深度解密lncRNA研究策略及注意事项
一文参透：lncrna研究思路、模式和数据库应用知识讲解
一文参透：l n c r n a研究思路、模式和数据库应用一文参透：lncRNA研究思路、模式和数据库应用...作者：解螺旋.老谈导语当很多小伙伴还徘徊在miRNA时，lncRNA已经横空出世，还没得来得及反应过来lncRNA到底是怎么回事时，circRNA又开始崭露头角了。
科研就是这样，你落后一步，便步步落后，跟娶媳妇生孩子是一样一样的。
说回正题，应部分解螺旋粉丝的要求，今天老谈帮大家整体梳理了曾经红极一时、目前热度不减的IncRNA的研究思路和模式以及相关工具，希望能对那些想在IncRNA研究上有所作为的小伙伴能助上一臂之力。
lncRNA研究思路IncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。
很多人看到lncRNA的热度还没有过去，经常会问老谈如果没有相关的工作基础，如何开始lncRNA的研究?今天我们就褪去虚伪外衣，研究的大方向是这样子的：1. 寻找到lncRNA分子2. lncRNA分子表型研究3. lncRNA 通过何种机制调节表型？老谈将这些研究方向及实验手段按层次的方式绘成流程图，如下所示：首先，是样本的准备与收集。
高质量的样本是实验结果具有可靠性的前提。
其次，是lncRNA检测。
可以先通过芯片的方式高通量筛选到目的基因，然后通过q-PCR或Northern blot的方法验证所得到的芯片结果。
再次，其研究方向根据研究目的而定。
如果是研究生物标志物，那么可以通过收集更多的临床样本，研究lncRNA对疾病的指示作用。
如果是研究其功能，则是研究其细胞表型、分子表型及机制。
小伙伴们是不是觉得这和miRNA的总体研究思路相似呢？这时可以根据各自的实验平台条件选择相应的研究。
值得注意的是，lncRNA的功能研究并不像miRNA一样通过3’UTR影响翻译套路，总的来说lncRNA机制研究套路还不成熟。
对于很多科研工作者而言，lncRNA分子的获得及其细胞表型的获得并非难事，关键在于如何进行下一步研究，这时候就要涉及到对功能研究的定位。
LncRNA的研究策略
lncRNA研究策略转载请注明来自丁香园发布日期：2012-09-21 14:47 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：RNA miRNA 技术专题锐博生物丁香通丁香园点击次数：34471、差异表达筛选通过lncRNA芯片或RNA-seq测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA 表达谱分析。
2、生物信息分析通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA 的靶基因。
3、细胞分子水平研究（1）功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体（2）功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响（3）可通过RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。
4、动物实验（1）构建移植瘤或原位瘤模型，转移模型（2）导入siRNA或者lncRNA表达质粒（3）检测肿瘤生长曲线（4）通过免疫组化、RT-PCR、Western Blot等方法检测相关指标变化。
小知识RNA-RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation)是一种高通量检测细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。
RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。
CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白的高通量测序方法。
方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针，把目标RNA拉下来以后，与其共同作用的DNA染色体片段就会附在到磁珠上，最后把染色体片段做高通量测序，这样会得到该RNA能够结合到在基因组的哪些区域；如果结合物是蛋白质，可以通过将蛋白质打断成短肽再通过质谱进行鉴定，从而或者与RNA结合的蛋白质。
