雷公藤甲素降低肝移植大鼠急性排斥反应的实验研究

雷公藤甲素降低肝移植大鼠急性排斥反应的实验研究【摘要】目的：观察雷公藤甲素（TPL）对大鼠原位肝移植急性排斥反应的影响。

方法：建立大鼠原位肝移植模型，共60只，随机分为对照组、环孢素A（CsA）组及TPL组。

对照组口服生理盐水2 mL/d，CsA组腹腔注射CsA 10 mg/（kg?d），TPL组口服灌胃TPL 20 mg/（kg?d），连续灌胃7 d后每组各处死大鼠10只，测定血清生化指标与细胞因子水平。

观察肝脏病变情况，计算肝组织排斥活动指数（RAI）。

观察各组未处死大鼠的生存期。

结果：术后1周，CsA组及TPL组大鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-2和IFN-γ水平均低于对照组（P<0.05）。

对照组肝组织标本均呈现重度排斥反应；CsA组及TPL组分别有3、4例标本呈重度排斥反应，其余均为中度排斥反应。

CsA组、TPL组RAI均明显低于对照组（P<0.05）；术后CsA组及TPL组存活期长于对照组（P <0.05）。

结论：TPL可减轻大鼠肝移植急性排斥反应，延长模型大鼠生存期。

【关键词】雷公藤甲素；肝移植；排斥反应【中图分类号】R-332 【文献标识码】A 【文章编号】1004-6194（2015）01-0107-02近年来的临床实践表明，肝脏移植是治疗终末期肝病的最有效手段，但肝移植后机体的急性排斥反应发生率较高[1]。

急性排斥反应是早期移植缺失的重要原因，也是严重影响受体肝移植后长期生存的危险因素[2]。

因此，肝移植急性排斥反应的治疗已经成为目前临床面临的重要问题。

雷公藤甲素（triptolide，TPL）是中药雷公藤主要的有效成分，近年来研究发现，TP具有很强的免疫抑制作用，能够显著抑制大鼠肾脏移植的急性排斥反应[3,4]。

我们于2013年1~3月观察了TP对对大鼠肝移植急性排斥反应的影响，现报告如下。

1 材料与方法1.1 材料TPL（纯度>98%）与环孢素A（CsA，纯度>99%）均购自上海高科生物工程有限公司。

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、等试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司。

DA与Lewis大鼠（清洁级）60只，雄性，体重为200-280 g，购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 实验方法以雄性DA大鼠为供体，Lewis大鼠为受体，采用改良的“二袖套法”建立原位肝移植模型[5]。

造模成功后，随机分为对照组、CsA组及TPL组各20只。

对照组予生理盐水灌胃，2mL/d；CsA组腹腔注射CsA 10 mg/（kg?d），TPL组口服灌胃TPL20 mg（kg?d），连续7 d。

1.3 生化指标与细胞因子测定肝移植7 d后，大鼠经水合氯醛麻醉，每组随机处死10只，取下腔静脉血，利用全自动生化分析仪测定血清ALT与AST浓度，ELISA法检测血清TNF-α、IL-2、IFN-γ水平。

1.4 急性排斥反应指数（RAI）取肝移植受体大鼠的肝组织进行蜡块切片，观察肝组织病理学变化。

RAI评分标准参照Banff分级标准[6]，总分为9分，<3分为非确定型急性排斥反应，3~5分为轻度急性排斥反应，5~7分为中度急性排斥反应，7~9分为重度急性排斥反应。

1.5 存活期观察观察未处死的肝移植受体大鼠术后存活情况，统计存活时间。

1.6 统计学方法采用SPSS 17.0进行统计学处理。

两组样本均数间比较采用t检验，多组间采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 血清生化指标与细胞因子水平术后1周CsA组及大黄酸组血清ALT、AST、TNF-α、IL-2和IFN-γ水平均低于对照组（P<0.05），CsA组与大黄酸组上述指标比较无统计学差异（P>0.05），见表1。

表1 各组血清ALT、AST、TNF-α、IL-2、IFN-γ水平比较组别 ALT（U/L）AST（U/L）TNF-α（U/mL）IL-2（pg/mL）IFN-γ（pg/mL）对照组589±42 749±98 79±8 150±27 86±7CsA组321±52* 406±62* 46±9* 80±22*50±8*TPL组291±49* 425±52* 52±4* 93±26* 48±7*注：与对照组相比，*P<0.052.2 RAI评分术后1周，对照组肝组织出现重度肝静脉、门静脉内皮炎，胆管炎及肝细胞坏死，为重度排斥反应。

