痰结核分枝杆菌培养操作
结核杆菌痰培养操作流程
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肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测的金标准是基于培养和鉴定结核分枝杆菌。
以下是具体步骤：
1.痰液样本收集：患者需要提供早晨醒来时的深咳痰液样本，
以获得有效的细菌数量。
2.痰液预处理：痰液样本经过预处理，包括离心和去除杂质。
这一步通常包括液体化和浓缩痰液。
3.痰液培养：将预处理后的痰液接种到培养基上，通常是液体
培养基。
培养基中的结核分枝杆菌将逐渐增殖形成菌落。
4.鉴定：通过常规培养、染色和生化试验等方法，鉴定已培养
的菌落是否为结核分枝杆菌。
5.药敏试验：对已鉴定的结核分枝杆菌进行药敏试验，以确定
哪些药物对其具有抗菌作用，从而为治疗方案的选择提供依据。
此方法被认为是金标准，因为它能够准确检测到结核分枝杆菌，并且可以确定其对药物的敏感性，为结核病的诊断和治疗提供可靠的结果。
但是，该方法需要相对较长的时间（通常需要几周）来进行培养和鉴定，因此在临床实践中可能需要其他更快速的检测方法来尽早确诊结核病。
痰结核菌培养方法
痰结核菌培养方法
痰结核菌培养是一种常见的痰液检测方法，用于检测结核病患者的痰液中是否存在结核菌。
以下是痰结核菌培养的一般步骤：
1. 收集痰液样本：结核病患者在早晨醒来后要深呼吸几次，以增加痰液样本的数量。
使用无菌容器收集新鲜的痰液样本。
2. 样本处理：将收集到的痰液样本进行处理。
先将样本离心，去除上清液。
然后用无菌生理盐水将沉淀部分悬浮均匀。
3. 接种培养基：将处理后的痰液样本接种到含有结核菌培养基的培养皿中，可以使用Lowenstein-Jensen培养基或7H10/7H11固体培养基。
4. 培养条件：将接种的培养皿放置于恒温培养箱中，温度保持在37左右。
结核菌通常需要较长的培养时间，通常为4至6周。
5. 观察结果：定期观察培养皿上是否有结核菌生长。
如果出现白色、凹陷、葡萄糖乳酸盐降解试验阳性等菌落形态特征，有可能是结核菌。
需要进一步进行酸酐试验和分子检测等确认。
需要注意的是，培养结核菌是一项复杂的技术，需要在严格的实验室条件下进行操作。
为了确保检测结果的准确性，还需要进行负对照和对照品的培养，以确保
所获得的结核菌是具有活力的。
此外，在进行痰结核菌培养之前，通常还会进行痰液的酸酐染色和结核菌PCR 等检测方法，以提高诊断结核病的准确性。
最终的诊断还必须通过其他临床表现、X光胸片和病理学等多种检查手段来综合判断。
结核实验室痰培养与分子检测
结核实验室痰培养与分子检测结核实验室痰培养与分子检测是结核病诊断和监测的重要手段。
痰培养，也被称为结核病分枝杆菌分离培养检查法，是结核病病原学诊断的“金标准”。
该方法主要分为液态培养和固态培养两种，我国推荐使用罗氏培养基简单法进行培养。
此外，分子学检查也是结核病诊断的重要方法。
目前，结核病细菌学领域以核酸为基础的分子生物学检测技术进展迅速。
以下是关于这两种方法的详细描述：一、结核实验室痰培养（1）痰培养的原理：分枝杆菌培养是依据分枝杆菌的生长规律，根据营养和代谢需要的条件，人工营造提供出有利于分枝杆菌生长而抑制其他细菌生长的环境，达到分离出分枝杆菌的目的。
常用的固体培养有罗氏、改良罗氏培养基、Middlebrook7H10或7H11；常用的液体液体培养以Middlebrook7H9为基础。
（2）痰培养的过程2.1痰培养前处理前处理的步骤：①取1-2ml痰标本至前处理管；②视标本性状加入1-2倍体积的4％氢氧化钠；③震荡30s至标本完全液化；④室温静置15分钟（整个处理时间不得超过20分钟）前处理方法：①简单法-碱处理法：分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点，能耐受碱性消化液的处理，消化液直接接种于酸性培养基上，酸性培养基能中和碱性标本处理液，分枝杆菌能在酸性的培养基上生长。