lncRNA研究策略与技术
lncRNA研究策略与技术研究背景：长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200 bp 以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究说明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等，图1所示。
随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。
图1. lncRNA参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示lncRNA锐博生物提供研究思路：差异lncRNA筛选的研究方法：案例解读：案例(一)RNA seq发现lincRNA1. 2011年，Rinn研究小组对24种组织样本进行RNA测序发现了8000多个人的lincRNAseq预测lincRNAlincRNA的数量及交集及用软件组装的结果2. lincRNA的表达具有组织特异性图3. lincRNA和mRNA在不同组织当中的表达情况案例(二)lncRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。
对64个肿瘤样品高通量测序，在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072新的lncRNA。
lncRNA表达谱分析案例(三)lncRNA表达谱芯片结合lncRNA-mRNA共表达网络筛选关键lncRNA第二军医大学的研究人员利用2/3肝部分切除(PH)小鼠在不同的时间点，针对肝脏再生过程进行了全基因组lncRNA芯片表达谱分析。
通过lncRNA和mRNA共表达网络分析找到了一个非常有意义的长链非编码RNA(lncRNA-LALR1)，并结合体内外实验证实在肝再生过程中lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-Catenin信号加速细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。
lncRNA课题设计和方法探究
个人建议：目前做lncRNA最好加入部分表观遗传，因为表观遗传是热点， 基金项目每年接近300项，如：lncRNA启动子区域甲基化，组蛋白修饰，或 者用Cas9的方法进行敲出基因。
为什么作者选择lncRNA TCF7
在读这个文章的时候，我一直在思考这个问题，那样多的lncRNA ，为什么单单 选择了这个呢，个人认为存在的原因如下：1这三组对照细胞的RNA-SEQ ，结合 lncRNA分析，发现lncRNATCF7和调控的TCF7存在一致性。（牛B实验室，很有 钱，花钱如流水的实验室）2si rna小分子库针对筛选出来的差异性的lncRNA(同 样是牛B实验室所为） 3 屌丝做法：（1:查找文献，看看与表型发生一致的基因， 在该基因上下游去寻找关键的lncRNA;2确定几个差异性大的lncRNA，然后si 干 扰该lncRNA,表型做出来，然后寻找该lncRNA周围关键的基因，如果和si 后，存 在一致性，这个lncRNA就是我们要寻找的） TCF7在胚胎发育，肿瘤耐 药中，起到关键作用，作者 就是通过这种方法把两者建 立关系的。
细胞软琼脂克隆实验，以及原代细胞建立细胞系干扰lncRNATCF7，克隆 能力明显减弱，动物试验中，干扰以后，肿瘤的大小明显降低。 实验建议：先做表型，机制只要能解释表型， 论文就可以发表。
lncRNATCF7是肝癌干细胞保持更新所必须的
肿瘤研究中，一般干扰和过表达某一个基因都要独立进行实验的，接下来过表达 lncRNATCF7检测，检下图分别是检验过表达效率，过表达后，干性基因的RT和WB水 平检验，过表达lncRNATCF7后，干性基因的表达量明显的上调。
课题选择之研究方法
1：lncRNA结合转录因子，通过影响基因的启动子区域，调控基因的表达， 从而调控细胞的表型 ，这个实验最大的难点在于RIP技术，rna-pull-down 技术，这几个都是难度系数是9多的拦路虎，慎重进入
