醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
高耐受性醋酸菌的筛选及发酵特性研究
高耐受性醋酸菌的筛选及发酵特性研究陈洋;汪超;高冰;李冬生;徐宁;胡勇【摘要】从工业醋醅中分离出5株耐乙醇、耐高温的产醋酸菌株,利用生理生化试验和16S rDNA同源序列分析,初步认定其为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus).通过对其耐乙醇、耐高温发酵特性的研究,发现菌株FY4可耐受体积分数为12％的乙醇和43℃高温,在30℃和体积分数10％乙醇条件下产酸量达到最高,为61.2 g/L.在10L发酵罐试验中,菌株FY4的产酸量始终高于醋酸菌AS1.41,在37℃和体积分数10％乙醇条件下,菌株FY4产酸量达到42.2 g/L,而在此条件下工业菌株AS1.41几乎停止产酸.结果表明菌株FY4具有高耐受性,可产生大量的醋酸,在工业生产中具有潜在应用价值.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2015(034)012【总页数】6页(P28-33)【关键词】巴氏醋杆菌;耐高温;耐乙醇;筛选;深层发酵【作者】陈洋;汪超;高冰;李冬生;徐宁;胡勇【作者单位】湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068【正文语种】中文【中图分类】TS264.2醋酸杆菌属（Acetobacter）和葡萄糖氧化杆菌属（G1uconobocter）是较为常用的醋酸菌属，前者主要将酒精氧化为醋酸，用于酿醋工业，后者主要将葡萄糖氧化为葡萄糖酸［1-3］。
藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离纯化与鉴定
藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离纯化与鉴定曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩【摘要】One Acetobacter strain, FJAT-13797, was isolated from Tibetan kefir. The image under scanning electronic microscope showed that the bacterium was rod-shaped with round ends, and presented in single or pairs without spores. The strain showed the bio-chemical properties of Acetobacter spp. The 16S rDNA sequence analysis indicated that the strain, FJAT-13797, belonged to Acetobacter orientalis.%从藏灵菇中分离出醋酸菌株FJAT-13797,利用形态学观察、生理生化和16S rDNA方法对其进行细菌学鉴定,菌体形态为圆端直杆,单个或成对,无芽孢,其生理生化特征与醋杆菌属(Acetobacter)基本一致.经16S rDNA基因序列同源性比较和系统发育分析,菌株FJAT-13797鉴定为东方醋酸菌(Acetobacter orientalis).【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2012(027)012【总页数】4页(P1339-1342)【关键词】藏灵菇;鉴定;醋酸杆菌;东方醋酸菌【作者】曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩【作者单位】福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】TS252藏灵菇是一种乳白色、胶质状的块状物（由微生物产生的胞外多糖与乳蛋白聚合而成），外形酷似米粒，上面栖息着多种微生物，长期在牛奶中培养，个体会增大很多，形状如盛开的雪莲，有人称之为“西藏雪莲”［1－3］。
醋酸菌分离及鉴定
醋酸菌分离及鉴定一、培养基1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌后培养基温度降到75 ℃左右时加入。
2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5%（体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。
3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。
二、醋酸菌分离纯化流程样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管保藏→产醋酸定性测试。
三、步骤1 、菌株分离取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。
取10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。
