小RNA分析-浙大教材
microRNA相关问题的计算分析- 附件1
附件2论文中英文摘要作者姓名：汪小我论文题目：microRNA相关问题的计算分析作者简介：汪小我，男，1980年6月出生，2003年9月师从于清华大学李衍达教授，2008年7月获博士学位。
中文摘要生物信息学是生命科学与信息科学、控制科学等多学科交叉的新兴学科。
近年来，人类基因组的测序完成和各类高通量生物实验技术的发展，使得生物学数据呈指数级增长，如何用生物信息技术挖掘和分析这些海量的信息成为研究的焦点。
同时，随着生物信息学研究的不断深入，它在解决重要的生物学问题、阐明新的生物学规律等方面发挥出巨大作用。
microRNA（miRNA，微小RNA）是近年来新发现的一类非编码RNA，它在诸多重要生命过程中起着关键的调控作用，人们对其在疾病的诊断和治疗等方面的应用前景寄予厚望，关于miRNA的研究是当前生命科学领域最前沿的方向之一。
生物信息学在miRNA的研究中起到了关键作用，极大地推动了该领域的迅速发展。
本论文的工作围绕miRNA这一重要生物学问题展开，运用统计、机器学习和模式识别等多种生物信息学方法，对miRNA的识别、转录调控、进化机制等重要问题进行了多方面的探索，取得了一些创新成果。
主要有以下四方面内容：（1）提出了高效的同源miRNA识别算法，可用于预测远同源的miRNA基因。
要研究miRNA的功能，首先必须找到miRNA。
在提出本课题时，用于发现新miRNA 基因的实验技术费时又费钱，而且很难找到那些表达量较低或者只在特定组织或发育阶段中表达的miRNA。
因此通过高通量的计算方法从基因组中筛选出可能的miRNA基因候选集合，可以对生物学实验提供指导和参考，对推动miRNA研究具有重要意义。
同源基因预测是一类重要的基因识别方法，其出发点是利用基因在物种间的保守性，寻找已知基因的同源基因。
这类方法可以将一个物种中找到的基因及其注释推广到其它物种中。
包括人类基因组在内的多个物种的基因组测序完成为开展同源基因预测创造了条件。
microrna研究课件
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MicroRNA与其他非编码RNA的相互作用研究
探索miRNA与其他非编码 RNA（如lncRNA、circRNA
等）的相互作用和调控机制 ，揭示它们在基因表达和细
胞功能中的相互影响。
研究miRNA与病毒或宿主基 因的相互作用，深入了解病 毒复制和致病机制，为抗病
毒治疗提供新思路。
探索miRNA与表观遗传学修 饰的相互作用，揭示它们在 基因表达调控中的协同作用 。
疾病发生与发展
miRNA的异常表达与多种疾病的发生和发展密 切相关，包括癌症、心血管疾病、神经退行性 疾病等。
miRNA可以作为疾病的生物标志物，用于疾病 的早期诊断和预后评估。
通过调控miRNA的表达，可以开发新的治疗策 略和药物靶点。
肿瘤转移与耐药性
miRNA在肿瘤转移和耐药性的发生中发挥重要作用。
MicroRNA在人类健康与疾病中的全面认识
01
全面了解miRNA在人类健康和疾病中的功能和作用机制，为疾病的早期诊断、 预防和治疗提供新策略。
02
深入研究miRNA与药物代谢和药物反应的相互关系，为药物研发和个性化治疗 提供依据。
03
探索miRNA在衰老和衰老相关疾病中的作用，为抗衰老研究和治疗提供新思路 。
02
MicroRNA可以作为癌症诊断的生物标志物，用于早期发现、病情监 测和预后评估。
03
MicroRNA可以作为癌症治疗的靶点，通过调控MicroRNA的表达或 功能，实现治疗癌症的目的。
04
针对MicroRNA的靶向治疗是当前癌症治疗领域的研究热点之一，有 望为癌症治疗提供新的策略。
MicroRNA与神经退行性疾病
MicroRNA通过调控心血管细胞的生长、分化、凋亡等过 程，影响心血管疾病的发生和发展。
microRNA研究课件
microrna研究课件xx年xx月xx日CATALOGUE目录•microrna概述•microrna的生物合成及调节机制•microrna的生物学功能•microrna与疾病关系及临床应用前景•研究microrna的方法与技术•研究microrna的意义与展望01 microrna概述microrna是一类非编码RNA分子，由21-25个核苷酸组成，通过与靶mRNA结合调节基因表达。
定义microrna在生物体内具有高度保守性和稳定性，参与多种生物学过程，包括发育、细胞增殖、凋亡和免疫应答等。
特点定义与特点发现1998年，科学家在秀丽新小杆线虫中发现了第一个microrna，当时被认为是调节基因表达的RNA分子。
分类microrna根据其作用可分为两类，一类是调节性microrna，可直接与靶mRNA结合抑制翻译；另一类是降解性microrna，与靶mRNA结合后将其降解。
microrna的发现与分类microrna的主要功能microrna通过与靶mRNA结合，抑制翻译过程，调节基因表达水平。
调节翻译调节细胞分化调节细胞增殖和凋亡调节免疫应答microrna可以作为细胞分化的调控因子，调节细胞分化过程。
microrna可以调节细胞增殖和凋亡过程，影响肿瘤的发生和发展。
microrna可以调节免疫应答过程，影响炎症和自身免疫性疾病的发生和发展。
02microrna的生物合成及调节机制microrna的生物合成初级转录物的形成RNA聚合酶Ⅱ转录产生初级转录物，长度通常为几百至几千个核苷酸。
初级转录物的剪切和加工在核糖核酸酶P和内切核酸酶的作用下，初级转录物被剪切和加工成约70个核苷酸长度的前体microrna。
前体microrna的剪切和加工在前体microrna的剪切和加工过程中，细胞质中的酶和核糖核酸酶Q1的作用下，前体microrna被剪切和加工成成熟的microrna。
03microrna的调节细胞分化microrna可以调节细胞分化的相关基因表达，从而影响细胞分化过程。
浅析微小核糖核酸(microRNA)
浅析微小核糖核酸（microRNA）2007年的一天，正在南京大学读博的陈熹被导师布置了一个实验，去检测人的血清中是否含有微小核糖核酸（microRNA）。
陈熹当时就认为导师疯了，因为这完全违背了他所学到的生物学常识：人的血清中含有许多RNA的降解酶，因而不可能有完整的RNA存在，至多只是一些碎片。
