淋巴细胞体外增殖的特点
淋巴细胞体外增殖的特性
通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞的，只有在异常情况下才能发现。
外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。
体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。
淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA) 、脂多糖(LPS)白细胞介素2 ( IL - 2) 、植物血凝素(PHA) 、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。
医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
细胞原代培养之外周血淋巴细胞培养
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外周血淋巴细胞的培养 淋巴细胞的培养 (Lymphoc浮细胞的培养方法 悬浮细胞的形态特征观察
实验原理
外周血淋巴细胞表面有丝分裂原受 当在培养液中加入丝裂原PHA PHA时 体,当在培养液中加入丝裂原PHA时, 可与淋巴细胞表面的相应受体结合 使其活化增殖. 使其活化增殖.
实验步骤( 实验步骤(4)洗剂淋巴细胞
D'Hanks液4 ml 4 ml洗一次 1640完全培养液4 ml 4 ml洗一次 每次1000rpm离心5 min,弃大部分上清, 约留1ml计数.
实验步骤(5)细胞计数 用血细胞计数板计数. 一般计数四周大方格 四周大方格内细 四周大方格 胞,密度计算公式为: 细胞密度(个/ml)=(4 大方格细胞总数 /4)×10000×稀释倍数
实验材料
骨髓细胞:来自小鼠股骨
设备及主要用品
1, 纯水制备设备 2, 电热干燥箱 3, 高压蒸汽消毒锅 4, 离心机 5, 超净台 CO2 6, CO2培养箱 过滤器及0 22 7, 过滤器及0.22m滤膜 8, 血球计数板 9,培养瓶或培养皿
实验试剂
(1)RPMI 1640 基础培养液 )
(2) 小牛血清(灭活) ) 小牛血清(灭活) (3) 青,链霉素 ) (4) PHA(2 mg/ml) ) ( ) (5) Hank's液 ) 液 (6) 5%NaHCO3 ) % (7) 75%酒精棉球 ) %
(2)获取骨髓细胞
1)断颈处死小鼠,浸泡在75%乙醇中3-5min. 2)剪切后肢,去掉肌肉,剥出股骨放入2%柠檬酸钠溶液 中,剪刀剪开两端,用注射器吸取溶液吹打将骨髓细 胞冲出,直至骨髓腔呈白色,将骨髓细胞溶液1000rpm 离心10min. 3)弃上清,将细胞重悬于2mlHanks液.
体外刺激淋巴细胞增殖作用检测
体外刺激淋巴细胞增殖试验1 样品配制精确称取样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL 的样品液。
充分溶解然后以15000g离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成所需浓度待用。
2 小鼠淋巴细胞的制备选取8-10周龄，体重22±1g的Balb c或C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。
将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以400g/min 离心6min。
吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化铵红细胞裂解液，反复冲打，静置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min离心6min，吸去上清液，加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培养基（含双抗及10％胎牛血清）混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2×106个/mL细胞液备用。
3 细胞培养将2×106个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液，以20μL PBS和20μL 60μg/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。
于37℃、含5%的CO条件下培养3d，加入相应试剂测定24 淋巴细胞增殖率的测定4.1 Alamarblue试剂测定法在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μL Alamar Blue试剂，再培养，加Alamar Blue试剂前及变色后分别用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对淋巴细胞增殖率。
计算公式为：增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%4.2 MTT法测定4.2.1 MTT 溶液的配制方法称取MTT 0.5g溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤分装，－20℃避光保存。
一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710493447.0(22)申请日 2017.06.26(71)申请人 杭州中赢生物医疗科技有限公司地址 310052 浙江省杭州市滨江区楚天路88号(72)发明人 王冶陶 吴忠福 彭昉 刘慧显 王俊俊 俞英豪 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司11332代理人 巩克栋(51)Int.Cl.C12N 5/0783(2010.01)C12N 5/10(2006.01)A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/02(2006.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 31/12(2006.01)A61P 31/10(2006.01)A61P 33/00(2006.01)A61P 1/16(2006.01)A61P 31/20(2006.01)A61P 31/18(2006.01)A61P 31/14(2006.01)(54)发明名称一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用(57)摘要本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用。