一文参透：lncrna研究思路、模式和大数据库应用
一文参透：lncRNA研究思路、模式和数据库应用...作者：解螺旋.老谈导语当很多小伙伴还徘徊在miRNA时，lncRNA已经横空出世，还没得来得及反应过来lncRNA到底是怎么回事时，circRNA 又开始崭露头角了。
科研就是这样，你落后一步，便步步落后，跟娶媳妇生孩子是一样一样的。
说回正题，应部分解螺旋粉丝的要求，今天老谈帮大家整体梳理了曾经红极一时、目前热度不减的IncRNA的研究思路和模式以及相关工具，希望能对那些想在IncRNA研究上有所作为的小伙伴能助上一臂之力。
lncRNA研究思路IncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。
很多人看到lncRNA的热度还没有过去，经常会问老谈如果没有相关的工作基础，如何开始lncRNA的研究?今天我们就褪去虚伪外衣，研究的大方向是这样子的：1. 寻找到lncRNA分子2. lncRNA分子表型研究3. lncRNA 通过何种机制调节表型？老谈将这些研究方向及实验手段按层次的方式绘成流程图，如下所示：首先，是样本的准备与收集。
高质量的样本是实验结果具有可靠性的前提。
其次，是lncRNA检测。
可以先通过芯片的方式高通量筛选到目的基因，然后通过q-PCR或Northern blot的方法验证所得到的芯片结果。
再次，其研究方向根据研究目的而定。
如果是研究生物标志物，那么可以通过收集更多的临床样本，研究lncRNA对疾病的指示作用。
如果是研究其功能，则是研究其细胞表型、分子表型及机制。
小伙伴们是不是觉得这和miRNA的总体研究思路相似呢？这时可以根据各自的实验平台条件选择相应的研究。
值得注意的是，lncRNA的功能研究并不像miRNA一样通过3’UTR影响翻译套路，总的来说lncRNA机制研究套路还不成熟。
对于很多科研工作者而言，lncRNA分子的获得及其细胞表型的获得并非难事，关键在于如何进行下一步研究，这时候就要涉及到对功能研究的定位。
探测长非编码RNA功能的研究策略
探测长非编码RNA功能的研究策略长非编码RNA（lncRNA）是一类超过200个核苷酸的RNA分子，没有编码蛋白质的能力，但在细胞中扮演着重要的调控角色。
研究lncRNA功能的策略主要包括以下几个方面：1. 高通量测序分析：利用RNA测序技术对lncRNA在不同组织和发育阶段的表达进行全面分析。
通过比较不同条件下lncRNA的表达变化，可以发现与特定生物过程或疾病相关的lncRNA。
2. lncRNA与DNA互作研究：采用染色质免疫共沉淀（ChIP）和DNase I超敏感性测定等技术，确定lncRNA与DNA之间的相互作用。
这些研究可以揭示lncRNA在染色质结构和基因转录调控中的功能。
3. lncRNA与蛋白质相互作用研究：运用RNA免疫沉淀（RIP）、RNA 结合蛋白质免疫共沉淀（RIP-Chip或RIP-Seq）和蛋白质质谱分析（MS）等技术，鉴定lncRNA与蛋白质之间的相互作用。
通过这些研究，可以发现lncRNA与转录因子、染色质修饰蛋白等的相互作用，揭示lncRNA在调控基因表达中的作用机制。
4. RNA干扰研究：采用RNA干扰技术或CRISPR-Cas9系统，通过敲除或过表达特定lncRNA，检验其对细胞功能和生理过程的影响。
同时，还可以利用CRISPR-Cas9系统对lncRNA进行定点突变，以研究lncRNA功能域和调控序列。
5. lncRNA亚细胞定位研究：利用细胞定位技术，如原位杂交、亚细胞分离等方法，研究lncRNA的亚细胞定位，进一步了解lncRNA的功能和调控机制。
6. 系统生物学方法：运用数学建模和计算模拟等系统生物学方法，研究lncRNA在细胞信号传导和调控网络中的作用。
通过结合基因表达数据和调控网络信息，可以预测和验证lncRNA的功能和调控机制。
总之，研究lncRNA功能的策略是多样化的，融合了实验和计算方法。
这些策略的综合应用将为我们进一步揭示lncRNA在基因表达调控和疾病发生机制中的重要作用提供重要的线索。
LncRNA的研究，读这一篇文章就足够了！
LncRNA的研究，读这一篇文章就足够了！1认识一下长非编码RNA 定义非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)指不翻译成多肽的RNA。