他在师弟师妹面前把自己的导师“批判”了一番，然后就把这个任务扔在了一边。
研究人员估计，在哺乳动物的基因中，约有30%左右的编码蛋白质的基因受到微小RNA的调控。
直到两个星期后的一个早晨，陈熹的导师张辰宇堵到了他，再次要求他去做这个实验。
陈熹回避不开，只好去做。
结果这个实验一做，陈熹变得比他的导师都更疯狂了，曾经连续三天三夜泡在实验室里。
他得到了一些令人难以置信的结果。
他们最新的一项研究发表在近期的《细胞研究》上，这项研究发现，植物所含有的微小RNA能够通过消化道进入人体血液和器官组织，然后通过调控人体内靶基因表达的方式，影响人的生理功能。
他们已经发现了至少一种情况，微小RNA能够通过这种方式影响人体健康：进食过多的大米会增加患代谢紊乱综合征的可能。
这倒令人想起孙悟空变成一只小虫子钻进铁扇公主肚子的故事，尽管最后的结果与肚子疼无关。
这样的一个发现引起了许多生物学研究者的极大兴趣。
同样研究微小RNA的美国俄亥俄州立大学的克莱·马什（Clay Marsh）教授认为张辰宇等人的这项工作“非常令人激动”，它表明我们日常的饮食能够直接影响体内的基因表达。
用南京大学张辰宇教授的话来说，这项发现为中国诸如“吃什么补什么”、“一方水土养一方人”这些俗话提供了科学上的注脚。
微小RNA与人体疾病科学家发现微小RNA并不是很久之前的事情。
1993年，哈佛大学的罗莎琳德·李（Rosalind Lee）等人在《细胞》杂志上发表论文，称在线虫中发现了控制幼虫发育的“lin-4基因”所编码产生的短小RNA，这种RNA可以与lin-14基因产生的mRNA结合，并抑制它的功能，使它无法被翻译，最终控制LIN-14蛋白质的产生。
RNAs 小RNA的全面介绍
第二步（效应阶段）是siRNA 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP 参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其 参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其 中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体 中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体 (RNA(RNA-induced silencing complex， complex， RISC) RISC)。 RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸 RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸 内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化 的RISC在单链siRNA引导下识别互补的 RISC在单链siRNA引导下识别互补的 mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从 mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从 siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶 siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶 mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降 mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降 解，从而干扰基因表达。
Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显 Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显 著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和 著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和 kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用 kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用 其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA 无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也 无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也 很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能 很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能 高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明 双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反 双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反 义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰（RNAi）。图示 RNA介导的RNA干扰（RNAi）。图示
科研英文文献汇报英文--MicroRNAPPT课件
2021
87例NSCLC
48例NAT
(正常)
在ADC及SCC中，miR-224 明显上调
Ohio State University Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) 俄亥俄州立大学综合癌症中心