所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。
采用本发明培养体系扩增的NK细胞，NK细胞纯度高，对肿瘤细胞杀伤力强，在第14天可以将NK细胞扩增约9100倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；解决了临床应用培养体系的安全性问题，有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。
权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 107177548 A 2017.09.19C N 107177548A1.一种体外扩增淋巴细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。
MMT
实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中 将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收 集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比 加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细 胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶 以MTT为底物，形成蓝色的甲臜 （ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细 胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液， 可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间 接反映活细胞数量。
ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转 化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲 瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测 定其OD值
预பைடு நூலகம்结果：
淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的 离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离 心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液 体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液， 主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的 漂洗、配制其他试剂等）
SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖试验最佳条件的筛选
SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖试验最佳条件的筛选刘宸铄;刘芳;杨鸣琦【摘要】[目的]探讨磺酰罗丹明B法(Sulforhodamine B,SRB)检测鸡外周血T淋巴细胞增殖反应的最佳条件.[方法]体外培养鸡外周血T淋巴细胞,选用SRB法对淋巴细胞含量(1×105,1×106,2.5×106,5×106,7.5×106和1×107 mL1)、ConA质量浓度(5.0,7.5,10.0,12.5和15.0 μg/mL)、培养时间(36,48,60 h)3个因素进行组合设计培养T淋巴细胞,每个组合设3个重复,SRB显色后用酶标仪在492 nm波长处测量OD492值,计算刺激指数(Stimulation index,SI),筛选SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖的最佳条件.[结果]SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖试验的最佳条件为:淋巴细胞含量1×106 mL-1,ConA质量浓度5.0 μg/mL,培养时间48 h.[结论]确定了体外培养鸡外周血T淋巴细胞增殖的最佳ConA质量浓度、培养时间及淋巴细胞含量,证实用SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖结果可靠,是切实可行的淋巴细胞数量与活性检测方法.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(041)007【总页数】5页(P15-18,24)【关键词】鸡;外周血T淋巴细胞;细胞增殖;磺酰罗丹明B法【作者】刘宸铄;刘芳;杨鸣琦【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】R446.63;S858.31磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)法是美国国家癌症研究院(NCI)推荐的一种抗癌药物筛选方法，该方法发明于1990年，具有快速、经济、灵敏的特点[1]，其测量结果不受时间影响，如今已广泛应用于细胞数量与活性的检测。
某大学生物工程学院《细胞生物学》考试试卷(2250)
某大学生物工程学院《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（50分，每题5分）1. 对显微镜来说，最重要的性能参数是放大倍数。
（）答案：错误解析：显微镜最重要的性能参数是分辨率而不是放大倍数。
放大倍数可根据需要在使用过程中进行调节，可大可小，并不能作为性能参数。
2. 恶性肿瘤的迅速增长是由于细胞周期的时间变短，细胞分裂加快。
（）答案：错误解析：恶性肿瘤的迅速增长是因为肿瘤细失去了最高分裂次数，没有接触抑制现象，从而使得细胞分裂的速度加快。
3. 虽然龟的最高寿命是175岁，而小鼠的寿命只有几年，但它们的细胞在体外培养时分裂的极限基本相同。
（）答案：错误解析：龟细胞体外培养可分裂100次以上，而小鼠细胞在体外分裂的次数一般不超过30次。