按照长度不同，短于200nt的归为小非编码RNA (small ncRNAs，sncRNAs)，长于200nt的归为长非编码RNA (long ncRNAs，lncRNAs)。
分类根据染色体上与编码基因的相对位置将lncRNA分为反义型(antisense lncRNAs)、内含子型(intronic lncRNAs)、反向型(divergent lncRNAs)、基因间型(intergenic lncRNAs)、启动子上游型(promoter upstream lncRNAs)、启动子型(promoter-associated lncRNAs)、转录起始位点型(transcription start site-associated lncRNAs) [1, 2] (图1)。
图1. 根据染色体上与编码基因的相对位置对ncRNA进行分类。
lncRNAs作用范围广泛，机制非常复杂，这里从基因调控的角度重点讲一讲。
为了方便大家的理解，咱们来看看lncRNA的特点。
简单讲，lncRNA的本质是RNA，是由核苷酸组成的长链，有以下几个优势：(1) 可以轻松的与同源DNA序列(转录lncRNA的基因以及序列相似的基因)结合；(2) 可以轻松的与同源RNA序列结合；(3) 其丝带般的特点可以折叠成复杂的二级结构，轻松与多种蛋白质结合。
也就是说，lncRNA情商极高，与上层领导(DNA)关系暧昧，与同事(RNA)关系很铁，与下属(蛋白质)关系紧密。
这样八面玲珑的lncRNA那肯定是相当吃得开啊。
2lncRNA参与转录前调控顾名思义，转录前调控就是对转录事件发生之前的准备阶段进行调控，主要指染色质开放或关闭状态的调控——想要使原来不转录的基因开启转录，就需要染色质从关闭状态转换为开放状态；想要使原来转录的基因不再转录，就需要染色质从开放状态转换为关闭状态。
lncrna研究方案
引言长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一类RNA分子，其长度通常超过200个核苷酸，并且不具备翻译成蛋白质的能力。
在过去的几年中，越来越多的研究表明lncRNA在调控基因表达、细胞生命周期以及疾病发生发展等方面起到重要的作用。
本文旨在介绍一种lncRNA的研究方案，包括实验设计、数据分析以及结果解读等方面。
实验设计样本采集首先，需要选择适当的样本进行研究。
根据研究目的和研究对象的不同，可以选择不同的样本来源，如细胞系、动物组织或者患者样本。
确保样本的来源和特性与研究问题相匹配。
RNA提取和测序在获得样本后，需要进行RNA的提取。
根据样本类型的不同，可以使用不同的方法进行RNA提取，如RNA提取试剂盒、酚/氯仿法等。
提取到的RNA质量和纯度需要进行评估，可以使用比色法、琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测。
提取到RNA后，可以选择不同的测序方法进行lncRNA的定量分析。
常见的测序方法包括转录组测序（RNA-Seq）和全长转录组测序（full-length transcriptome sequencing）等。
根据研究目的，选择合适的测序方法进行分析。
数据分析数据预处理在进行数据分析之前，需要对得到的测序数据进行预处理。
这一步骤包括去除低质量序列、去除接头序列、去除重复序列等。
常用的工具包括Trimmomatic、Cutadapt等。
数据比对和定量在预处理后，将得到的序列数据进行比对到参考基因组或转录组上。
选择合适的比对工具，如Bowtie、STAR等。
根据比对结果，可以对lncRNA进行定量分析，根据差异表达水平进行筛选。
功能分析对于不同表达的lncRNA，可以进行生物学功能的分析。
根据研究问题，可以选择不同的功能分析方法，如通路富集分析、功能注释等。
常用的工具包括GSEA、DAVID等。
结果解读根据上述的分析，可以得到不同lncRNA的表达差异结果，并进行生物学功能解读。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
lncRNA
circRNA
2
LncRNA 概述 ——lncRNA的发现
1980s-1990s: Individual lncRNAs are discovered through traditional gene mapping approaches, Xist and H19.
