lncRNA研究策略与技术
研究lncRNA的常见技术及原理LncRNA专题
研究lncRNA的常见技术及原理LncRNA专题本期专题将围绕lncRNA的常见技术与原理，主要介绍RT-PCR/qPCR/RT-qPCR/QD-FISH原位杂交技术/cDNA 末端快速扩增/RNA pull down/RIP技术/ChIRP等技术及原理，还介绍了相关研究思路。
快来和小编一起开启学习模式吧~1常见技术及原理1.RT-PCRRT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR），由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反转录酶。
2.qPCRReal-time-PCR和qPCR（Quantitative Real-time-PCR）是一码事，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。
3.RT-qPCRRT-qPCR（Real-time Quantitative PCR），实时荧光定量PCR 就是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化，最后通过Ct值和标准曲线的分析对起始模版进行定量分析的方法。
LncRNA的研究策略
lncRNA研究策略转载请注明来自丁香园发布日期：2012-09-21 14:47 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：RNA miRNA 技术专题锐博生物丁香通丁香园点击次数：34471、差异表达筛选通过lncRNA芯片或RNA-seq测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA 表达谱分析。
2、生物信息分析通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA 的靶基因。
3、细胞分子水平研究（1）功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体（2）功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响（3）可通过RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。
4、动物实验（1）构建移植瘤或原位瘤模型，转移模型（2）导入siRNA或者lncRNA表达质粒（3）检测肿瘤生长曲线（4）通过免疫组化、RT-PCR、Western Blot等方法检测相关指标变化。
小知识RNA-RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation)是一种高通量检测细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。
RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。
CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白的高通量测序方法。
方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针，把目标RNA拉下来以后，与其共同作用的DNA染色体片段就会附在到磁珠上，最后把染色体片段做高通量测序，这样会得到该RNA能够结合到在基因组的哪些区域；如果结合物是蛋白质，可以通过将蛋白质打断成短肽再通过质谱进行鉴定，从而或者与RNA结合的蛋白质。
长链非编码RNALncRNA研究，读这篇文章就足够了！
长链⾮编码RNALncRNA研究，读这篇⽂章就⾜够了！1.认识⼀下长⾮编码RNA定义⾮编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)指不翻译成多肽的RNA。
按照长度不同，短于200nt的归为⼩⾮编码RNA (small ncRNAs，sncRNAs)，长于200nt的归为长⾮编码RNA (longncRNAs，lncRNAs)。
分类根据染⾊体上与编码基因的相对位置将lncRNA分为反义型(antisense lncRNAs)、内含⼦型(intronic lncRNAs)、反向型(divergent lncRNAs)、基因间型(intergenic lncRNAs)、启动⼦上游型(promoter upstream lncRNAs)、启动⼦型(promoter-associated lncRNAs)、转录起始位点型(transc ription start site-associated lncRNAs) [1, 2] (图1)。
图1. 根据染⾊体上与编码基因的相对位置对ncRNA进⾏分类。
lncRNAs作⽤范围⼴泛，机制⾮常复杂，这⾥从基因调控的⾓度重点讲⼀讲。
为了⽅便⼤家的理解，咱们来看看lncRNA的特点。
简单讲，lncRNA的本质是RNA，是由核苷酸组成的长链，有以下⼏个优势：(1) 可以轻松的与同源DNA序列(转录lncRNA的基因以及序列相似的基因)结合；(2) 可以轻松的与同源RNA序列结合；(3) 其丝带般的特点可以折叠成复杂的⼆级结构，轻松与多种蛋⽩质结合。
也就是说，lncRNA情商极⾼，与上层领导(DNA)关系暧昧，与同事(RNA)关系很铁，与下属(蛋⽩质)关系紧密。
这样⼋⾯玲珑的lncRNA那肯定是相当吃得开啊。
