酿酒条件对两株商业酿酒酵母_葡萄糖苷酶的影响_张方方

酿酒条件对两株商业酿酒酵母β-葡萄糖苷酶的影响张方方1，江 璐1，刘延琳1,2,*（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌712100）摘 要：研究酿酒条件（氧气、pH 值、温度、糖和乙醇等）对两株商业酿酒酵母β-葡萄糖苷酶的影响。

结果显示：氧气促进酵母β-葡萄糖苷酶的合成，两株商业酿酒酵母完整细胞的β-葡萄糖苷酶最适pH 值为5.0，最适温度为60℃，果糖、葡萄糖和蔗糖对两株酿酒酵母完整细胞的β-葡萄糖苷酶活性具有轻微抑制作用，乙醇（体积分数2%～20%）促进β-葡萄糖苷酶的酶活力。

在葡萄酒发酵过程中，β-葡萄糖苷酶主要存在于完整细胞和透性化细胞中，上清液中酶较少。

关键词：酿酒酵母；β-葡萄糖苷酶；葡萄汁发酵Effect of Winemaking Conditions on β-Glucosidase Activity from Two Commercial Saccharomyces cerevisiae StrainsZHANG Fang-fang 1, JIANG Lu 1, LIU Yan-lin 1,2,*(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-viniculture, Yangling 712100, China)Abstract: The present study aimed to investigate the effect of vinification environments such as oxygen, pH, temperature, sugar and ethanol on β-glucosidase activity from two commercial Saccharomyces cerevisiae strains. The results showed that aerobic condition stimulated β-glucosidases biosynthesis. The optimal pH and temperature for β-glucosidase activity from the whole cells of both strains were 5.0 and 60 ℃, respectively. β-Glucosidase activity was slightly inhibited by fructose, glucose and sucrose. An ethanol concentration between 2% and 20% could activate β-glucosidase from the two S. cerevisiae strains. During grape juice fermentation, the e nzyme was mostly in both whole cells and permeabilized cells, while the activity in the culture supernatant was low.Key words: Saccharomyces cerevisiae ; β-glucosidase; grape juice fermentation 中图分类号：TS261.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）03-0148-05doi:10.7506/spkx1002-6630-201403030收稿日期：2013-03-23基金项目：国家自然科学基金项目（31271917）；西北农林科技大学基本科研业务费专项（22050205）；国家现代农业（葡萄）产业技术体系建设专项（CARS-30-jg-3）作者简介：张方方（1984—），女，硕士研究生，研究方向为葡萄酒微生物。

E-mail：zhangfangfang8875@*通信作者：刘延琳（1966—），女，教授，博士，研究方向为酿酒微生物及葡萄-葡萄酒学。

E-mail：yanlinliu@香气是葡萄酒重要特征之一，葡萄汁、葡萄酒中许多香气成分（如里那醇、里那醇氧化物、香叶醇、橙花醇、香茅醇、α-萜品醇等）是以糖苷形式存在的。

β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase ，EC3.2.1.21）又称β-D -葡萄糖苷水解酶，是糖苷水解的关键酶[1]，在微生物（如细菌、酵母和霉菌）中广泛存在，也存在于植物中，主要用于增强葡萄酒、啤酒和果汁的感官特性，特别是香气[2-3]。

β-葡萄糖苷酶水解糖苷，释放挥发性糖苷配基，如萜烯醇，增加葡萄酒香气。

葡萄中含有单糖苷和二糖苷，二糖苷的水解，首先在α-L -鼠李糖苷酶、α-L -阿拉伯糖苷酶或β-D -洋芹糖苷酶作用下切断相应二糖苷的糖苷键，形成β-D -葡萄糖单糖苷，然后在β-葡萄糖苷酶的作用下释放挥发性物质[4]。

β-葡萄糖苷酶是糖苷水解的关键酶[5]，因此大部分研究主要集中于β-葡萄糖苷酶 [2,6-7]。

在葡萄酒酿造过程中，β-葡萄糖苷酶主要来自于葡萄[8]和参与葡萄酒发酵的微生物（如酵母[9]和乳酸菌[10]），但在酿酒条件下葡萄自身合成的酶几乎没有活性。

酿酒酵母能合成β-葡萄糖苷酶[11]，但葡萄酒的发酵是一个厌氧的过程，因此氧气影响酵母合成β-葡萄糖苷酶。

在葡萄酒发酵的过程中，pH值、温度、糖、乙醇等因素同样影响酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶的活性，研究发现在这些条件下β-葡萄糖苷酶的酶活低，甚至没有酶活[12]。