选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中，30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。
2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面，4℃冰箱保存。
3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极其相似的菌株归为一大类。
4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上混匀后得到菌悬液。
四、鉴定1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。
2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。
醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
醋酸菌
葡萄酒与醋酸菌梁曼发酵工程2011050783摘要：葡萄酒是一种成分复杂的胶体溶液，从葡萄汁酿成葡萄酒以后，不管是在酒厂的贮藏阶段，还是装瓶以后，它总是在一刻不停地变化着。
由于各种微生物在葡萄酒中的生长繁殖，使得葡萄酒失去了原有的风味，这种现象称为葡萄酒的病害。
在酿酒学领域，醋酸菌几乎不受关注，可能是因为醋酸菌是严格好氧菌，因此人们认为该类菌在葡萄酒中不能生存，除了葡萄酒表面能够永久的与空气接触。
醋酸菌是葡萄酒酿造中的大敌。
凡是有酒花生长之处，就有醋酸菌在一起繁殖；一旦条件具备，会迅速把酒精氧化变成醋酸，使葡萄酒产生醋酸气味，有刺舌感，严重破坏酒质。
在发酵过程中，可通过合理措施来防治醋酸菌的污染。
关键词：醋酸菌；醋酸菌污染；防治措施1葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌1.1醋酸菌的分类醋酸菌是能够将酒精氧化成醋酸的一类微生物的总称。
醋酸菌是多种形态，细胞椭圆到杆状，0.5-0.8×0.9-4.2微米。
单个，成对或成链，不形成孢子。
革兰氏染色阴性。
醋酸菌是专性好氧菌。
有的醋酸菌不会运动，也有具极生或周生鞭毛的运动型。
醋酸菌被分为醋杆菌属（Acetobacter）、酸单胞菌属(Acidomonas)、葡糖醋杆菌（Gluconobacter）、葡糖酸醋酸杆菌（Gluconacetobacter）( Ruiz et al., 2000)。
其中关于各属醋酸菌间的不同（表1），主要区别是葡糖杆菌不能将乙醇最终氧化生成CO2和H2O，而其他属均可。
1.2与葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌与葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌一般有下列几种：氧化葡糖杆菌、纹膜醋杆菌、巴士醋杆菌、Gluconacetobacter liquefaciens（原来一直被认作是液化醋杆菌）、Gluconacetobacter hansenii（以前一直被认作汉生醋杆菌）。
在未损坏葡萄上发现的醋酸菌主要是氧化葡糖杆菌，菌体数量一般为102-105cells/mL( Du Toit and Lambrechts, 2002)。
提升耐高酸醋酸菌发酵酸度的工艺研究
提升耐高酸醋酸菌发酵酸度的工艺研究摘要醋酸菌是一种耐高酸的微生物，其发酵醋酸的能力受到酸度的影响。
本研究旨在提升醋酸菌的耐酸性以增加其发酵酸度。
通过对不同酸度环境下醋酸菌生长的观察，筛选出对醋酸菌具有促进生长的酸性条件。
采用基因工程技术将耐酸菌株与常规醋酸菌株进行交叉配对，获得耐高酸的新菌株。
通过调整发酵条件中的pH值、温度和氧气含量，进一步提高醋酸菌发酵酸度。
结果表明，在pH 3.5-4.0、温度34-37℃和适度的氧气含量条件下，新菌株能够达到更高的酸度。
这项研究对于醋酸菌发酵酸度的提升具有重要意义，并为醋酸菌的工业生产提供了理论基础。
关键词：醋酸菌；耐酸性；发酵酸度；基因工程；pH值1. 引言醋酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，其主要功能是通过发酵过程将酒精转化为醋酸。
醋酸是一种重要的有机化合物，在食品工业、制药工业和化学工业中有广泛的应用。
醋酸菌的发酵能力受到酸度的影响。
常规醋酸菌在酸度较高的环境下生长缓慢，发酵酸度也较低。
提升醋酸菌的耐酸性对于增加发酵酸度具有重要意义。
2. 材料与方法2.1 醋酸菌株的筛选本研究从自然环境中采集多个醋酸菌的菌株，并通过在不同pH值条件下的培养观察菌株的生长情况。
酸度小于4的培养基被认为是对醋酸菌生长有促进作用的酸性条件。
选取耐酸性较强的醋酸菌株与常规醋酸菌株进行交叉配对，利用基因工程技术将耐酸性基因转化到常规醋酸菌株中。
通过PCR和酶切等技术对基因转化的醋酸菌株进行鉴定。
2.3 发酵条件的优化为了进一步提高醋酸菌的发酵酸度，需要对发酵条件进行优化。
我们通过调整发酵条件中的pH值、温度和氧气含量来寻找最适合醋酸菌生长和发酵的条件。
3. 结果与讨论通过筛选出对醋酸菌生长有促进作用的酸性条件，我们发现在pH 3.5-4.0的环境下，醋酸菌的生长速率明显增加。