2.lncRNA参与转录前调控顾名思义，转录前调控就是对转录事件发⽣之前的准备阶段进⾏调控，主要指染⾊质开放或关闭状态的调控——想要使原来不转录的基因开启转录，就需要染⾊质从关闭状态转换为开放状态；想要使原来转录的基因不再转录，就需要染⾊质从开放状态转换为关闭状态。
外泌体lncRNA芯片研究方法及思路
外泌体lncRNA芯片研究方法及思路
一、技术简介
外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200 nm，形态也呈现出多样性。
长链非编码RNA（long non-coding RNA）是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。
近年来的研究表明lncRNA能在标贯遗传、转录及转录后水平上调控基因表达，参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治都有着密切联系。
lncRNA芯片对lncRNA进行功能研究也被更多的关注，通过设计不同的lncRNA探针，可以更加快速、高通量地筛选出疾病或特定生物学过程中差异表达的lncRNA和mRNA信息，最终找到lncRNA的靶基因位点深入分析调控机制。
二、测序流程：
1. RNA提取
2. 逆转录合成cDNA1链
3. 合成cDNA2链
4. 体外转录合成cRNA
5. 随机引物合成正义链DNA
6. DNA产物片段化
7. Cy3标记
8. 芯片杂交
9. 数据分析
三、数据分析
1. 芯片数据质控和标准化
2. 主成分分析
3.mRNA表达模式聚类分析
4. GO富集分析
5. KEGG富集分析
6. lncRNA表观模式聚类分析。
深度解密lncRNA研究策略及注意事项
lncRNA
circRNA
2
LncRNA 概述 ——lncRNA的发现
1980s-1990s: Individual lncRNAs are discovered through traditional gene mapping approaches, Xist and H19.
Early 2000s: Development of large scale cDNA sequencing leads to the discovery of a surprising number of lncRNA transcripts.
lncRNA的类别
Knauss and Sun, Neuroscience 2013
lncRNA研究策略
组织，细胞，外周血
lncRNA芯片
RNA-seq
难点
候选lncRNA
差异倍数大的 表达量高的 靶基因功能相关的 共表达网络中的hub 结合TF靶基因数据 结合不同分类
生物标志物
机制研究
• 高通量：包含88,371条circRNA，68,423条lncRNA、18,853条mRNA，让您的筛选范围更广； • 特异性高：环状RNA -特异的反向剪接位点探针设计，保证每个探针检测的特异性，避免与母基因之间的
冗余影响。基于circbase数据库信息;
LncRNA基本特点
• > 200nt • have little or no open reading
frame (ORF) • Polyadenylated are not necessary
(more than 40% of transcripts are non-polyadenylated) • Generally lower expressed than protein-coding genes • more tissue-specific expression patterns, with a large fraction of tissue-specific lncRNAs expressed in the brain. • general long ncRNAs lack strong conservation
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展随着近年来生物学研究的不断深入，越来越多的研究表明长链非编码RNA（lncRNA）在调控基因表达和参与疾病发生发展中起着至关重要的作用。
而作为调控因子的ceRNA（竞争性内源性RNA）也逐渐受到了研究者的关注。
本文将就lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展做一综述。
1. lncRNA作为ceRNA的机制近年来的研究发现，lncRNA作为ceRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。
lncRNA HULC（highly upregulated in liver cancer）可以通过竞争性结合miR-372来调控PRKACB 基因的表达，从而促进肝癌细胞的增殖和转移。
lncRNA MALAT1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1）也通过作为ceRNA来影响肿瘤细胞的增殖和转移。
这些研究表明，在肿瘤发生发展过程中，lncRNA作为ceRNA起着不可忽视的调控作用。
随着对lncRNA作为ceRNA调控机制的深入研究，其在疾病诊断和治疗中的临床应用前景也逐渐显现。
研究者可以通过分析患者组织中lncRNA-miRNA-mRNA网络的变化，对某些疾病进行更精准的诊断和治疗。
针对lncRNA-miRNA-mRNA网络中的关键分子，还可以开发相应的干预手段，如靶向药物或基因治疗，从而更好地干预疾病的发生和发展。
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展已经成为当前生物医学研究的热点之一。