目前，对酿酒酵母β-葡萄糖苷酶的研究较少[13-15]，尤其在发酵过程中酵母产β-葡萄糖苷酶[16-17]方面。

本实验主要研究不同的酿酒条件对两株商业酿酒酵母RC212和V L1的β-葡萄糖苷酶的影响，以及酿酒过程中酵母产β-葡萄糖苷酶的动态变化。

1 材料与方法1.1材料与试剂商业酿酒酵母RC212和VL1。

宁夏御马酒厂霞多丽葡萄汁，含糖量200 g/L、总酸6.88 g/L（酒石酸计），pH3.89。

p NPG（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，≥98%（TLC））、咪唑（≥98.5%） 美国Sigma公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、碳酸钠、葡萄糖、蔗糖 天津博迪化工股份有限公司；还原态谷胱甘肽（≥98%）、Triton X-100（试剂级） 美国Amresco公司；甲苯、乙醇（分析纯） 西安三浦化学试剂有限公司；果糖（分析纯） 北京索莱宝科技有限公司。

YPD液体培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，pH5.0；WL固体培养基：酵母浸粉4 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖50 g/L、磷酸二氢钾0.55 g/L、氯化钾0.425 g/L、氯化钙0.125 g/L、硫酸镁0.125 g/L、氯化铁0.0025 g/L、硫酸锰0.0025 g/L、溴甲酚绿22 mg/L、琼脂20 g/L，pH6.5。

培养基灭菌条件：121℃、20 min。

1.2仪器与设备MJPS-250型霉菌培养箱、DHG-9071A鼓风干燥箱、DK-S22电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；FRESC017型高速冷冻离心机 美国Thermo公司；UV1800紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3方法1.3.1菌株活化与培养取100 μL、－20℃保存的菌种接种至5mL YPD液体培养基中，28℃、150 r/min活化24h。

活化的菌株接种至含有1/5体积的YPD （pH5.0）液体培养基的三角瓶中，接种量为体积分数1%，28℃、180 r/min，培养24h 后取样，每个样品重复2次。

1.3.2 样品处理上清液：取1m L菌液，10000×g、4 ℃离心10 min，取0.2mL上清液，测定上清液中的酶活力。

完整细胞：取1mL菌液，10000×g、4℃离心10 min，菌体用1mL冷却无菌水洗2次，加入0.2mL pH5.0、0.1mol/L柠檬酸-磷酸缓冲溶液，所得菌液用于测定完整细胞的酶活力。

透性化细胞：取1mL菌液，10000×g、4℃离心10 min，菌体用1mL冷却无菌水洗2次，加1mL 0.075mol/L pH7.5咪唑缓冲溶液，迅速加0.05mL 0.3mol/L谷胱甘肽，0.01mL质量分数10% triton X-100，0 .05mL甲苯-乙醇（体积比1∶4），剧烈振荡5 min，10000×g、4℃离心10 min，得到的菌体用1mL冷却无菌水洗2次，加入0.2mL pH5.0柠檬酸-磷酸缓冲溶液，用于透性化细胞酶活力（酵母的胞内酶）分析[12]。

细胞干重：取4mL菌液，10000×g离心10 min，用冷却的无菌水洗2次，105℃烘至恒质量，分析天平称质量。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶酶活力测定分别取0.2mL上清液、完整细胞液和透性化细胞液，加入0.2mL p NPG（5mmol/L溶于pH5.0柠檬酸-磷酸缓冲液中），30℃水浴反应1h后，加入pH10.2、0.2mol/L 碳酸钠缓冲溶液终止反应，400nm波长测定吸光度[12]。

β-葡萄糖苷酶的酶活力单位为在1h内1mL上清液中反应生成对硝基苯酚量（mol）或每小时每毫克干细胞质量中生成的对硝基苯酚量（mol），即μmol/(mL・h)和μmol/(mg・h)。

1.3.4 酿酒条件对完整细胞β-葡萄糖苷酶的影响1.3.4.1 氧气有氧培养：按1%接种量，将活化的菌株培养液接种至含有1/5体积YPD液体培养基（pH5.0）的三角瓶，28℃、180 r/min培养24h；厌氧培养：按相同接种量接种至含有80%体积YPD液体培养基（pH5.0）的离心管中厌氧静止培养3d，分别取样测定完整细胞的酶活力，每个样品重复测定2次。

1.3.4.2 pH值在30℃条件下，pH值分别为3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液中测定完整细胞β-葡萄糖苷酶的酶活力，每个样品重复测定2次。

1.3.4.3 温度在pH5.0柠檬酸-磷酸缓冲液中，分别在15、20、25、30、35、40、45、50、60、70℃温度下测定两株商业酿酒酵母完整细胞的酶活力，每个样品重复测定2次。

1.3.4.4 糖在pH5.0柠檬酸-磷酸缓冲溶液中，果糖、葡萄糖和蔗糖质量浓度分别为0、20、40、80、120、160、200 g/L，30℃测定完整细胞的酶活力，每个样品重复测定2次。