4. 146bp的DNA双螺旋盘绕组蛋白八聚体两圈整，并由组蛋白H1锁住核小体DNA的进出端。
（）答案：错误解析：146bp的DNA双螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈；组蛋白H1在核心颗粒外结合额外的20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端。
5. 淋巴细胞在体外培养时是以贴壁的方式进行生长。
（） [中山大学2009研]答案：错误解析：淋巴细胞体外培养时悬浮生长。
6. IP3是PKC系统中的第二信使，它直接激活内质网上的钙泵，动员Ca2＋的释放。
（）答案：错误解析：IP3不能激活钙泵，只能激活内质网膜中的钙离子通道。
7. 高尔基体是一种有极性的细胞器，它的顺面总是在它的凸面。
（）答案：错误解析：高尔基体是一种有极性的细胞器，靠近细胞核的一面扁囊弯曲成凸面被称为顺面，但顺面并非总是在高尔基体的凸面，在细胞发育的某个阶段可能位于高尔基体的凹面。
8. 在内质网，脂质合成的部位和催化糖基化的部位都位于内质网腔面的一侧。
体外培养的细胞生物学特点
相同点：1，基本生物学特征相似 2，仍存在细胞和细胞、细胞和基质的
相互关系
3，具有相同的细胞结构
4，都能进行增殖和分化
举例分析
1.培养的细胞之间仍有在形态和机能上的相互 依存关系。 在结构上，如：上皮细胞仍见有桥粒 在生理活动上，单个细对细胞外基质仍 有依存性
5, 通常的体外培养是一个2D培养环境，与体 内的3D环境相比，体外培养细胞由于受到的 限制相对较小因而骨架铺展的更开。通过细胞 骨架F-actin染色可以清楚地发现体外培养的 细胞张力丝清晰，骨架自由伸展，细胞呈无规 则形状。
谢谢！
不同点： 由于人工所模拟的条件与体内实际情 况仍不完全相同当细胞被置于体外培养 后久了,生物学特征必然发生变化。
主要表现 1，单个细胞虽然能够增殖，但不如群体
细胞能力强
2，相对孤立、相对单一 3，不受体内复杂环境的影响 4， 贴壁生长和铺展 5，接触抑制和密度依赖性
举例分析 1，失去原有组织结构和细胞形态 如：肌肉细胞—纤维化, 2， 分化减弱或不显 3，出现类似“返祖”现象：细胞趋向单一化 4，获得不死性或变成具有恶性性状的细胞群
动物细胞融合技术与单克隆抗体(教师版)-高中生物同步精品讲义(选择性必修三)
《第2章细胞工程》第2节动物细胞工程二动物细胞融合技术与单克隆抗体必会知识考点梳理拓展延伸易错警示必会知识一动物细胞融合技术1．动物细胞融合技术：是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。
细胞融合的实质是核融合。
2．原理：动物细胞融合的基本原理为细胞膜的流动性。
3．诱导融合的方法(1)化学方法：PEG融合法。
(2)物理方法：电融合法。
(3)生物方法：灭活病毒诱导法。
4．过程：具有不同遗传信息的两个或多个细胞杂交。
5．结果：形成单核杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。
6．意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
这一技术成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
如利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
必会知识二单克隆抗体及其应用1．传统抗体的获得(1)方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
(2)缺陷：制备的抗体产量低、纯度低以及特异性差。
2．单克隆抗体的制备：单克隆抗体是由单一杂交瘤细胞增殖产生的高度专一的抗体。
(1)制备原理①B淋巴细胞的特点：每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，B淋巴细胞在体外不能无限增殖。
②骨髓瘤细胞的特点：在体外能大量增殖，但不能产生抗体。
③杂交瘤细胞的特点：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体。
(2)制备过程①制备产生特定抗体的B淋巴细胞：用特定的抗原对小鼠进行免疫处理，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
②培养骨髓瘤细胞。
③将小鼠的骨髓瘤细胞与从脾中得到的B淋巴细胞融合。
④用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有杂交瘤细胞才能生长。
⑤克隆化培养和抗体检测：对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
培养动物细胞
转化后的细胞可能具有恶性 性质，也可能仅有不死性而 无恶性。
永久细胞系的特征
细胞形态已发生变化，比如细胞 变小，附性减少，具有较高的 核质比；
生长速率增加，倍增时间缩短； 对血清的依赖性减小； 贴壁依赖性降低； 细胞异倍体和非整倍体增加，细
主要作用于赖氨酸或精氨酸 相连接的肽键，使细胞间 质中的蛋白水解而使细胞分 散开来。
适用于细胞间质较少的软组 织。
胰 酶 浓 度 一 般 为 0.125% 和 0.25% ， pH 为 8.0 ， 最 适 温 度37℃。
胶原酶消化法
对胶原有很强的消化作用 只对细胞间质有较好的消化 作
用，而对细胞本身影响不大. 适用于消化分离纤维性组织、 结
细胞培养用液
细胞培养用液
水 平衡盐溶液：主要由无机盐和葡萄糖组成
消化液：胰蛋白酶液、Na2-EDTA液、胶原蛋白酶液 消化液抑制液：血清、大豆胰酶抑制剂 pH调整液:NaHCO3溶液和羟乙基哌嗪乙磺酸液 抗生素液:常常青霉素和链霉素结合使用 谷 氨酰胺补充液:很不稳定，需要单独配制
5.4 原代培养技术
上皮型细胞
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同。 形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角 上皮型细胞
形，中间有圆形核。 生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层
—铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群 而单个活动。 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤。
在开放培养时，一般把细胞置于 95%空气和5%二氧化碳的混合气体 环境中进行培养。
二氧化碳培养箱