随着对其机制的深入探索和临床应用前景的逐步明晰，相信lncRNA作为ceRNA的调控作用将为我们揭示更多疾病发生发展的新机制，并为疾病的诊断和治疗开辟新的途径。
期待未来在这一领域的研究能够取得更多重要的突破，为人类健康事业作出更大的贡献。
lncRNA研究策略与技术
lncRNA研究策略与技术研究背景：长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200 bp 以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究说明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等，图1所示。
随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。
图1. lncRNA参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示lncRNA锐博生物提供研究思路：差异lncRNA筛选的研究方法：案例解读：案例(一)RNA seq发现lincRNA1. 2011年，Rinn研究小组对24种组织样本进行RNA测序发现了8000多个人的lincRNAseq预测lincRNAlincRNA的数量及交集及用软件组装的结果2. lincRNA的表达具有组织特异性图3. lincRNA和mRNA在不同组织当中的表达情况案例(二)lncRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。
对64个肿瘤样品高通量测序，在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072新的lncRNA。
lncRNA表达谱分析案例(三)lncRNA表达谱芯片结合lncRNA-mRNA共表达网络筛选关键lncRNA第二军医大学的研究人员利用2/3肝部分切除(PH)小鼠在不同的时间点，针对肝脏再生过程进行了全基因组lncRNA芯片表达谱分析。
通过lncRNA和mRNA共表达网络分析找到了一个非常有意义的长链非编码RNA(lncRNA-LALR1)，并结合体内外实验证实在肝再生过程中lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-Catenin信号加速细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展【摘要】当前研究表明，长链非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源性RNA（ceRNA）在疾病中起着重要作用。
本文首先介绍了lncRNA在疾病中的功能及作用机制，然后探讨了ceRNA假说的提出与发展。
接着详细讨论了lncRNA作为ceRNA在癌症及其他疾病中的研究进展，以及ceRNA网络在疾病治疗中的应用。
结论部分展望了lncRNA作为ceRNA在疾病中的未来研究方向，以及ceRNA网络在疾病治疗中的潜在作用。
这些研究为揭示疾病发生发展机制和寻找新的治疗策略提供了重要的理论基础。
【关键词】lncRNA, ceRNA, 疾病, 研究进展, 功能, 作用机制, 癌症, ceRNA 网络, 治疗, 展望, 潜在作用, 未来研究方向1. 引言1.1 lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展长期以来，非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源RNA（ceRNA）在疾病中的作用机制逐渐受到重视。
ceRNA假说提出了一种全新的基因调控机制，即不同种类的RNA分子之间通过竞争结合共享的microRNA（miRNA）来调控彼此的表达。
在这一机制中，lncRNA作为ceRNA在疾病中扮演着重要角色。
研究表明，lncRNA作为ceRNA能够通过调控miRNA的活性，从而影响其靶基因的表达水平，进而参与调控细胞生长、分化、凋亡以及转移等生物学过程。
在癌症中，lncRNA作为ceRNA已被广泛研究，发现其在肿瘤发生、发展和预后中发挥着重要作用。
在其他疾病中，如心血管疾病、神经系统疾病、代谢性疾病等，lncRNA作为ceRNA的研究也逐渐展开。
2. 正文2.1 lncRNA在疾病中的功能及作用机制lncRNA在疾病中的功能主要包括调节基因表达。
通过与蛋白质或RNA相互作用，lncRNA能够调控转录因子的活性或稳定性，从而影响基因的表达水平。
lncRNA还可以调控染色质构象和DNA甲基化等表观遗传学调控机制，进而影响基因的表达。
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lncRNA研究策略与技术
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lncRNA研究策略与技术
研究背景：
长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200 bp 以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等，图1所示。
随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。
图1. lncRNA参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示lncRNA。