2021
The Cancer Genome Atlas (TCGA) 癌症和肿瘤基因图谱
63例NSCLC &48 NATs
NSCLC中TNFAIP1 (5.23E-14) and SMAD4 (2.67E-06)的表达下降
在有转移的肺癌中，miR-224表达更强 miR-224可能在有转移的肺癌中起到重要作用
2021
642例 NSCLC
TCGA
Kaplan–Meier 生存分析
miR-224表达与生存之间并无 明显联系
2021
59例 ADC
Kaplan–Meier 生存分析
miR-224与有(kras)/p53 突变肺 腺癌患者的不良预后明显相关
2021
技术路线
寻找靶点
生物信息分析
TNFAIP1及 SMAD4的3′-UTRs
共转染3′UTRs及 免疫荧光 miRNA
是否为靶点
共转染突变 3′-UTRs及
miRNA
免疫荧光
靶点特 异性
TNFAIP1及 SMAD4是
否为特异 性靶点
过表达 及降低 系统
miR-224 对靶蛋白 的影响
TCGA 数据库
666例ADC及SCC 86例NAT
相较于NATs，miR-224在ADC及SCC中明 显上调
Of the evaluable 468 primary lung ADC patients, 46 patients had matched normal adjacent tissues. Of
利用小RNA深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原
植物病理学报ＡＣＴＡＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡＳＩＮＩＣＡ㊀４５(１):８８￣９２(２０１５)收稿日期:２０１４￣０３￣０１ꎻ修回日期:２０１４￣１０￣０９基金项目:质检公益性行业科研专项项目(２０１３１００６８)ꎻ浙江省重中之重林学一级学科开放基金项目(ＫＦ２０１３３０)ꎻ浙江农林大学科研发展基金项目(２０１３ＦＫ０１９)通讯作者:周雪平ꎬ教授ꎬ主要从事植物病毒学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｚｚｈｏｕ＠ｚｊｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮｄｏｉ:１０.１３９２６/ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０１.０１３研究简报利用小ＲＮＡ深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原苏秀１ꎬ２ꎬ徐毅１ꎬ陈莎１ꎬ傅帅１ꎬ钱亚娟１ꎬ张立钦２ꎬ周雪平１∗(１浙江大学生物技术研究所ꎬ杭州３１００５８ꎻ２浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地ꎬ临安３１１３００)ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇＷｉｓｔｅｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓｂｙｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｓｍａｌｌＲＮＡ㊀ＳＵＸｉｕ１ꎬ２ꎬＸＵＹｉ１ꎬＣＨＥＮＳｈａ１ꎬＦＵＳｈｕａｉ１ꎬＱＩＡＮＹａ￣ｊｕａｎ１ꎬＺＨＡＮＧＬｉ￣ｑｉｎ２ꎬＺＨＯＵＸｕｅ￣ｐｉｎｇ１㊀(１ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｎｇｚｈｏｕ３１００５８ꎬＣｈｉｎａꎻ２ＴｈｅＮｕｒｔｕｒｉｎｇＳｔａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＳｉｌｖｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＺｈｅｊｉａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬｉｎ ａｎ３１１３００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＰｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅａｇａｉｎｓｔｖｉｒｕｓｅｓｔｈｒｏｕｇｈｓｍａｌｌＲＮＡ(ｓＲＮＡ)ｍｅｄｉａｔｅｄＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｖｉｒｕｓｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｐｒｏｆｉｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｄｅｎｏｖｏａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅｓａｎｄｖｉｒｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｓｕｓｐｅｃｔｅｄｖｉｒｕｓ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄＷｉｓｔｅｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＺｉｊｉｎｇａｎｇＣａｍｐｕｓｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｓＲＮＡｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.ＡｆｔｅｒａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｏｔａｌｓＲＮＡｓꎬｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔＷ.ｓｉｎｅｎｓｉｓｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙＷｉｓｔｅｒｉａｖｅｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ(ＷＶＭＶ).Ｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｇｅｎｅｒａｔｅｄ１８.９ｍｉｌｌｉｏｎｓＲＮＡｒｅａｄｓꎬｏｆｗｈｉｃｈ０.３２ｍｉｌｌｉｏｎｗｅｒｅＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｓ.Ｕｓｉｎｇｄｅｎｏｖｏａｓｓｅｍｂｌｙꎬ２３.３％ｏｆｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｇｅｎｏｍｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｒｅｐｏｒｔｅｄｐｏｔｙｖｉｒｕｓＷＶＭＶｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ.ＴｏｃｏｎｆｉｒｍｔｈｅｅｘｉｓｔｅｎｃｅｏｆＷＶＭＶｉｎｔｈｅｓａｍｐｌｅｓꎬＷＶＭＶｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ(ＣＰ)ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＲＴ￣ＰＣＲꎬａｎｄｅｎｓｕｒｅｄｂｙＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.ＴａｋｅｎｔｏｇｅｔｈｅｒꎬｔｈｅｄａｔａｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｓＲＮＡｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｐｏｗｅｒｆｕｌｇｅｎｅｔｉｃｔｏｏｌｆｏｒｖｉｒｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｗｏｏｄｙｐｌａｎｔｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｓｍａｌｌＲＮＡꎻＷｉｓｔｅｒｉａｖｅｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎻｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ文章编号:０４１２￣０９１４(２０１５)０１￣００８８￣０５㊀㊀ＲＮＡ沉默(ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇ)是一种在真核生物体内普遍保守的基于核酸序列特异性抑制基因表达的调控机制[１]ꎮ２００９年Ｋｒｅｕｚｅ等[２]发现病毒特异的小ＲＮＡ(ｓｍａｌｌＲＮＡꎬｓＲＮＡ)在序列上是重叠的ꎬ因此推测通过深度测序技术获得的大量ｓＲＮＡ序列能用来组装病毒的基因组并用来鉴定和发现新病毒ꎮ利用ｓＲＮＡ深度测序技术已在作物和昆虫上鉴定发现多种病毒[３㊁４]ꎬ但在木本植物上还未见报道ꎮ㊀㊀紫藤(Ｗｉｓｔｅｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ)是城市园林绿化美化的主要植物ꎬ在公园㊁校园㊁庭院等地普遍种植ꎮ由紫藤花叶病毒引起的紫藤花叶病在捷克㊁意大利㊁荷兰㊁美国㊁波兰㊁德国等都有发生ꎬ已成为一种世界性的病害ꎮ紫藤花叶病主要表现花叶㊁斑驳㊁黄化㊁脉明等症状ꎬ感病紫藤开花能力明显下降ꎬ严重影响其观赏性和经济价值ꎮ２００６年Ｆａｎ等[５]报道了紫藤脉花叶病毒北京分离物(ＷＶＭＶ￣ＢＪ)的全序列ꎬ并证实ＷＶＭＶ￣ＢＪ是Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ中的一种新病毒ꎮ本文利用深度测序技术对采自浙江的紫藤花叶病病原进行了鉴定ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料来源㊀㊀表现花叶症状的紫藤病叶采自浙江大学紫金㊀㊀１期苏秀ꎬ等:利用小ＲＮＡ深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原港校区校园内ꎮ感病紫藤叶片表现褪绿㊁花叶㊁斑驳㊁黄化㊁脉明㊁叶片变小㊁卷曲等症状ꎬ并出现小的星状斑ꎬ褪绿部分生长较慢ꎬ致使叶片畸形(图１)ꎮＦｉｇ.１㊀Ｗｉｓｔｅｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓｌｅａｖｅｓｓｈｏｗｉｎｇｃｈｌｏｒｏｔｉｃｓｐｏｔｓꎬｂｌｏｔｃｈｅｓａｎｄｌｅａｆｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ１.２㊀植物总ＲＮＡ提取和ｓＲＮＡ纯化㊀㊀采集的样品用ＴｉａｎｇｅｎｍｉＲｃｕｔｅｍｉＲＮＡ提取分离试剂盒提取总ＲＮＡꎬ操作步骤参照说明书进行ꎬ然后运用醋酸锂和聚乙二醇法(ＬｉＡＣ/ＰＥＧ)分离其中的ｓＲＮＡꎬ经１５％的ＰＡＧＥ分离切割１８~２８ｎｔ的ｓＲＮＡꎮ１.３㊀ｓＲＮＡ的Ｓｏｌｅｘａ深度测序㊀㊀上述ｓＲＮＡ样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序ꎮ测序流程:运用ＴａＫａＲａｓｍａｌｌＲＮＡｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔ(ＤＲＲ０６５)将分离的１８~２８ｎｔ的ｓＲＮＡ分别在３ᶄ端和５ᶄ端加上接头ꎻ随机引物反转录获得ｃＤＮＡ第一链ꎻＰＣＲ富集ꎻ产物回收(６％ＮｏｖｅｘＴＢＥＰＡＧＥｇｅｌꎬ１.０ｍｍꎬ１０ｗｅｌｌ)ꎻＴＢＳ３８０(Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ)定量ꎬ按数据比例混合上机ꎻｃＢｏｔ上桥式扩增ꎬ生成ｃｌｕｓｔｅｒｓꎻ运用ＩｌｌｕｍｉａＳｏｌｅｘａ的Ｈｉｓｅｑ２０００测序平台ꎬ进行１ˑ５０ｂｐ测序试验ꎮ１.４㊀Ｓｏｌｅｘａ测序数据的预处理㊀㊀运用生物信息学手段对原始数据进行处理:去接头序列ꎬ去污染序列ꎬ去低质量碱基ꎬ去未插入３ᶄ接头㊁５ᶄ接头的ｒｅａｄｓꎬ获得不含接头序列的ｓＲＮＡ序列ꎬ在此基础上筛选出１８~２８ｎｔ的ｓＲＮＡ序列ꎮ１.