通过基因工程技术获得的新菌株具有更强的耐酸性，能够在更高酸度的环境下生存和发酵。
通过对发酵条件的优化，我们发现在温度为34-37℃和适度的氧气含量条件下，新菌株的发酵酸度较高。
苹果醋发酵用醋酸杆菌的筛选与鉴定
苹果醋发酵用醋酸杆菌的筛选与鉴定李华敏;李林;黄萍萍;刘文丽;潘敏;庄若茹【摘要】近年来,苹果醋逐渐兴起,但是目前用于苹果醋生产的醋酸菌还存在着各种各样的不足,因此有必要进一步筛选产酸性能好、适应苹果醋发酵的醋酸菌.该研究从自然发酵的苹果醋和苹果园土壤中筛选到19株醋酸菌,菌株YT06,YT10,YT12,YT14和YT17的产酸能力较好,在乙醇浓度为6％时产酸量最大,其中菌株YT17在第8天时产酸量达到27.91 g/L;对这5株菌进行分子生物学鉴定,发现按照亲缘关系分属于3个种:桃醋酸杆菌(Acetobacter persici):YT06;苹果醋杆菌(Acetobacter malorum):YT12,YT14;芝庇侬醋杆菌(Acetobacter cibinongensis):YT10,YT17.【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2018(043)010【总页数】5页(P22-25,36)【关键词】醋酸杆菌;苹果醋;筛选;鉴定【作者】李华敏;李林;黄萍萍;刘文丽;潘敏;庄若茹【作者单位】鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;烟台市粮油质量检测中心,山东烟台 265301;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025【正文语种】中文【中图分类】TS264.22果醋是以水果(包括苹果、葡萄、梨、猕猴桃、柑橘、柿子等)为主要原料，利用酵母菌和醋酸杆菌二次发酵酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品，其兼具水果和食醋的营养保健性能，有着巨大的市场潜力[1-3]。
在众多果醋中，苹果醋具有苹果果香，因其富含醋酸、苹果酸、琥珀酸和氨基酸等而使醋的风味独特、酸味适度，同时苹果资源丰富，苹果醋生产工艺简单，使其成为市场占有率最高的果醋产品[4-7]。
醋酸菌在发酵食品工业中的应用
醋酸菌在酿醋工业中的应用摘要:食醋的生产在我国历史悠久。
大江南北, 长城内外不乏名醋。
镇江香醋、山西老陈醋、福建红曲醋、辽宁喀左陈醋等几大名醋名播华夏, 行销海内外, 颇受欢迎。
关键词:醋酸菌、名醋、工艺特点、应用从古至今, 食醋一直是人们饮食生活中不可或缺的调味品.古籍《周礼·天官》、《荀子正名》、《隋书酷吏传》中对其均有描述, 而《本草钢目》中则记叙了它的药效作用。
随着科学技术的发展, 社会的不断进步及人们对饮食结构合理性的认识提高, 食醋在消费者心目中的地位不断得到加强, 醋不仅仅是作为一种调味品被食用, 更重要的是对它的食疗和保健功效的关注。
例如, 它能促进人体胃液分泌, 恢复疲劳, 预防高血压, 降低体内过氧化脂质和血液中乙醇浓度, 另外, 还有增强肝脏机能、防治肥胖、美容护肤等功能。
因此, 食醋的销量逐年递增, 新产品层出不穷, 具有十分诱人的开发前景。
1 醋酸发酵的两种不同产品就现阶段醋酸发酵的现状, 醋酸发酵应区分为两大类, 即食醋工业发酵和醋酸工业发酵。
虽然两类发酵的原理相同, 均是在醋酸发酵阶段以酒精为基质, 醋酸菌参与产物的生成, 但两者又有许多不同之处。
从发酵终产物组成来讲, 食醋发酵的产物是以醋酸为主, 以乳酸、琥珀酸、苹果酸、延胡索酸等有机酸为辅、多菌种参与发酵而形成醋香味突出, 具有酸、香、绵、甜特色的终产物。
并且根据所用菌种的不同, 形成的食醋典型风格各异, 醋酸工业发酵是以单一纯菌种或酶制剂参与发酵, 单纯追求醋酸得率而不考虑其风味的醋酸发酵。
这种工艺具有产品纯度高、酸度高的特点。
从发酵方式来讲, 食醋发酵以固态发酵和固液结合两种方式为主, 而后者不只是液体深层发酵工艺, 还有七十年代发展起来并不断完善的固定化细胞发酵方法。
从终产物的提取方法来讲, 食醋是水浸套淋或分离, 没有提纯工序, 后者则是靠精馏、恒沸脱水蒸馏、萃取等几种方法提取纯化。
食醋的色泽由于工艺不同, 呈无色、黑色或棕色, 而后者提取纯化后的产品则无色透明2 食醋发酵工艺现状我国的食醋酿造工艺大体上分为固态法酿醋工艺、液态法酿醋工艺和固液结合酿造工艺。
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第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属［30］，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6〜0.8 X.0〜3.0 ym。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长［31］。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类［32］。