Early 2000s: Development of large scale cDNA sequencing leads to the discovery of a surprising number of lncRNA transcripts.
lncRNA的类别
Knauss and Sun, Neuroscience 2013
lncRNA研究策略
组织，细胞，外周血
lncRNA芯片
RNA-seq
难点
候选lncRNA
差异倍数大的 表达量高的 靶基因功能相关的 共表达网络中的hub 结合TF靶基因数据 结合不同分类
生物标志物
机制研究
• 高通量：包含88,371条circRNA，68,423条lncRNA、18,853条mRNA，让您的筛选范围更广； • 特异性高：环状RNA -特异的反向剪接位点探针设计，保证每个探针检测的特异性，避免与母基因之间的
冗余影响。基于circbase数据库信息;
LncRNA基本特点
• > 200nt • have little or no open reading
frame (ORF) • Polyadenylated are not necessary
(more than 40% of transcripts are non-polyadenylated) • Generally lower expressed than protein-coding genes • more tissue-specific expression patterns, with a large fraction of tissue-specific lncRNAs expressed in the brain. • general long ncRNAs lack strong conservation
技术特点： 1）芯片采用Agilent eArray平台设计，使 用Agilent SurePrint技术合成，探针长 60mer，检出率高，技术重复性高于99%； 2）覆盖主流数据库几乎所有lncRNA和 mRNA，可同时检测lncRNA和mRNA， 并挖掘两者之间的关联； 3）随机引物扩增方式，可同时扩增带 Ploy-A和不带Poly-A的lncRNA，
训练集 验证集 生存分析 ROC曲线
沉默/过表达---功能实验 RIP-seq， pull down ChIP-seq
上海伯豪lncRNA芯片服务（Agilent 平台）
上海伯豪针对广大客户的需求，开发出 全新的SBC-lncRNA芯片，并利用 Agilent公司专利的SurePrint技术制 造。为您提供完善的基因芯片技术服务， 并完成数据分析，提供完整的实验报告。
深度解密lncRNA研究策略及注意事项
张晓娜 上海伯豪生物技术有限公司
共表达网络构建
高通量转录组检测对象
RNA transcripts
Protein-coding RNA(mRNA)
Non-coding RNA(非编码RNA)
Regulatory RNAs
Housekeeping RNAs
miБайду номын сангаасroRNA
上海伯豪lncRNA相关芯片服务
SBC V6版LncRNA芯片，探针合成基于Agilent SurePrint技术，收录的lncRNA涵盖 几大主流数据库（NCBI, UCSC, Ensembl，Gencode，Lncipedia，Noncode）， 助力您的科研工作！
ClariomTM D是昂飞公司最新开发的芯片，为您提供支持所有转录本异构体的全转录组 分析。同时，针对超过540,000个转录本的探针设计，还可帮助您对非编码RNA进行 分析。
技术重复性高于99%；利用芯片碱基互补杂交的方式，能够对整体表达丰度较低的circRNA更灵敏、稳定地 进行检测;
• 超值：覆盖circRNA、lncRNA、mRNA。一份芯片数据同时提供三个层面的表达信息，circRNA和lncRNA
作为典型的内源竞争性RNA，此款芯片可以让您畅游ceRNA调控研究; 。挑战性样本（血清、血浆、外泌体） 同样适用;
lncRNA同时在细胞核和细胞质内发挥功能 http://www.rikenresearch.riken.jp/eng/frontline/5920
lncRNA的功能
Magdalena Losko, Jerzy Kotlinowski, and Jolanta Jura, 2016, Mediators of Inflammation
Mid 2000s: The number of predicted genes in the mammalian genome goes down and the number of detected lncRNA transcripts increases exponentially.
国自然资助lncRNA项目数量逐年上升
产品
lncRNA
SBC lncRNA V6 77,127
mRNA 18,854 (RefSeq)
Human
ClariomTM D (Affymetrix）
SBC lncRNA V6
32,973 58,953
18,818 20,146 (RefSeq)
Mouse
ClariomTM D （Affymetrix）
SBC lncRNA V6
~40,000 23,259
~20,000 16,623 (RefSeq)
Rat
ClariomTM D
~25,000
（Affymetrix）
~20,000
SBC human ceRNA 芯片v1
技术优势：
• 稳定：芯片采用Agilent eArray平台设计，使用Agilent SurePrint技术合成，探针长60mer，检出率高，