②中和离心法：经含NaOH的N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）消化后，磷酸缓冲液（PH6.8）中和后，接种到中心培养基上。
2.2接种接种的步骤：①准备好两支培养基；②去除培养基中过多的凝固水；③用无菌吸管取前处理后的标本；④接种0.1-0.15 ml（2-3滴）至罗氏培养基斜面；⑤尽量使菌液均匀铺满斜面；⑥每份标本接种2支培养基。
2.3孵育孵育的步骤：①接种后斜面水平向上，36±1℃孵育24小时；②之后将培养基直立，继续36 ±1 ℃孵育8周（检查瓶盖是否拧紧）；③培养箱温度监测。
2.4结果的观察与报告①接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况（污染、快速生长分枝杆菌）；②此后每周观察一次，直至满8周（阴性）；③每次观察记录菌落生长及污染情况；④满8周后未见菌落生长，可报告分枝杆菌生长阴性，培养管高压后丢弃；⑤发现显著污染以至无法观察结果，记录“污染”，培养管高压后丢弃；⑥发现疑似分枝杆菌生长，将菌株送上级实验室进行药敏试验二、分子检测分子诊断诊断具有检测周期短、检测结果准确可靠的特点。
结核杆菌培养操作流程
结核杆菌培养操作流程
朋友！今天来跟您唠唠结核杆菌培养这档子事儿。
想当年我刚开始接触这玩意儿的时候，那叫一个懵啊！不过慢慢也就摸出点门道了。
咱先说说准备工作哈。
您得把那些瓶瓶罐罐的都准备好，像培养皿啦、培养基啦，可别少了。
我跟您说，有一回我就忘了拿培养基，那叫一个尴尬！
然后呢，采集样本。
这可得小心着点儿，别弄得到处都是。
我记得有次小李采集样本的时候，手一抖，差点就搞砸了。
接下来就是接种啦。
这一步可关键了，动作得轻、得准。
我当初学这个的时候，总是掌握不好力度，不是多了就是少了，唉！
培养的时候，温度和时间可得控制好。
我记得好像是 37 度左右，时间嘛，大概得几周。
不过也可能记错喽，您可得再确认确认。
哇，这中间还得时不时观察观察，看看有没有啥变化。
有一次我观察晚了，差点就错过了重要的情况。
嗯...说到这，我突然想起个事儿。
之前听说有个同行，在培养的时候居然把培养箱的温度调错了，结果全白费了，您说多可惜！
对了，还有个小细节得跟您说。
这培养的时候啊，有时候会有点怪怪的味道，您可别被吓到。
如果您在操作过程中发现有啥不对劲的，别慌，赶紧停下来找找原因。
我这又扯远啦。
反正您就按照这些步骤来，多练几次，准能行！
怎么样，朋友，您觉得能搞明白不？。
结核杆菌培养标准操作流程
分支杆菌培养阳性（3+）：菌落占斜面面3/4 分支杆菌培养阳性（4+）菌落布观察分支杆菌生长情况时，发现有非分支 杆菌生长，报告污染，重新送检。污染必须 控制在2%以下，当污染率高于2%时，提示 培养基污染或消化处理不当，应采取相应措 施，查寻和分析原因。
3、痰标本的保存和输送
痰标本容器密封，勿倒置，严防痰液外 溢。不能立即培养的痰标本，须置4℃冰箱 保存，防止痰液干涸或污染。
二、结核分支杆菌培养操作规程
培养基 酸性改良罗氏（分离培养）——目前由州 疾控统一购买按任务数配发并4℃冰箱保存。 1、将培养基从冰箱取出，恢复到室温并在培 养管上编培养序号，写上患者姓名、培养 日期、痰涂片编号等信息。 2、标本前处理：碱处理法 取2mL痰标本于前处理管中加1-2倍痰标本量 的4%NaOH，振荡器上震动30-60s后室温 放置10-15min（不得超过20min）。
一、痰标本的采集
1、痰标本的种类 根据痰标本采集时间，可 将标本分为3类： （1）即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液； （2）清晨痰：患者晨起立即用清水漱口后咳 出的第2口、第3口痰液； （3）夜间痰：送痰前一日患者晚间咳出的痰 液。
