淋巴细胞体外增殖的特点
医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
细胞原代培养之外周血淋巴细胞培养
�
外周血淋巴细胞的培养 淋巴细胞的培养 (Lymphoc浮细胞的培养方法 悬浮细胞的形态特征观察
实验原理
外周血淋巴细胞表面有丝分裂原受 当在培养液中加入丝裂原PHA PHA时 体,当在培养液中加入丝裂原PHA时, 可与淋巴细胞表面的相应受体结合 使其活化增殖. 使其活化增殖.
实验步骤( 实验步骤(4)洗剂淋巴细胞
D'Hanks液4 ml 4 ml洗一次 1640完全培养液4 ml 4 ml洗一次 每次1000rpm离心5 min,弃大部分上清, 约留1ml计数.
实验步骤(5)细胞计数 用血细胞计数板计数. 一般计数四周大方格 四周大方格内细 四周大方格 胞,密度计算公式为: 细胞密度(个/ml)=(4 大方格细胞总数 /4)×10000×稀释倍数
实验材料
骨髓细胞:来自小鼠股骨
设备及主要用品
1, 纯水制备设备 2, 电热干燥箱 3, 高压蒸汽消毒锅 4, 离心机 5, 超净台 CO2 6, CO2培养箱 过滤器及0 22 7, 过滤器及0.22m滤膜 8, 血球计数板 9,培养瓶或培养皿
实验试剂
(1)RPMI 1640 基础培养液 )
(2) 小牛血清(灭活) ) 小牛血清(灭活) (3) 青,链霉素 ) (4) PHA(2 mg/ml) ) ( ) (5) Hank's液 ) 液 (6) 5%NaHCO3 ) % (7) 75%酒精棉球 ) %
(2)获取骨髓细胞
1)断颈处死小鼠,浸泡在75%乙醇中3-5min. 2)剪切后肢,去掉肌肉,剥出股骨放入2%柠檬酸钠溶液 中,剪刀剪开两端,用注射器吸取溶液吹打将骨髓细 胞冲出,直至骨髓腔呈白色,将骨髓细胞溶液1000rpm 离心10min. 3)弃上清,将细胞重悬于2mlHanks液.
体外刺激淋巴细胞增殖作用检测
体外刺激淋巴细胞增殖试验1 样品配制精确称取样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL 的样品液。
充分溶解然后以15000g离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成所需浓度待用。
2 小鼠淋巴细胞的制备选取8-10周龄，体重22±1g的Balb c或C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。
将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以400g/min 离心6min。
吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化铵红细胞裂解液，反复冲打，静置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min离心6min，吸去上清液，加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培养基（含双抗及10％胎牛血清）混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2×106个/mL细胞液备用。
3 细胞培养将2×106个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液，以20μL PBS和20μL 60μg/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。
于37℃、含5%的CO条件下培养3d，加入相应试剂测定24 淋巴细胞增殖率的测定4.1 Alamarblue试剂测定法在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μL Alamar Blue试剂，再培养，加Alamar Blue试剂前及变色后分别用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对淋巴细胞增殖率。
计算公式为：增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%4.2 MTT法测定4.2.1 MTT 溶液的配制方法称取MTT 0.5g溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤分装，－20℃避光保存。
一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用[发明专利]
![一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/736d7e3691c69ec3d5bbfd0a79563c1ec4dad755.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710493447.0(22)申请日 2017.06.26(71)申请人 杭州中赢生物医疗科技有限公司地址 310052 浙江省杭州市滨江区楚天路88号(72)发明人 王冶陶 吴忠福 彭昉 刘慧显 王俊俊 俞英豪 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司11332代理人 巩克栋(51)Int.Cl.C12N 5/0783(2010.01)C12N 5/10(2006.01)A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/02(2006.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 31/12(2006.01)A61P 31/10(2006.01)A61P 33/00(2006.01)A61P 1/16(2006.01)A61P 31/20(2006.01)A61P 31/18(2006.01)A61P 31/14(2006.01)(54)发明名称一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用(57)摘要本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用。
所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。
采用本发明培养体系扩增的NK细胞，NK细胞纯度高，对肿瘤细胞杀伤力强，在第14天可以将NK细胞扩增约9100倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；解决了临床应用培养体系的安全性问题，有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。
权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 107177548 A 2017.09.19C N 107177548A1.一种体外扩增淋巴细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。
MMT
实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中 将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收 集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比 加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细 胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶 以MTT为底物，形成蓝色的甲臜 （ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细 胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液， 可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间 接反映活细胞数量。
ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转 化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲 瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测 定其OD值
预பைடு நூலகம்结果：
淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的 离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离 心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液 体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液， 主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的 漂洗、配制其他试剂等）
SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖试验最佳条件的筛选
SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖试验最佳条件的筛选刘宸铄;刘芳;杨鸣琦【摘要】[目的]探讨磺酰罗丹明B法(Sulforhodamine B,SRB)检测鸡外周血T淋巴细胞增殖反应的最佳条件.[方法]体外培养鸡外周血T淋巴细胞,选用SRB法对淋巴细胞含量(1×105,1×106,2.5×106,5×106,7.5×106和1×107 mL1)、ConA质量浓度(5.0,7.5,10.0,12.5和15.0 μg/mL)、培养时间(36,48,60 h)3个因素进行组合设计培养T淋巴细胞,每个组合设3个重复,SRB显色后用酶标仪在492 nm波长处测量OD492值,计算刺激指数(Stimulation index,SI),筛选SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖的最佳条件.[结果]SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖试验的最佳条件为:淋巴细胞含量1×106 mL-1,ConA质量浓度5.0 μg/mL,培养时间48 h.[结论]确定了体外培养鸡外周血T淋巴细胞增殖的最佳ConA质量浓度、培养时间及淋巴细胞含量,证实用SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖结果可靠,是切实可行的淋巴细胞数量与活性检测方法.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(041)007【总页数】5页(P15-18,24)【关键词】鸡;外周血T淋巴细胞;细胞增殖;磺酰罗丹明B法【作者】刘宸铄;刘芳;杨鸣琦【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】R446.63;S858.31磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)法是美国国家癌症研究院(NCI)推荐的一种抗癌药物筛选方法，该方法发明于1990年，具有快速、经济、灵敏的特点[1]，其测量结果不受时间影响，如今已广泛应用于细胞数量与活性的检测。
某大学生物工程学院《细胞生物学》考试试卷(2250)
某大学生物工程学院《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（50分，每题5分）1. 对显微镜来说，最重要的性能参数是放大倍数。
（）答案：错误解析：显微镜最重要的性能参数是分辨率而不是放大倍数。
放大倍数可根据需要在使用过程中进行调节，可大可小，并不能作为性能参数。
2. 恶性肿瘤的迅速增长是由于细胞周期的时间变短，细胞分裂加快。
（）答案：错误解析：恶性肿瘤的迅速增长是因为肿瘤细失去了最高分裂次数，没有接触抑制现象，从而使得细胞分裂的速度加快。
3. 虽然龟的最高寿命是175岁，而小鼠的寿命只有几年，但它们的细胞在体外培养时分裂的极限基本相同。
（）答案：错误解析：龟细胞体外培养可分裂100次以上，而小鼠细胞在体外分裂的次数一般不超过30次。
4. 146bp的DNA双螺旋盘绕组蛋白八聚体两圈整，并由组蛋白H1锁住核小体DNA的进出端。
（）答案：错误解析：146bp的DNA双螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈；组蛋白H1在核心颗粒外结合额外的20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端。
5. 淋巴细胞在体外培养时是以贴壁的方式进行生长。
（） [中山大学2009研]答案：错误解析：淋巴细胞体外培养时悬浮生长。
6. IP3是PKC系统中的第二信使，它直接激活内质网上的钙泵，动员Ca2＋的释放。
（）答案：错误解析：IP3不能激活钙泵，只能激活内质网膜中的钙离子通道。
7. 高尔基体是一种有极性的细胞器，它的顺面总是在它的凸面。
（）答案：错误解析：高尔基体是一种有极性的细胞器，靠近细胞核的一面扁囊弯曲成凸面被称为顺面，但顺面并非总是在高尔基体的凸面，在细胞发育的某个阶段可能位于高尔基体的凹面。
8. 在内质网，脂质合成的部位和催化糖基化的部位都位于内质网腔面的一侧。
体外培养的细胞生物学特点
相同点：1，基本生物学特征相似 2，仍存在细胞和细胞、细胞和基质的
相互关系
3，具有相同的细胞结构
4，都能进行增殖和分化
举例分析
1.培养的细胞之间仍有在形态和机能上的相互 依存关系。 在结构上，如：上皮细胞仍见有桥粒 在生理活动上，单个细对细胞外基质仍 有依存性
5, 通常的体外培养是一个2D培养环境，与体 内的3D环境相比，体外培养细胞由于受到的 限制相对较小因而骨架铺展的更开。通过细胞 骨架F-actin染色可以清楚地发现体外培养的 细胞张力丝清晰，骨架自由伸展，细胞呈无规 则形状。
谢谢！
不同点： 由于人工所模拟的条件与体内实际情 况仍不完全相同当细胞被置于体外培养 后久了,生物学特征必然发生变化。
主要表现 1，单个细胞虽然能够增殖，但不如群体
细胞能力强
2，相对孤立、相对单一 3，不受体内复杂环境的影响 4， 贴壁生长和铺展 5，接触抑制和密度依赖性
举例分析 1，失去原有组织结构和细胞形态 如：肌肉细胞—纤维化, 2， 分化减弱或不显 3，出现类似“返祖”现象：细胞趋向单一化 4，获得不死性或变成具有恶性性状的细胞群
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
淋巴细胞体外增殖的特性
通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞的，只有在异常情况下才能发现。
外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。
体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。
淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA) 、脂多糖(LPS)白细胞介素2 ( IL - 2) 、植物血凝素(PHA) 、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。