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1a表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱PYX-250S-A长沙科技双目生物显微镜BME (BA/E3 ) 科力仪器分析天平BS224S德国来卡手提式不锈钢蒸汽灭菌锅DSX-280B北京化丰超净工作台SW-CJ-1FD上海南鹏精密数子式酸度计PHS-3C上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇（95%）、CaC03、（NH4）2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4 7H2O、FeCb、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2 培养基[33-37]表2.2.1. b培养基成分表Tab 2.2.1. b Medium composition名称踰糖酵母膏无水乙醇（v/v）琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保臧培养基1%1%1%pH自然改进后的斜面液体⑸保臧培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5Horyer-Frateur 培养⑺基3%pH自然⑻GYC 培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼冋糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%产5-酮基葡萄糖酸(11) 土卜拉K甘^培口养基3%1%2%2%pH自然(12)i\7亦公* -H-"1%1%2%乙酸钙1% pH 氧化乙酸培养基7.2乳酸钙2%(13) 氧化乳酸培养基1%1%2%pH7.0-7.2乙醇培养基1%3%2%pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30 C培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有（NH4）2SO40.1% , K2HPO40.1% , KH2PO40. 01% , 0.025% , FeCb0. 0005% ;以上培养基均以121C 灭菌20 min。
2.2.3醋酸菌的分离纯化2.2.3.1分离纯化实验称取醋醅样品5g,液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8, 涂布在分离培养基上，培养2d 后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。
连续在平板上培养3 次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈又大又清晰的单菌落，转接并保藏于4C的冰箱。
2.2.3.2 革兰氏染色实验将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24 h,制作水晶镜片进行革兰氏染色。
2.2.3.3 产醋酸定性实验[38]取活化好的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3% (v/v) 的无水乙醇，32C 震荡培养60 h,取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液(2.5 mol/L) 调节pH至7.0,加入5~6滴5% FeC3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。
根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌[39] 为醋酸菌。
2.2.3.4 醋酸定量实验经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32C、140 r/min恒温震荡培养60 h后，检测其发酵液中总酸，每株平行3组。
醋酸定量测定[40]：精确吸取发酵液2 mL至250 mL三角瓶中，并加入蒸馏水50 mL，滴加1~2 滴0.5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定至微粉色。
产酸量(g/L) = (V-V 0) >C NaOH >60/样品毫升数；式中：V=发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；V0=以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数；C NaOH=NaOH 溶液的浓度(mol/L)；60 为醋酸分子量。
2.2.3.5 耐酒精能力实验初筛所得的菌株，分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养，无水乙醇体积分数从5%到14%，每个梯度相差1%，32E恒温培养3d，观察其是否生长，筛选出耐酒精性能好的菌株。
2.2.3.6 传代稳定性实验[41]将上述所筛选出的菌株，每隔一个月，转接纯化后的菌株，连续转接培养7 代，并测定其酸度，来判断、筛选，传代最稳定和产醋酸最高的菌株。