CsA组及TPL组分别有2、3例呈现重度排斥反应，余均为中度排斥反应，病理切片见中度肝静脉、门静脉内皮炎、胆管炎。

对照组、CsA组及TPL组RAI分别为（7.8±0.7）、（5.4±0.9）、（5.3±1.0）分，CsA组及TPL组均低于对照组（P <0.05），CsA组与大黄酸TPL组比较无统计学差异（P>0.05）。

2.3 存活期肝移植术后对照组、CsA组及TPL组存活期分别为（11.5±2.9）、（15.2±2.5）、（16.2±3.0）d，CsA组及大黄酸组均明显长于对照组（P<0.05），CsA组与大黄酸组比较无统计学差异（P>0.05）。

3 讨论TPL是雷公藤的主要有效成分之一。

现代药理研究证明，TPL具有抗肿瘤、降血糖、抗炎、免疫抑制等药理作用[3,4]。

近年来的研究发现，TPL能够降低肾移植大鼠的免疫排斥反应以及减少肝脏再灌流损伤。

本研究结果表明，TPL能够减轻大鼠肝移植急性排斥反应（降低AST、ALT与TNF-α、IL-2和IFN-γ水平），缓解肝脏病变（降低RAI评分），延长模型大鼠生存期，效果与CsA相近。

近交系DA→Lewis大鼠肝移植模型是研究肝移植术后急性排斥反应的理想模型[5]。

本研究结果发现，肝移植术后第8天对照组发生重度急性排斥反应，大鼠存活期较短，而CsA组与大黄酸组存活期长于对照组，RAI低于对照组，CsA组与大黄酸组上述指标比较差异无统计学意义。

血清ALT与AST是反映肝细胞损伤的敏感指标[7]。

肝移植大鼠发生严重急性排斥反应时，会导致血清上述指标水平异常升高，因此，血清ALT与AST在一定程度上反映大鼠肝移植急性排斥反应的程度。

细胞因子是调节机体免疫的重要因素[8]。

TNF-α能够协调炎症反应，刺激抗原呈递细胞的迁移和成熟。

IL-2能与T细胞表面的IL-2受体结合，促进T细胞活化与增殖。

IFN-γ由免疫系统中的T细胞和NK细胞产生，可反应机体的免疫状态。

而肝移植后TNF-α、IL-2、IFN-γ水平升高被认为是介导肝移植后排斥反应、肝细胞凋亡的重要因素[10]。

本研究发现，CsA组及本研究发现，CsA组及TPL组的血清ALT、AST与ITNF-α、IL-2、IFN-γ水平均低于对照组，进一步说明TPL能够降低肝移植急性排斥反应。

综上所述，TPL可有效减轻肝移植大鼠的急性排斥反应，延长模型大鼠存活期，但是，其具体作用机制以及临床应用价值尚需进一步研究与探讨。

参考文献：[1]侍阳, 宋庆伟, 于生才, 等. 大黄酸对肝移植大鼠急性排斥反应的影响[J]. 山东医药,54(46): 30-32.[2]Yilmaz F, Aydin U, Nart D, et al. The incidence and management of acute and chronic rejection after living donor liver transplantation [J]. Transplant Proc, 2006, 38(5): 1435-1437.[3]杨向竹, 赵俊云, 崔向青,等. 黄芪糖蛋白、雷公藤甲素、雷帕霉素和氢化考的松体外免疫抑制作用的比较研究[J]. 中华中医药杂志, 2011, 26(10): 2411-2414.[4]王中华. 雷公藤甲素对肺癌 A549/DDP 细胞多药耐药的逆转作用及机制[J]. 中国现代应用药学, 2014, 31(1): 28-31.[5]陈志红,钱海鑫,秦磊, 等. 大鼠原位肝移植急性排斥模型的建立及论证[J]. 江苏医药, 2012, 38(13): 1503-1506.[6]An International Panel. Banff schema for grading liver allograft rejection: An international consensus document [J]. Hepatology, 1997, 25(3): 658-663.[7]谈景旺, 张绍庚, 江艺, 等. 异种肝移植急性排斥反应中细胞凋亡的研究[J]. 中国普通外科杂志, 2002, 11(1): 33-36.[8]Arranz J, Soriano A, Garcia I, et al. Effect of proinflammatory cytokines (IL-6, TNF-alpha, IL-1beta) on hemodynamic performance during orthotopic liver transplantation [J]. Transplant Proc, 2003, 35(5): 1884-1887通讯作者：侍阳，副教授，副主任医师基金项目：徐州市科技计划项目（XM09B092）。