A.染色质重组 B.转录激活和抑制 C.蛋白抑制 D.转录后修饰 E.诱导分子
锐博生物提供研究思路：
差异lncRNA筛选的研究方法：
案例解读：
案例(一)RNA seq发现lincRNA
1. 2011年，Rinn研究小组对24种组织样本进行RNA测序发现了8000多个人的lincRNA
图2. A.利用RNA-seq预测lincRNA的流程图 B.多个参考数据库找到的lincRNA的数量及
交集及用软件组装的结果
2. lincRNA的表达具有组织特异性
图3. lincRNA和mRNA在不同组织当中的表达情况
案例(二)lncRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物
2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。
对64个肿瘤样品高通量测序，在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072新的lncRNA。
图4.肿瘤和对照样品lncRNA表达谱分析
案例(三)lncRNA表达谱芯片结合lncRNA-mRNA共表达网络筛选关键lncRNA
第二军医大学的研究人员利用2/3肝部分切除(PH)小鼠在不同的时间点，针对肝脏再生过程进行了全基因组lncRNA芯片表达谱分析。
通过lncRNA和mRNA共表达网络分析找到了一个非常有意义的长链非编码RNA(lncRNA-LALR1)，并结合体内外实验证实在肝再生过程中lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-Catenin信号加速细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。
因此采用药物干预靶向lncRNA-LALR1诱导肝脏再生，有可能有益于肝衰竭和肝移植治疗。
1. 表达谱芯片检测肝脏生长相关的lncRNA
图5. 表达谱芯片聚类分析小鼠肝脏2/3切除后 0，1.5，12和24小时1231个lncRNA和
3141个mRNA表达谱
2. KEGG pathway 分析与肝脏生长相关的信号通路
图6. Pathway 分析展示最相关的信号通路
3. 共表达网络分析找到关键的lncRNA-LALR1
图7. 部分共表达网络分析，包含22个基因，18个lncRNA(k-core=12), 4个mRNA(k-core=11 and degrees≥28)，位于中心位置的是lncRNA-LALR1
案例(四)lncRNA 功能研究
研究者对位于HOXA基因簇的5‘端启动子区域的非编码RNA HOTTIP进行了功能研究，研究证明HOTTIP可以增强HOXA的转录；对HOTTIP体内外的干扰研究发现HOTTIP在发育过程中起到重要作用，例如影响鸡远端骨的形成。
1. RT-PCR和FISH结果验证lncRNA HOTTIP的表达具有组织中特异性
图8. A.HOTTIP在人不同组织器官中的表达情况B. E13.5小鼠胚胎上HOTTIP的原位杂交2. 通过RNAi技术可以下调lncRNA HOTTIP的表达量
图9. A. 针对HOTTIP设计的siRNA可以下调HOTTIP基因及距离40 kb左右的编码基因HOXA13、HOXA11、HOXA10、HOXA9和HOXA7的表达量。
B.对HOTTIP基因的干扰不影响HOXD 基因和BID基因的表达
3. 动物实验验证HOTTIP干扰载体的表达可以影响HoxA基因的表达及骨质的形成。
图10. A. FISH结果显示HOTTIP干扰载体在鸡胚胎中的过表达影响HoxA基因的表达。
B. HOTTIP基因表达量的下降导致远端骨头变短。
参考文献
1. Wang KC, Yang YW, Liu B, et al. A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression. Nature.2011; 472(7341): 120–4.
2. Cabili MN, Trapnell C, Goff L, et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specificsubclasses. Genes Dev. 2011; 25(18): 1915–27.
3. Cheetham SW, Gruhl F, Mattick JS, et al. Long noncoding RNAs and the genetics of cancer. Br J Cancer. 2013; 108(12): 2419-25.
4. Brunner AL, Beck AH, Edris B, et al. Transcriptional profiling of long non–coding RNAs and novel transcribed regions across a diverse panel of archived human cancers. Genome Biol. 2012; 13(8): R7
5.
5. Xu D, Yang F, Yuan JH，et al. Long noncoding RNAs associated with liver regeneration 1 accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration by activating Wnt/β- Catenin signaling. Hepatology. 2013; 58(2): 739–51.。