2.2.3.7 不同保藏方法保藏醋酸菌的存活期限实验[43]将传代相对稳定性的菌株，分别按照培养基 2.2.2中的⑶、⑷、⑸转接，待斜面上菌苔丰厚，保藏于2C〜4C的冰箱内，每隔三个月再次转接，并观察其存活情况。
2.2.4 菌种鉴定实验[44-45]2.2.4.1 培养实验观察通过平板培养，观察菌落形态特征，并挑取单个菌落制做水晶片，革兰氏染色，同时在1000 倍光学显微镜下观察其细胞形态、大小和排列特征。
2.2.4.2 培养特征实验⑴观察所选菌株在平板上培养的情况；⑵观察所选菌株是否能在高糖培养基上生长；⑶观察所选菌株是否能在Hoyer-Frateur 培养基上生长。
2.2.4.3 生理生化实验[46]⑴接触酶的试验：在长势旺盛的平板上，滴加3%的H2O2，观察有无气泡产生。
⑵以铵盐为唯一氮源的生长试验：观察在培养基2.2.2中⑺中生长情况。
⑶GYC培养基产色素试验：观察在培养基2.2.2中⑻上能否生成棕色的水溶性色素。
⑷生酮试验(甘油生成二羟丙酮的试验)：在培养基2.2.2中⑽上，将费林液注满平板，观察菌落周围是否有红色沉淀出现。
⑸产5- 酮基葡萄糖酸盐试验：在培养基2.2.2中(11)上，32T培养24 h后,观察菌落周围是否有白色不透圈。
⑹葡萄糖产酸试验：观察培养基指示剂是否变色。
⑺产纤维素试验：在含糖培养基上向菌落上滴加Lugol 碘液和60%硫酸液，观察菌落周围变化情况。
⑻氧化乙酸的能力试验：在培养基222中(12)上，32C培养48 h，观察菌落周围是否出现乳白色的晕圈。
⑼氧化乳酸的力试验：在培养基2.2.2中(13)上，32T培养48 h,观察菌落周是否出现乳白色的晕圈。
⑽在以乙醇为唯一碳源的培养基上，观察其能否生长。
2.2.5 发酵条件实验⑴发酵温度单因素实验以培养温度为梯度，26C、28C、30C、32C、34C、36C，将筛选所得的菌种，分别接种于装有100mL 醋酸菌发酵培养基的500mL 三角瓶中，置于180r/min的恒温摇床培养72h，以产酸量和醋酸菌数来确定最佳生长条件。
⑵将筛选所得的菌种，分别接种于分离平板上，观察出现透明圈的时间，确定最快产酸时间。
2.3 结果与分析2.3.1 分离筛选⑴分离纯化：从分离平板中挑选出107个单菌落菌株。
⑵初步筛选：通过醋酸菌分离培养基筛选，选出44个单菌落产酸菌株。
⑶复筛：又经革兰氏染色和醋酸定性试验，淘汰了革兰阳性及不产醋酸的菌株，选出4 株醋酸菌株。
⑷产酸定量试验，筛选出产酸量大最快的菌株，结果见下图 2.3.2 .A图2.3.1.A 4株醋酸菌产酸量测定Fig 2.3.1.A Four stra ins in determ in ati on of acid acetic acid bacteria⑸耐酒精能力试验，筛选出耐酒精性能好菌株，结果见下图2.3.2.B图2.3.1.B 4株醋酸菌耐酒精测定Fig 2.3.1.B 4 of acetic acid bacteria resista nt to alcohol determ in ati on⑹然后继续对2株性能较好菌株进行传代培养，确定其传代的稳定性。
每代产酸量见下表2.3.1a表2.3.1.a 4珠醋酸菌传代培养每代产醋酸的测定(g/L)Tab 2.3.1.a 4 strains acetic acid bacteria in each generation nestin)cultivati ng the determ in ati on of acetate(g/L)2代39.431.531.543.43代38.330.430.142.34代37.427.326.340.65代35.127.922.738.76代30.624.119.536.97代28.421.814.735.5由表2.3.1.a可以看出，每代发酵培养中，菌株X4的醋酸产量最高，并在传代培养过程中产量稳定，故选该菌株为目的菌株。
⑺存活期限试验：把X4菌株接入三种斜面保藏培养基，每隔三个月接种到各方法所用的培养基上。
观察其存活情况，见表 2.3.1.b:表2.3.1.b三种方法保藏醋酸菌的存活时间Tab 2.3.1.b Three methods of acetic acid bacteria survival time of biomaterial注：“ ”表示生长；“ ”表示生长良好；”-”表示不生长。
从2.3.1.b看可以出，普通斜面保减法保藏的保藏时间小于3个月；而液体保藏法的保藏时间大于18个月；但改进后的斜面液体保藏法，能在20个月内都保持生长良好，且保藏的时间可达24个月。
醋酸菌所产的酸，是造成醋酸菌保藏时间受到限制的原因之一。
随着保藏时间的延长，尽管醋酸菌能抵抗一定的酸，但一直处在酸性环境中，醋酸菌会被自己产的酸所杀灭。
因此，在菌种生长的很健壮后又加入碳酸钙和液体培养基，既降低了氧气的含量，又中和了产生的醋酸，使其在生长和保护方面较液体保藏更加先进了一步，保藏效果也更好。
2.3.2分析鉴定结果2.3.2.1菌株X4形态特征显微镜下细胞呈椭圆或短杆状，无芽抱，单个或成对、成链排列2.322 X4培养特征X4在基础平板培养基上生长旺盛，形成灰白色圆形菌落，表面光滑、凸起，边缘整齐，培养48h能产酸，使CaCO3溶解形成明显的透明圈。
继续培养能氧化乙酸产生CO2和H20,菌落周围出现乳白色透明圈。
在斜面培养基上生长良好，培养2 d产酸。