５㊀测序数据的序列拼接㊁ＢＬＡＳＴ分析及病毒相关序列的筛查㊀㊀用Ｖｅｌｖｅｔ软件对上述１８~２８ｎｔｓＲＮＡ进行序列拼接ꎬ得到的ｃｏｎｔｉｇｓ用ＢＬＡＳＴ(ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ)进行比对并注释ꎬ经过ＢＬＡＳＴ同源比对筛查到与紫藤脉花叶病毒北京分离物(ＷＶＭＶ￣ＢＪꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＹ６８６８１６)同源ꎮ以ＷＶＭＶ￣ＢＪ为参考基因组ꎬ应用生物信息手段比对得到病毒来源的ｓＲＮＡꎬ并对产生ｓＲＮＡ的热点区进行统计ꎮ１.６㊀ＲＴ￣ＰＣＲ扩增㊁克隆及序列分析㊀㊀提取植物总ＲＮＡꎬ采用ＴａＫａＲａ公司的ＲＮＡＲｅｖｅｒｓｅＰＣＲＫｉｔ(ＡＭＶ)反转录成ｃＤＮＡꎬ以ｃＤ￣ＮＡ为模板ꎬ利用根据拼接到的序列设计的特异性引物和Ｐｈｕｓｉｏｎ超保真ＰＣＲ试剂盒(ＮＥＢ公司)进行ＰＣＲ扩增ꎬＰＣＲ产物纯化后连接到ＰＺｅｒｏＢａｃｋ载体(Ｔｉａｎｇｅｎ)ꎬ并转化Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α感受态细胞ꎬ涂布于含氨苄青霉素的ＬＢ平板上ꎬ培养过夜后挑选单菌落ꎬ用Ｔａｑ酶ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆ꎬ随机挑取２个阳性克隆送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司进行测序ꎬ获得的序列利用ＢＬＡＳＴ进行比较分析ꎮ２㊀结果２.１㊀感病紫藤叶片ｓＲＮＡｓ高通量测序结果㊀㊀感病紫藤叶片经总ＲＮＡ提取ꎬｓＲＮＡ分离㊁纯化和Ｓｏｌｅｘａ测序后得到１８９０２０４６个ｒｅａｄｓꎬ经过Ｓｏｌｅｘａｐｉｐｅｌｉｎｅ加工后ꎬ得到介于１８~２８ｎｔ之间的ｒｅａｄｓ为４６７３４４７个ꎬ占总ｓＲＮＡｒｅａｄｓ数量的２４.７２％ꎮ２.２㊀ＷＶＭＶ来源ｓＲＮＡｓ(ｖｓｉＲＮＡｓ)数据分析㊀㊀以ＷＶＭＶ￣ＢＪ为参考基因组ꎬ将上述经过筛选的４６７３４４７个ｒｅａｄｓ进行本地ＢＬＡＳＴｔ分析ꎬ在不包含重复序列的情况下ꎬ获得与参考基因组完全匹配的ｒｅａｄｓ共９８６８个㊁允许１个错配的ｒｅａｄｓ共４５５１０个㊁允许２个错配的ｒｅａｄｓ共１１３９３２个ꎮ重点分析了允许１个错配的情况ꎮ一共有３１５１２３个ｒｅａｄｓ(包含重复序列)与ＷＶＭＶ￣ＢＪ匹配ꎬ其中２０~２４ｎｔｖｓｉＲＮＡ数量分别为７４１０㊁１９５６９７㊁９９５３６㊁２９５０和１２０８个ꎬ其他长度的ｖｓｉＲＮＡ数９８㊀植物病理学报４５卷量为８４０２个ꎮ有１７９４６８１个来自正义链ꎬ１３５６５５个来自负义链ꎮ㊀㊀通过对不同长度的ｖｓｉＲＮＡ的读数百分比分析(图２)ꎬ可以看出２１ｎｔ和２２ｎｔ大小的ｓＲＮＡ占主要部分ꎮ不同长度ｓＲＮＡ占总数的百分比分别为:２０ｎｔ２.３５％㊁２１ｎｔ６２.１０％㊁２２ｎｔ３１.５９％㊁２３ｎｔ０.９４％㊁２４ｎｔ０.３８％ꎬ其他长度占２.６７％ꎮ由此可见ꎬｖｓｉＲＮＡ以２１ｎｔ和２２ｎｔ大小为主ꎬ可以推测紫藤的ＤＣＬ４和ＤＣＬ２在抗病毒中起了主要的作用ꎮＦｉｇ.２㊀ＳｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｓ㊀㊀将ｖｓｉＲＮＡｓ根据来自ＷＶＭＶ的正义链还是负义链进行分析ꎬ发现来自正义链的(５７％)略高于来自负链的(４３％)ꎮＷＶＭＶ属于单链正义ＲＮＡ病毒ꎬ其基因组正义链含量远高于互补链ꎬ而产生的ｓＲＮＡ比例比较接近ꎬ揭示ＷＶＭＶ复制过程中产生的双链ＲＮＡ中间体可能是ｓＲＮＡ产生的主要来源ꎮ㊀㊀通过对ＷＶＭＶ来源ｓＲＮＡｓ的５ᶄ端起始核苷酸碱基分析(图３)发现ꎬ总的ＷＶＭＶ来源的ｓＲＮＡｓ中ꎬ５ᶄ端起始核苷酸碱基以 Ｕ ㊁ Ｇ ㊁ Ｃ ㊁ Ａ 开头的比例分别是２８.９６％㊁２０.２９％㊁１９.０３％和３１.７０％ꎬ以 Ａ 或 Ｕ 开头的ｓＲＮＡｓ要比以 Ｇ 或 Ｃ 开头的多ꎬ并且在不同长度的ｓＲＮＡｓ中也遵循这样的规律ꎮ这与受侵染拟南芥植株中ＴＭＶ￣Ｃｇ来源的２１ｎｔｓＲＮＡｓ的５ᶄ端起始核苷酸碱基分布一致ꎮ研究证实ꎬ拟南芥中不同的ＡＧＯ蛋白在招募内源ｓＲＮＡ时ꎬ对其５ᶄ端起始核苷酸碱基具有不同的偏好性ꎻ然而ꎬ在紫藤与病毒的互作过程中ꎬＡＧＯ蛋白在招募ｓＲＮＡｓ时是否也遵循同样的规律还需进一步的研究ꎮ㊀㊀利用基于Ｐｅｒｌ语言脚本的程序分析了ＷＶＭＶ来源ｓＲＮＡ在寄主中的热点分布(图４)ꎮ从紫藤叶片分离到的来源于ＷＶＭＶ的ｓＲＮＡ特异序列几乎覆盖了该病毒的全基因组ꎬ但在某些特定的区域ꎬ也称为热点(ｈｏｔｓｐｏｔｓ)区ꎬ各个ｓＲＮＡ序列出现的频率比较集中ꎮ在ＷＶＭＶ基因组的２６００~２７００㊁２９００~３０５０㊁５９００~６０００㊁７８００~７９００以及９２００~９５００位置ｓＲＮＡ出现的频率较高ꎬ尤其是在９３００~９３９０区域ꎬｓＲＮＡ总量达到４２３０个ꎬ并且大部分来自病毒的正义链ꎬ说明该位点可能存在典型的ＲＮＡ双链结构ꎮＦｉｇ.３㊀ＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｓ５ᶄｔｅｒｍｉｎａｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ０９㊀㊀１期苏秀ꎬ等:利用小ＲＮＡ深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原Ｆｉｇ.４㊀ＰｏｌａｒｉｔｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｓＦｉｇ.５㊀ＰｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＷＶＭＶｓＲＮＡｃｏｎｔｉｇｓＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｒｓｏｆｃｏｎｔｉｇｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｒｅｆｅｒｅｎｃｅＷＶＭＶ￣ＢＪｇｅｎｏｍｅ.Ｒｅｄｍｅａｎｓｈｉｇｈｅｓｔｈｏｍｏｌｏｇｙꎬｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｐｉｎｋａｎｄｇｒｅｅｎ.