质谱数据分析2014
第七讲质谱分析(共58张PPT)
EI 与 ESI
质谱计的主要技术指标
质量范围： 指质谱计所检测的单电荷离子的质核比范围
分辨率（R）：分辨率是质谱计分开相邻两离子质量的能力。
R = m /m
m为质谱计可分辨的相邻两峰的质量差 m为可分辨的相邻两峰的平均质量
分辨率（ R ）是两峰间的峰谷为峰高的10%时的测定值，即 两峰各以5%的高度重叠。
◆质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对 强度的谱, 谱图与分子结构有关
◆质谱法进样量少, 灵敏度高, 分析速度快
◆质谱是唯一可以给出分子量, 确定分子式的方 法, 而分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关 重要的。
质谱计框图
真空系统
加速区
Output
计算机数据 处理系统
Sample
进样系统
inlet
射方向不同的离
子会聚；
S1
分辨率不高
B
离子源
磁场
R
S2 收集器
双聚焦分析器
方向聚焦：
相同质荷比，入射 方向不同的离子会聚；
能量聚焦：
相同质荷比，速 度(能量)不同的离子 会聚；
电场
+ -
S1 离子源
磁场
S2 收集器
质量相同，能量不同的离子通过电场和磁场时，均产生能量 色散；两种作用大小相等，方向相反时互补实现双聚焦；
第七讲质谱分析
Spectrometry NOT Spectroscopy
Spectroscopy n. 光谱学, 波谱学, 光谱仪 Spectrometry n. 质谱术，质谱计
Spectrometry : Spectrometer Abbreviated to: Mass spec. or MS
14质谱分析法
1 单聚焦分析器（single focusing mass analyzቤተ መጻሕፍቲ ባይዱr） 单聚焦分析器（ ）
23
结论： 结论： 1 离子的 离子的m/z大，偏转半径也大，通过磁场 大 偏转半径也大， 可以把不同离子分开 2 在一定加速电压U，改变磁场强度B下，或在一 在一定加速电压U 改变磁场强度B 定磁场强度B 连续改变加速电压U 定磁场强度B下，连续改变加速电压U，可以使 不同离子先后通过检测器，实现质量扫描， 不同离子先后通过检测器，实现质量扫描，得到 质谱。 质谱。
离子运动的轨道半径
mυ = BZυ R
2
磁场强度
由上两式得 m B2R2 = z 2U
1 2 ( mυ = zU ) 2
离子在磁场中的轨道半径R取 离子在磁场中的轨道半径 取 决于： 决于： m/z、 B 、 U 、
13
1 m R= 2U B z
若B和U固定不变， 固定不变， 则离子的m /z越大 越大， 则离子的m /z越大， 运动半径越大； 运动半径越大；m /z 不同，运动半 不同， 径不同， 径不同，各种离 子按m 子按m /z 的大小 顺序分开
1 2 mυ = zU 2
离子质量 离子速度
加速电压 离子所带 电荷
12
加速后的离子进入磁场中，由于受到磁场的影响， 加速后的离子进入磁场中，由于受到磁场的影响， 离子作圆周运动（弧形运动）， ），离子的向心力 离子作圆周运动（弧形运动），离子的向心力 磁场力）BZυ和运动的离心力m /R相等 （磁场力）BZυ和运动的离心力m υ2/R相等
m/z
9
离子源 分子分离器 质量分析器
10
试样在离子源内被气化、电离， 试样在离子源内被气化、电离，有机物在 高速电子流的轰击下常常被击出一个电子， 高速电子流的轰击下常常被击出一个电子， 形成带一个正电荷的正离子， 形成带一个正电荷的正离子，称为分子离 + 子 •
质谱数据解析
质谱数据解析
质谱数据解析是质谱分析中的一个重要步骤，它把得到的质谱数据转化为有用的信息，帮助分析师确定样品中存在的物质成分，鉴定分子结构和确定化合物的数量。
总的来说，质谱数据解析主要包括以下几个方面：
1. 分离峰的提取：在质谱图中，通常会出现多个峰，表示样品中可能存在多种物质。
分离峰的提取是把这些峰分开，以便分别进行分析。
2. 确定化合物的分子式：分离出的质谱图上的峰通常可以通过测定分子离子峰、裂解峰等特征峰来确定化合物的基本分子式。
3. 确定化合物的结构：分析样品的质谱数据，根据裂解片段、离子对和其他特征峰等信息确定化合物的分子结构和功能基团。
