验材料
1、大豆蛋白粉
2、三倍体蛋白酶
3、磷酸盐缓冲液
4、氯化钠
5、紫外分光光度计
6、酶解仪
三、实验步骤
1、称取一定量的大豆蛋白粉，加入适量的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，调节pH 值至7.0。
2、加入一定量的三倍体蛋白酶，放置于酶解仪中，在恒温下酶解反应。
3、每隔一定时间取少量反应液，加入适量的氯化钠，用紫外分光光度计检测吸光度。
4、反应结束后，用紫外分光光度计检测吸光度，计算大豆蛋白酶解率。
四、数据处理
1、将实验记录表格中的各项数据，制作成折线图，以反映酶解过程中各项指标的变化趋势。
2、计算大豆蛋白酶解率，用酶解前后的蛋白质含量相减，再除以酶解前的蛋白质含量，即可得到酶解率。
3、进行统计学分析，比较不同组的实验结果，确定酶解参数。
五、实验结果
1、折线图反映了各项指标的变化趋势，如酶解时间、酶解温度、酶解剂量等。
2、实验结果表明，随着酶解时间的延长，大豆蛋白的酶解率增加；随着酶解温度的升高，酶解率也随之增加；酶解剂量也对酶解率有影响，但未能达到理想效果。
六、实验结论
1、本实验结果表明，大豆蛋白的酶解是可能的，随着酶解时间、温度和酶解剂量的增加，酶解率增加。
2、大豆蛋白的酶解对其营养成分有一定影响，酶解后可释放部分蛋白质和氨基酸，提高其生物利用度。
3、本实验结果可为大豆蛋白的应用提供参考，也为后续研究提供了实验依据。