２.３㊀ＷＶＭＶ的ＲＴ￣ＰＣＲ验证㊀㊀用ｖｅｌｖｅｔ软件对１８~２８ｎｔｓＲＮＡ进行序列组装拼接ꎬ共得到８９４条ｃｏｎｔｉｇｓꎬ共有２３条序列与已知的ＷＶＭＶ￣ＢＪ序列匹配ꎬ总长２２５４ｎｔꎬ占ＷＶＭＶ￣ＢＪ基因组全长(９６９５ｎｔ)的２３.３％(图５)ꎮ根据拼接到的序列设计特异引物ꎬ用ＲＴ￣ＰＣＲ方法ꎬ从测序样品的总ＲＮＡ中克隆到９７１ｂｐ的片段ꎬ经测序及同源比对分析ꎬ与ＷＶＭＶ￣ＢＪ病毒序列相似性为８７％ꎬ这段序列编码ＷＶＭＶ的ＣＰ基因(ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＫＪ８３６２８２)ꎮ根据ＩＣＴＶ对马铃薯Ｙ病毒属病毒命名的规定ꎬ此分离物与已知的ＷＶＭＶ￣ＢＪ是同一种病毒ꎮ３㊀讨论㊀㊀传统的植物病毒检测需要对病毒进行纯化和分离ꎬ对样品纯化要求较高ꎬ且需要对病原的生物学特性㊁理化特性㊁基因组特性㊁血清学特性等有预先的了解ꎬ对于未知病原ꎬ这些检测方法的使用就受到了极大限制ꎬ需要较长的研究周期和繁琐的研究过程ꎮ木本植物上的病毒往往含量比较低ꎬ且很难通过摩擦接种的方式进行人工接种ꎬ因此ꎬ传统方法很难检测木本植物病毒ꎬ相关的研究报道很少ꎮ㊀㊀已报道的紫藤花叶病毒北京分离物病原的鉴定是在酶联免疫吸附试验(ＥＬＩＳＡ)基础上ꎬ通过７次逆转录￣聚合酶链反应(ＲＴ￣ＰＣＲ)ꎬ并结合５ᶄＲＡＣＥ等方法得到的[５]ꎮ这些试验方法工作量很大ꎬ耗时长ꎬ较难用于紫藤等木本植物的病毒检测与鉴定ꎮ本文利用小ＲＮＡ深度测序和组装技术ꎬ将分离自浙江的紫藤花叶病病原鉴定为ＷＶＭＶꎮ深度测序技术的发展开辟了大规模快速诊断植物病毒的途径ꎬｓＲＮＡ深度测序已在许多植物的未知病原鉴定中发挥了重要作用ꎮ利用植物体内的１９㊀植物病理学报４５卷ｓＲＮＡ病毒序列ꎬ大大提高了筛查木本植物病毒的效率ꎮ伴随着深度测序成本的降低ꎬｓＲＮＡ深度测序将成为一种经济有效的可用于木本植物病毒鉴定的方法ꎬ值得推广使用ꎮ参考文献[１]㊀ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅＰＭ.Ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇａｓａｎａｄａｐｔｉｖｅｄｅｆｅｎｓｅａｇａｉｎｓｔｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２００１ꎬ４１１:８３４－８４２.[２]㊀ＫｒｅｕｚｅＪＦꎬＰｅｒｅｚＡꎬＵｎｔｉｖｅｒｏｓＭꎬｅｔａｌ.ＣｏｍｐｌｅｔｅｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｎｏｖｅｌｖｉｒｕｓｅｓｂｙｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｓｍａｌｌＲＮＡｓ:Ａｇｅｎｅｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓꎬｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ３８８(１):１－７.[３]㊀ＷｕＱꎬＬｕｏＹꎬＬｕＲꎬｅｔａｌ.Ｖｉｒｕｓｄｉｓｃｏｖｅｒｙｂｙｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｖｉｒｕｓ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓｍａｌｌｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇＲＮＡｓ[Ｊ].ＰＮＡＳꎬ２０１０ꎬ１０７(４):１６０６－１６１１.[４]㊀ＸｕＹꎬＨｕａｎｇＬꎬＷａｎｇＺꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｉｍｅｔｏｂｉＰｖｉｒｕｓｉｎｔｈｅｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｂｙｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｖｉｒｕｓ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓ[Ｊ].ＶｉｒｕｓＲｅｓ.ꎬ２０１３ꎬ１４:ｐｉｉ:Ｓ０１６８－１７０２(１３)００３９４－８.[５]㊀ＬｉａｎｇＷＸꎬＳｏｎｇＬＭꎬＴｉａｎＧＺꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＷｉｓｔｅｒｉａｖｅｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓｓｉｍｉｌａｒｉ￣ｔｉｅｓｗｉｔｈｏｔｈｅｒｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].Ａｒｃｈ.Ｖｉｒｏ.ꎬ２００６ꎬ１５１:２３１１－２３１９.责任编辑:于金枝欢迎订阅«植物病理学报»«植物病理学报»是中国植物病理学会主办的全国性学术刊物ꎬ 中国科技核心期刊 ꎮ主要刊登植物病理学各分支未经发表的专题评述㊁研究论文和研究简报等ꎬ以反映中国植物病理学的研究水平和发展方向ꎬ推动学术交流ꎬ促进研究成果的推广和应用ꎮ本刊现已被英国农业与生物技术文摘(ＣＡＢ)㊁联合国粮农组织ＡＧＲＩＳ等收录ꎮ据«中国科技期刊引证报告»(２０１４年版)统计结果ꎬ«植物病理学报»影响因子０.８３２ꎮ荣获首届«中国学术期刊检索与评价数据规范»(ＣＡＪ￣ＣＤ)执行优秀期刊奖㊁２０１２中国国际影响力优秀学术期刊奖和２０１３百种中国杰出学术期刊奖ꎮ本刊为双月刊ꎬ每期定价３０元ꎬ全年６期共１８０元ꎮ邮发代号:８２￣２１４ꎮ欢迎投稿ꎬ欢迎订阅ꎮ编辑部地址:北京市海淀区圆明园西路２号中国农业大学农学楼２４３室邮编:１００１９３电话:(０１０)６２７３２３６４Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｗｂｌｘｂ＠ｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ２９。
Small RNAs 小RNA的全面介绍