4. 确定化合物的浓度：质谱分析通常可以确定化合物的浓度，这对于定量分析非常重要。
上述过程中，质谱仪是不可或缺的工具。
质谱仪通过对物质分子进行电离、加速、分离和检测等过程，得到物质在质谱上的分布情况。
不同质谱仪的检测灵敏度、分辨率和分析速度都有差别，因此，合理选择、使用质谱仪是确保数据解析准确的关键。
LC-MS数据分析方法
LC-MS数据分析方法
质谱数据结果分析方法：
MS数据一般都会有如下几个特征参数：PSM、Peptide、Unique Peptides、Protein，PSM是拿数据库里的多肽和质谱图进行比对，并输出最高分数值的多肽作为一个PSM，PSM值越高，则表明可信度相对越高；Peptide和Unique Peptides则代表了肽段的特异性，一般Unique Peptides和Peptides的数值越接近，则代表肽段的特异性相对越好；而Protein代表了这些Peptides综合分析所归属的蛋白，数值越小则表明Peptides所代表的的蛋白特异性相对越好。
为了得到相对确信可靠的分子进行后续的验证实验，就要综合考虑以上几个参数，同时还要照顾分子本身的定位、功能等。
第十四章 质谱分析
1) 电子轰击源(Electron Impact，EI)
作用过程： 采用高速(高能)电子束冲击样品，从
而产生电子和分子离子M+，M+继续受到 电子轰击而引起化学键的断裂或分子重排 ，瞬间产生多种离子。
水平方向：阴极发射电子—灯丝与阳极间 (70V电压)—高能电子 —冲击样品—正离 子
垂直方向：G3-G4加速电极(低电压)---较 小动能---狭缝准直G4-G5加速电极(高电 压)---较高动能---狭缝进一步准直--离子进 入质量分析器。
磁分析器质谱方程式
是设计质谱仪器的主要依据。
离子在磁场中的轨道半径R取决于： m/z、 B、 U
5 、 检测器
质谱仪常用的检测器有电子倍增器及闪烁计数 器、照相底片等。
特点：实现高灵敏度、快速测定
§14-3 质谱图及离子峰的主要类型
一、质谱图 质谱图是以质荷比(m/z)为横坐标、相对强度为纵
坐标构成，将原始质谱图上最强的离子峰定为基峰并 定为相对强度100％，其他离子峰以对基峰的相对百分 值表示。
§14-1 质谱分析概述
一、 质谱仪的发展简史 1912年： 世界第一台质谱装置 1940年代: 质谱仪用于同位素测定 1950年代：MS商品化广泛用于有机物结构分析 1960年代：研究GC-MS联用技术 1980年代：研究LC-MS联用技术 1990年代：生物分析的需要，新的离子化方法
二、 质谱分析法 将样品转化为运动的气态离子并按质荷比（m/z）大
低分辨质谱仪给出的是离子的标称质量，而高分辨 质谱仪给出的是离子的精确质量
四、 质谱仪的分类
按用途分：有机质谱；无机质谱；同位素质谱
按原理分：单聚焦质谱；双聚焦质谱；四极滤质器；飞 行时间质谱；离子阱质谱
质谱数据分析2014
• Usually, only a fraction of the proteins synthesized can be detected in a proteomics experiment, whereas the expression of ALL genes can be monitored in a whole-genome
• 最后一个R的质量多加了18，这是因为我们写在下面的是残基的分子量。
肽和肽键
质量排列
• 把所有多肽的分子量排序。
质量纹
• 如此，质谱图上的质量就可以与多肽上的质量相匹配。
http://www.absoluteastronom /topics/Peptide_mass_fi ngerprinting
质量纹
• 这就是多肽质量纹（PMF）的最基础的思路。质量纹算法成立的基础，在于酶切的特异性以及多肽离子质 量的精确测定
• 问题？
PMF中的问题
• 第一个问题：质量相近的多肽怎么处理？
• 在现实的蛋白数据库中，多肽的数量是很庞大的。这里面难保不会有质量非常相近的多肽。这样，就造成 了质谱图上的一个峰可能匹配不止一个多肽，于是我们就难以知晓这张质谱图究竟代表哪个蛋白。
From Yogita Mantri & Arvind Gopu’s presentation in 2003
array experiment.