2、正确的咳痰方法：
（1）咳嗽前应缓慢的深吸气，吸气后稍屏气片刻。 （2）躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸 壁下部，内收并稍加力。 （3） 咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次 深吸气可连续咳嗽三声。 （4）停止咳嗽并收缩将剩余的气体尽量呼尽。 （5）在缓慢吸气或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的 动作。 （6）勿将漱口水、唾液、呕吐物、鼻咽分泌物等混 入痰内，以免影响检验结果。如标本不合格，检验 人员应当拒收，并和临床医生对接，重新采样。 （7）标本量一般在3～5毫升。
结核分枝杆菌痰培养方法
结核分枝杆菌痰培养方法结核病是一种大家较为熟知的慢性传染性疾病，由结核分枝杆菌感染引起。
可通过空气传播，且感染剂量很低，人吸入很少的结核分枝杆菌即可引起感染。
该疾病会在任何年龄发病，而免疫力低下的患者更容易感染结核分枝杆菌。
近年来，随着艾滋病发病率的增加，耐药性结核分枝杆菌的出现，吸毒人群的增多以及免疫抑制剂的应用等，我国结核病发病率仍然较高。
结核病已成为威胁人类健康的全球性的严重的公共卫生问题。
如何知道自己得了结核病呢？当人体感染结核杆菌后，因感染的部位不同，会出现不同的临床症状。
例如肺结核患者主要会表现出咳嗽，咳痰，咯血，胸痛，低烧，盗汗，乏力等一些呼吸道疾病症状。
而感染肾脏时，患者会出现尿急，尿痛，血尿等泌尿系统症状。
大部分患者感染结核杆菌后会出现不同程度的低热，盗汗，虚弱等等。
当人体出现以上症状时，即可高度怀疑为结核病。
出现自觉症状后，就医后医生首先会建议患者进行影像学诊断，以此来确定结核分枝杆菌感染的脏器部位，同时也会进行体液培养来进一步确定患者是否感染了结核杆菌，通常会采取患者的痰液来进行检验。
让我们进一步来了解一下吧。
一、什么是结核杆菌？结核杆菌即为结核分枝杆菌。
它是引起结核病的病原体，而结核杆菌是一种较为古老的细菌，早在4500年前的古埃及，人们就已经发现了这种细菌的存在。
古代时大家将肺结核患者称为肺痨患者。
在1882年，该病菌由一名德国的细菌学家郭霍发现后，才被正式命名为结核菌。
结核分枝杆菌是一类专性需氧菌，它生长较为缓慢。
对干燥，冷，酸碱等抵抗力非常的强，在紫外线的照射下，痰液中的结核杆菌需要经过六个小时左右才会被彻底杀死。
目前痰培养是确定结核杆菌感染的主要检查项目，经过痰液培养分离细菌可以发现，结核分枝杆菌革兰染色不易着色，需用特殊染色方法荧光染色或萋—尼抗酸染色。
经抗酸染色后菌体为红色细长直或略弯的杆菌，该细菌没鞭毛，无芽孢，有荚膜，多数有异染颗粒。
荧光染色、抗酸染色如图：从致病性角度分析可见，结核杆菌本身不会产生内外毒素，其致病物质主要是他的荚膜、脂质以及蛋白质。
结核杆菌培养标本处理标准操作程序
结核杆菌培养标本处理标准操作程序1 检验目的结核病的确证诊断。
2 样本类别痰、尿、粪、脑脊液、胸腹水、分泌物等。
3 采样容器无菌容器或运送培养拭子。
4 试剂4％NaOH、罗氏培养基。
5 检验程序5.1 标本采集和处理5.1.1 痰标本：用无菌容器留取清晨痰，用 4％NaOH 等量进行前处理 5 分钟，3000r/min 离心 30 分钟，取沉渣接种罗氏培养基 2 枝，37℃孵育 4 周。
5.1.2 尿标本：留取晨尿(或 24H 尿的沉淀部分 10- 15ml)送检，用 4％NaOH 等量进行前处理 5 分钟，3000r/min 离心 20 分钟，取沉渣接种罗氏培养基 2 枝，37℃孵育 4 周。