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Co-suppression can be used to make tobacco plants resistant to the effect of the potato virus X Quelling in Neurospora crassa shares genetic links with RNAi RNA interference reveals the function of genes in C.elegans and Drosophila
Small RNAs Make Big Splash
神奇的小RNA分子
卢大儒 复旦大学生命科学学院 上海市遗传学会
主要内容
• RNAi和siRNA的发现 • siRNA的作用机制 • siRNA的合成和使用方法 • siRNA的应用
RNAi的发现
• 植物中的PTGS:矮牵牛花的花色异常;
• 郭苏在线虫(c. elegans )实验中阻断Par1基因
Andrew Fire
RNA interference – The Beginning
Fire et al. '98 "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans " Nature 391: 806-11 Introduction of RNA into cells to interfere with function of an endogeneous gene Investigation of the requirements for structure and delivery of interference RNA mex-3 RNA A control: not stained B: wt C: wt + antisense RNA D: wt + ds RNA
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第七章小RNA分析内源性非蛋白质编码小RNA (small non-protein-coding RNA, 12-24nt)广泛存在于高等和低等生物体内，通过对靶标mRNA直接切除或抑制其翻译在转录后水平对基因表达起调节作用。
已知的小RNA主要分为两大类：一类是微小RNA (miRNA, microRNA)，一类是小干扰RNA (siRNA, small interfering RNA)。
在植物和动物体内，miRNA与siRNA的产生机制和作用形式均有所不同，这里主要介绍植物体内的小RNA。
miRNA是由具有发夹结构的初级转录本（pri-miRNA）经过一系列加工过程，包括核酸内切酶DCL1加工后生成，而小干扰RNA则是通过核酸内切酶DCL2, DCL3和DCL4对具有较好互补结构的长双链RNA前体进行加工形成的(Vazquez 2006)。
目前发现的小干扰RNA种类很多，根据前体序列类型和形成机制可分为：ta-siRNAs (trans acting siRNAs)，nat-siRNAs (natural antisense transcript-derived siRNAs), hc-siRNA (heterochromatic siRNA), ra-siRNAs(repeat-associated siRNAs)，长茎环结构的miRNA-like位点（miRNA-like long hairpin）和nat-miRNA ( natural antisense miRNA)。
植物中发现的小RNA已有相当的数量，在水稻中至今已鉴定出451个miRNA (miRBase, /sequences/, Release 14.0)、一个ta-siRNA家族（TAS3）和一个mirtron (Zhu et al. 2008)。
由于小RNA表达的时空特异性，导致传统的实验方法研究小RNA效率很低，成本较高，因此借助计算方法研究小RNA是一个很好的补充，大大加速了该领域的研究进程。
对保守miRNA家族的查找，miRNA基因簇的发现，基于miRNA序列特征预测特异（novel）miRNA，通过高通量测序技术（454和SOLEXIA）产生的小RNA数据（往往超过几百或上千万条序列）处理，以及小RNA靶位点的预测及其进化分析，这些分析均离不开生物信息学的帮助。
随着研究的深入，大量的计算方法，相关软件和小RNA数据库不断产生，本章将对相关内容进行介绍。
第一节miRNA的主要特征及计算识别一. miRNA的主要特征在植物体内，miRNA基因首先通过Pol Ⅱ酶转录产生一个具茎环结构的miRNA 初级转录本(pri-miRNA) (Lee et al., 2004)，然后在DCL1酶(Dicer-like enzyme)的作用下切除茎结构的尾巴或loop结构由miRNA前体(pre-miRNA)得到miRNA:miRNA*双链复合体(Tang et al., 2003; Kurihara and Watanabe, 2004)。
miRNA:miRNA*复合体的两个3'端均有两个碱基的错位，其碱基结合允许一定的错配数，但通常不超过4个，并且没有较大的空位或loop结构。
最后双链由解旋酶切开，miRNA*降解，成熟miRNA序列结合到靶基因位点进行调节，根据与靶位点结合的紧密程度决定了对目标mRNA切割或是抑制其表达(Bernstein et al., 2001; Papp et al., 2003; Bartel, 2004, 图1)。