蛋白质组学研究的目标
• 蛋白质鉴定 • 蛋白质特性-如翻译后修饰 • 蛋白质定量-相对定量、绝对定量 • 样品间比较
• 定性-不同样品间含有的蛋白类型的差异 • 定量-不同样品间含有的蛋白浓度/含量的差异 • 翻译后修饰-不同样品间是否存在不同的翻译后修饰形式
质谱的数据处理及分析
质谱的数据处理及分析
质谱的数据处理及分析是一项繁琐而又艰苦的工作。
针对质谱数据，有许多数
据处理及分析方法可以被应用，比较常见的有以下几种：
一是基于最小更新的数据处理。
这是基于上一次更新所做的数据处理。
要求仅
更新发生变化的数据项，以节省空间。
二是采用正交正则化方法处理数据。
正交正则化是一种分析质谱数据的数学方法，定义在一个特定的常数变量上，能够把复杂的数据结构拆分成不同的切片，便于读者更加清楚的理解和分析数据。
三是基于最邻近算法（K-means）进行数据聚类并分析。
最邻近算法实际上就
是确定受调查对象之间关系，以及如何将这些项目中具有相似性质的对象划分为若干聚类组，这些聚类组能够有效地揭示关键信息。
四是利用统计学方法来确定质谱数据中突出成分之间的相关关系。
统计方法有
前排法（Principal Component Analysis）、主成分回归分析（Partial Least Squares），实质上是一种显示特殊的质谱谱图，以便我们能轻松对质谱数据中的
特征群进行识别，以便进行后续的分析。
在运用数据处理及分析的时候，除了这几种常用的处理方法，我们还可以利用
多维统计和回归分析等技术为质谱分析数据提供更准确的分析支持。
此外，由于质谱数据较复杂，可以借助计算机数学方法进行繁琐的数据处理工作，提高工作效率。
总之，质谱数据处理及分析是一项繁重而又精细的工作，其中涉及到多种处理
方法，每种方法都是为了更好地完成分析任务而采用不同的数据处理方法；这也体现了质谱数据处理及分析的多样性和复杂性。
质谱数据定量分析方法概要
质谱数据定量分析方法概要质谱数据定量分析是一种使用质谱仪获取样品中特定化合物或元素含量的方法。
它能够在短时间内实现对多种目标化合物的分析，具有高灵敏度、准确度和选择性等优点。
下面将概述几种常用的质谱数据定量分析方法，包括标准曲线法、内标法、同位素稀释法和定量结构活性关系分析方法。
1.标准曲线法标准曲线法是质谱数据定量分析中最常用的方法之一、在这种方法中，首先准备一系列已知浓度的标准溶液，并对这些标准溶液进行质谱分析，得到样品中目标化合物的质谱峰面积或峰高度。
然后，根据标准曲线绘制出目标化合物浓度与质谱峰面积或峰高度之间的关系曲线，通过对待测样品的质谱峰进行测定，可以根据标准曲线计算出目标化合物在样品中的浓度。
2.内标法内标法是一种相对比较准确的质谱定量分析方法。
在这种方法中，选择一个与目标化合物具有相似物理化学性质的化合物作为内标物，并将内标物溶液加入待测样品中。
然后，对待测样品进行质谱分析，测定目标化合物和内标物的质谱峰面积或峰高度。
通过计算目标化合物和内标物的峰面积或峰高度比例，并与已知浓度的标准溶液进行比较，可以计算出目标化合物在样品中的浓度。
3.同位素稀释法同位素稀释法是一种用于分析样品中特定元素或化合物含量的高精确度和高灵敏度的质谱定量方法。
在这种方法中，已知浓度的同位素标准物质加入样品中作为内标物，并进行质谱分析。
通过测定目标化合物和同位素标准物质的质谱峰面积或峰高度比例，并与已知浓度的同位素标准物质进行比较，可以计算出目标化合物在样品中的浓度。
同位素稀释法有很高的精确度和准确度，广泛应用于环境分析、食品检测和生命科学研究等领域。
4.定量结构活性关系分析方法定量结构活性关系分析方法是一种基于质谱数据分析化合物结构与活性之间关系的定量分析方法。
在这种方法中，首先通过质谱技术获取样品中一系列化合物的质谱数据，然后将这些质谱数据与已知的化合物结构信息进行比对和分析，建立起化合物结构与特定活性之间的关系模型。
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Collects and store ions in order to perform MS-MS analyses on them.
Separates the mass analysis and ion isolation events in time (using a single mass analyzer)
质量相近的多肽
多肽 DGAPLESSSR REGESTPSR DFPIANGER DPLASSSWR
YVPLKDQR HLQLPAPSR VLFLNGIDK
[M+H+] 1019.0490 1019.0520 1019.0940 1019.0940 1019.1800 1019.1830 1019.2200
MALDI m/z spectrum of a peptide mixture
The Quadrupole
source
The quadrupole consists of four parallel metal rods. Ions travel down the quadropole in between the rods.