5.1.3 粪标本：留取 5-10 克粪便于广口瓶中，加入生理盐水 30-40ml，用玻棒搅拌，静置 10 分钟，吸取混悬液部分，3000r/min 离心 30 分钟，取沉渣接种罗氏培养基 2 枝，37℃孵育 4 周。
5.1.4 脑脊液、胸腹水：将标本 3000r/min 离心 30 分钟，取沉渣接种罗氏培养基 2 枝，37℃孵育 4 周。
5.1.5 分泌物：直接接种罗氏培养基 2 枝，37℃孵育 4 周。
5.2 细菌鉴定5.2.1 染色：取 2 周后罗氏培养基上生长菌落涂片，作抗酸染色5.2.2 鉴定：取菌落进行相应的生化鉴定(手工或仪器)5.3 结果报告5.3.1 阴性结果报告：结核培养未生长。
5.3.2 阳性结果报告：结核菌名。
6 质控程序见室内质控操作程序。
7 注意事项7.1 结核菌培养时，污染标本要进行前处理，防止普通细菌的干扰。
7.2 结核菌接种应在生物安全柜中。
7.3 液体标本应离心，增加阳性率。
8 临床意义结核菌在人群中传播，并使之感染和发病，与患者排菌量有密切关系。
结核病的主要传染源是续发性结核病痰涂片检查阳性的患者，痰涂片检查可作为肺结核诊断的重要依据。
对于生长繁殖的结核菌，抗结核药的杀菌作用得到充分发挥，而处于代谢缓慢生长期的结核菌，药物几乎不起作用，因此，结核菌培养是化学治疗效果的重要指征。
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痰分枝杆菌培养操作
注意：培养操作必须在二级生物安全实验室以上的防护条件下进行，穿戴个人防护装备确保安全！
一、材料与准备
1.实验物品：生物安全柜、漩涡振荡器、计时器、斜面架、培养箱、记号笔、登记本。
2.耗材（每份标本）：前处理管、无菌4%NaOH、无菌吸管（3支）、酸性罗氏培养基（2支）。
3.准备工作：
①将培养基从冷藏环境取出，检查培养基（污染或干裂的弃去不用），合格的培养基室温放置5-10
分钟，待其恢复至室温，拭去外壁的凝结水后在培养基斜面背面标记编号、患者姓名、接种日等；
②取无菌的前处理管，标记患者姓名、实验室编号；
二、标本处理与接种
1.在生物安全柜内，用无菌吸管吸取痰标本1-3ml，加入到前处理管中；
2.视痰标本性状加1-2倍体积的4%NaOH溶液，立即开始计时15分钟；
3.涡旋振荡30-60秒后室温静置，直至15分钟结束（如果标本较多，应当分别处理，保证氢氧化钠
处理时间不超过20分钟！）；
4.检查培养基的凝固水，如果过多，应沿培养基管壁弃去，避免凝固水流经斜面
5.用无菌吸管吸取经过前处理的痰标本，接种0.1ml至培养基斜面，尽可能将标本铺满斜面（可在
斜面上部和中部各滴一滴标本液，拧紧培养基管盖后向各方向倾斜），每份标本接种两支培养基；
三、培养与观察
1. 新接种的培养基放在斜面架上，保证斜面水平向上，在培养箱37℃培养24小时；
2. 24小时之后，将培养基竖直放置，继续培养；
3. 接种后第3天、第7天各观察一次，如果有菌落生长，则进行涂片镜检以鉴别污染菌或速生分枝
杆菌。
以后每周观察一次，并记录结果；
4. 至第八周末，仍无菌生长，可报分枝杆菌阴性。
5. 典型的结核分枝杆菌菌落形态为淡黄色、菜花样、粗糙、干燥、不透明。
非典型分枝杆菌菌落形
态不一，有的与结核杆菌相似，有的黄色、湿润、光滑。
6.如查不能区分杂菌污染和非结核分枝杆菌，应进行涂片抗酸染染色镜检，如为非抗酸菌，则报告
污染（如果培养实验室仅承担菌株分离任务，则不需在培养实验室涂片确认）。
四、结果报告标准：
1. 菌落生长不足斜面面积1/4，报告实际菌落数
2. 菌落生长占斜面面积1/4，分枝杆菌培养阳性（1+）
3. 菌落生长占斜面面积2/4，分枝杆菌培养阳性（2+）
4. 菌落生长占斜面面积3/4，分枝杆菌培养阳性（3+）
5. 菌落生长布满了整个斜面，分枝杆菌培养阳性（4+）
附图：
培养基外观菌落外观。