图1 miRNAs和siRNAs的产生途径(Bartel, 2004)(A) The biogenesis of a plant miRNA (steps 1–6; see text for details) and its hetero-silencing of loci unrelated to that from which it originated (step 7). The pre-miRNA intermediates (bracketed), thought to be very short-lived, have not been isolated in plants. The miRNA (red) is incorporated into the RISC (step 6), whereas the miRNA* (blue) is degraded (hatched segment). A monophosphate (P) marks the 5_ terminus of each fragment.(B) The biogenesis of a metazoan miRNA (steps 1–6; see text for details) and its hetero-silencing of loci unrelated to that from which it originated (step 7).(C) The biogenesis of animal siRNAs (steps 1–6; see text for details) and their auto-silencing of the same (or similar) loci from which they originated (step 7).miRNA 基因长度从几十到几百碱基不等 (Zhang et al., 2006a,b)，但成熟miRNA 序列长度一般为20-24个碱基 (Ambros, 2001)，水稻中以21nt 和24nt 两种长度miRNA 含量最丰富，这跟其选择的DCL 酶有关。
miRNA 成簇排列的现象在动物中比较常见，在植物中目前已发现几个miRNA 家族像水稻中的miR169，miR395，也在基因组上成簇排列 (Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Zhang et al., 2006a)。
成簇排列的miRNA 类似多顺反子结构，基因表达模式和时期均有同步性 (Bartel, 2004; Altuvia et al., 2005; Baskerville and Bartel, 2005)。
基于miRNA 前体的二级结构，一些研究发现miRNA 前体有较低的最小折叠自由能 (MFE, minimal folding free energy)，由于MFE 跟序列长度相关，Zhang 等（2006b ）提出了最小折叠自由能指标 (MFEI, minimal folding free energy index)的概念，将序列长度考虑进来，从而为不同长度miRNA 前体的MEF 比较提供了一个标准，并给出0.85作为miRNA 区别于其他类型RNA 的MFEI 值，不失为一个预测miRNA 的较理想指标。
(L: the length of pre-miRNA)目前miRBase 14.0 (/)版本中miRNA 的记录已经超过1万条。
其中很多miRNA 家族均可以在至少2个物种中找到，其中miR159, miR171家族在目前miRBase 收录的全部物种中均存在 (Tab. 1)。
这种miRNA 的保守性对于在新物种中预测保守的miRNA 非常有用。
尽管miRNA 前体在不同物种，或不同成员间的变异非常大，但成熟miRNA 序列还是相当保守的，同一miRNA 家族不同物种的homologs 间往往只有1, 2个碱基的差异。
这种便利促使了大量的查找不同物种间保守miRNA 的研究 (Llave et al., 2002; Reinhart et al., 2002; Bonnet et al., 2004a;Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Sunkar and Zhu, 2004; Wang et al., 2004a; Adai et al., 2005; Sunkar et al., 2005; Zhang et al., 2005)。
除了保守miRNA 外，不同物种中还存在很多物种特异的miRNA (species-specific miRNA)，这类进化上比较―年轻‖的miRNA 无疑在特定物种的形成和发育过程中扮演着重要的作用。
100/MEFI ()%MEF LG C ⨯=+表1. 植物保守miRNA家族（根据miRBase 14.0和物种多少排序）miRNA family No. of speciesmiRNAfamilyNo. of speciesmiRNAfamilyNo. of speciesmiR-159 17 miR-394 6 miR-1510 2miR-171 17 miR-157 4 miR-1514 2miR-156 16 miR-2118 4 miR-161 2miR-166 16 miR-824 4 miR-2111 2miR-167 16 miR-1507 3 miR-2275 2miR-396 15 miR-2119 3 miR-413 2miR-160 14 miR-403 3 miR-414 2miR-399 14 miR-437 3 miR-415 2miR-169 13 miR-444 3 miR-416 2miR-172 13 miR-477 3 miR-417 2miR-319 13 miR-529 3 miR-418 2miR-408 12 miR-530 3 miR-419 2miR-164 11 miR-535 3 miR-420 2miR-168 11 miR-827 3 miR-426 2miR-162 10 miR-1122 2 miR-472 2miR-390 10 miR-1127 2 miR-479 2miR-393 9 miR-1135 2 miR-783 2miR-395 9 miR-1139 2 miR-821 2miR-398 9 miR-1432 2 miR-828 2miR-397 8 miR-1435 2 miR-845 2miR-482 7 miR-1509 2miRNA通过与靶基因形成互补RNA双链来行使调节功能，这种互补性在进化过程中是保守的(Rhoades et al., 2002; Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Robins et al., 2005a)。
互补性的强弱或者说互补碱基的多寡决定了miRNA调节的不同机制。