Peak m/z: 1019.08
解决方案
►第一个解决的办法是限制用来搜索的数据库。 比如，你如果做的试验用的是小鼠的组织， 那么你可以只在小鼠的数据库中搜索，这样 就可以减低出现这种情况的可能性。
►多肽质量纹一般都用于分析2DE-MS的结果， 不适宜分析多个蛋白质的混合物。
多肽质量纹鉴定
► 蛋白质经过酶解后，送入质谱仪，得到一级 质谱，即多肽离子的m/z。
► 从一级质谱鉴定蛋白质的算法主要用在 MALDI-TOF产生的质谱图上。
1. 目前来说，由MALDI-TOF质谱仪产生的质谱 图精度较高。
►下载FASTA格式
Protein sequence database
Uniprot（包含Swissprot和Tremble）
Integr8
FASTA格式的数据库
►FASTA格式包含蛋白的名称和氨基酸序列。
虚拟酶解
►有了蛋白序列的信息，我们就可以进行鉴定。 ►对应于送进质谱仪的样品，首先找到数据库
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Orbitrap 静电轨道阱质谱 傅里叶变换原理
Mass Spectrometry Reviews，Volume 27, Issue 6
蛋白质组学研究的目标
►蛋白质鉴定
▪ Top-down策略（质量纹方法，MS谱图） ▪ Bottom-up策略（de novo测序和数据库检索，MS/MS谱
图）
► Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) ▪ Analyte (protein) is mixed with large excess of matrix (small organic molecule) ▪ Irradiated with short pulse of laser light. Wavelength of laser is the same as absorbance max of matrix.
Ionization methods
► Electrospray mass spectrometry (ESI-MS) ▪ Liquid containing analyte is forced through a steel capillary at high voltage to electrostatically disperse analyte. Charge imparted from rapidly evaporating liquid.
Ion Trap Mass Analyzer
Ions in
Trapped ions
Ions out
The trap consists of a top and a bottom electrode and a ring electrode around the middle.
Ions are ejected on the basis of their m/z values.
A short sweep of frequencies is used to excite all ions. The complex spectrum of intensity/time is analyzed with Fourier Transform to extract the m/z componets
蛋白质组学研究的目标
► 蛋白质鉴定 ► 蛋白质特性-如翻译后修饰 ► 蛋白质定量-相对定量、绝对定量 ► 样品间比较
▪ 定性-不同样品间含有的蛋白类型的差异 ▪ 定量-不同样品间含有的蛋白浓度/含量的差异 ▪ 翻译后修饰-不同样品间是否存在不同的翻译后修
饰形式 ► 蛋白质功能
把单个蛋白/多 肽从复杂样品中 分离出来非常困 难，在“组学” 实验中一般达不 到这个效果
2. 另一个问题是，ESI产生的质谱图中的离子 通常带有很多电荷，而MALDI质谱图中的离 子一般只带一个电荷，比较容易计算。
蛋白序列数据库
►质量纹算法的核心是将实验获得的蛋白指纹 与数据库中的蛋白指纹进行匹配，为此，必 须首先找到一个合适的蛋白质序列数据库
►在网上可以查询到最新的蛋白序列数据库， 如NCBI，UniProt, SwissProt等等
质量纹
►这就是多肽质量纹（PMF）的最基础的思路。 质量纹算法成立的基础，在于酶切的特异性 以及多肽离子质量的精确测定题：质量相近的多肽怎么处理？
►在现实的蛋白数据库中，多肽的数量是很庞 大的。这里面难保不会有质量非常相近的多 肽。这样，就造成了质谱图上的一个峰可能 匹配不止一个多肽，于是我们就难以知晓这 张质谱图究竟代表哪个蛋白。
► Key advantage of proteomics
▪ Researchers work on the level of gene products and deal with genes that are really expressed to give a detectable PRODUCT and are not just "expressed“ which only says they produce a detectable mRNA but it is not clear whether there is a gene product or not.
To monitor the ions coming from the source, the trap continuoulsy repeats a cylcle of filling the trap with ions and scanning the ions according to their m/z values.
A mass analyzer for determining the mass-to-charge ratio (m/z) of ions based on the cyclotron frequency of the ions in a fixed magnetic field.
Ions are injected into a magnetic field , that causes them to travel in circular paths. Excitation with oscillating electrical field increases the radius and enables a frequency measurement
This allows selection of a particular ion, or scanning by varying the voltages.
Voltage
Filters out all m/z values except the ones it is set to pass
Obtains a mass spectrum by sweeping across the entire mass range
► 蛋白质修饰 ► 蛋白质定量-相对定量、绝对定量 ► 样品间比较 ► 蛋白质功能
Top-down proteomics
指纹数据库
一级质谱图
/prototype/english/services/ pro_pmf.html
多肽质量纹鉴定
►多肽质量纹（Peptide Mass Fingerprinting， PMF）是从一级质谱（MS）中鉴定多肽的主 要方法。
All ions are detected simultaneously over some given period of time
ICR can be used with different ionization methods, ESI, MALDI
High resolution
High accuracy
Very sensitive (the minimal quantity for detection is in order of several hundered ions
Non destructive –the ions don’t hit the detection plate so they can be selected for further fragmentation
蛋白质组学的数据分析
邵晨
复习
►蛋白质组的定义，蛋白质组学和基因组学的 区别？
►由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所 有蛋白质。蛋白质组的概念与基因组的概念有 许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同 而改变。 在转录时，一个基因可以多种mRNA 形式剪接，一个蛋白质组不是一个基因组的直 接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超 过基因组的数目。