N 病毒毒力测试实验
标准操作规程(SOP)——禽流感病毒H5N1 NASBA检测
一、目的确保H5N1禽流感疑似病例标本得到有效的检测，为禽流感H5N1感染提供可靠的实验室诊断依据。
国家流感中心实验室按照规定方法对疑似H5N1禽流感感染病例的标本进行处理和检测，使疑似禽流感病例标本的处理和检测得到有效的控制。
保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。
二、范围适用中国国家流感中心操作人员进行疑似H5N1禽流感病例标本的检测。
三、定义核酸序列依赖性扩增（Nuclear acid sequence-based amplification ，NASBA ）检测技术是一项快速等温核酸扩增并能实时观测结果的检测技术，该技术的检测反应有赖于AMV 逆转录酶、噬菌体T7 RNA 多聚酶、核糖核酸酶H 、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。
如下是在检测结果分析中涉及到的几个概念：1．样品检测信号值（WT signal ）：在扩增过程中分子信标探针与靶基因发生特异性结合后，产生荧光信号的荧光信号被收集经软件转换后的强度值，即WT signal 。
2．阈值（threshold ）：在NASBA 反应过程中会产生荧光信号，阈值是判断阴性或阳性结果的荧光信号界线值，样本荧光信号≥阈值者为阳性，反之为阴性。
图1：NASBA 检测标准曲线Time WT Signal标准操作规程（SOP H5N1 NASBA四、背景本SOP是为了疑似H5N1禽流感感染的诊断而制定，确保禽流感病例诊断的快速性和可靠性，同时要求实验操作过程中标本不被污染或污染环境。
五、程序（一）生物安全要求标本裂解在BLS-3实验室，其余操作部分在具有规范分区（体系配制区、核酸提取区和检测分析区）的BSL-2级实验室进行并遵守相应生物安全规定。
详细生物安全防护参见“生物安全个人防护SOP”。
（二）材料及仪器1．梅里埃公司 Nulisens EasyQ 检测分析系统。
2．孵育器3．离心机4．移液器：规格分别为0.5~10μL、20~200μL和100~1000μL各一支。
杀菌剂的毒力测定和
（2）抑菌圈法
广泛地应用于真菌细菌的杀菌剂筛选，基本原理是 将病原菌孢子或菌丝的悬浮液与琼脂培养基混匀冷 凝后，在培养基平面放上消毒的并蘸有不同浓度药 剂的圆形滤纸片（直径6mm）左右，或放特制的直 径8mm高10mm的不锈钢环，将配好的药液定量加 在钢环内，经定温培养一定时间后，由于药剂的扩 散作用，使病菌生长受到抑制，即形成“抑菌圈”。 测量抑菌圈的大小，以比较杀菌剂的毒力。
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（2）治疗作用：
测定方法是先在植株上接菌，保温，保湿 一定时间，待病菌菌丝侵入或始见发病，再 进行喷药处理，其他调查统计方法同上。
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（3）内吸作用：
测定根的内吸输导试验，可以采用水培的稻株或棉株，在营 养液中加定量的药剂，待24h或48h后进行接菌，发病后调查， 若以土培盆栽方法，则药液定量灌入土中，程序与上相同。
❖ 持效期的试验：
以上各种方法，用先喷药后接菌或先接菌后喷药，间隔不同 日期进行处理，可以测定杀菌剂残效。
❖ 剪叶法分级标准：
0 级 （ 不 发 病 ） ； 1 级 （ ＜ 剩 余 叶 面 1/4 ） ； 2 级 （ 剩 余 叶 面 1/4-1/2）；3级（＞剩余叶面1/2）；4级（全部发病）。
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离体测定能反映化合物毒力的本质和程度，方法简便，为研 制新农药不可缺少，但它存在有一点缺点，应该和温室活体的 盆栽试验结合起来。
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1.毒力测定的方法
室内离体平板法： （1）孢子萌发测定法 （2）抑菌圈法 （3）生长速率测定法
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（1）孢子萌发测定法
有载玻片萌发法及平板培养基培养法。 即将不同的药液喷布于玻片表面或平板上，定量 滴加孢子悬浮液，药液与悬浮液接触后，经一定培育 时间，镜检孢子萌发的百分率，载玻片法适合于水溶 性较好的保护剂，能计算单位面积药液的沉积量及药 液浓度，接近实际条件，但对萌发时需氧较多的病原 菌不适用。 平板萌发适用于不易分解的保护剂，根据测定对象 生长需要的配方来制备合适的培养基，由于孢子在培 养基的表面能得到较充足的空气，萌发时不致因缺少 氧而受影响。
N 病毒毒力测试实验
毒力测试技术路线前言:虫媒病毒（Arbovirus ）是指由吸血昆虫传播的病毒，其特点是病毒可在昆虫体内繁殖，但昆虫本身不发病，昆虫通过叮咬将病毒传播给人、畜引起疾病，因此虫媒病毒可以引起人畜共患传染病（1）。
套式病毒（Nidoviruses ）包括了冠状病毒（Coronaviridae ）和动脉炎病毒（Arteriviridae ）及罗尼病毒（Roniviridae ），主要感染哺乳动物、少数禽类及无脊椎动物（虾），由于其独特的套式转录机制和较长基因组（12.7~31.7bp）的特征，被认为是最复杂的单股正链RNA病毒（2）。
国内，深圳市龙岗区疾控中心开展了虫媒监测项目，从医院监测点捕获的成蚊标本中首次发现昆虫套式病毒NDiV，并应用C6/36细胞成功地分离到NDiV 病毒，是目前国内对NDiV的研究仅有这一篇报道（3）。
国外,2011年，mBio报道了首篇昆虫套式病毒的研究（4），在科特迪瓦的原始森林的库蚊中首次发现了昆虫套式病毒，命名为Cavally virus（CA VV）。
同年，PlOS Pathogens刊登（5）同为昆虫套式病毒的研究，病毒于2002年在越南急性脑炎病人的脑脊液中分离成功（6），在当地库蚊标本也分离得到，作者Phan Thi Nga 根据病毒的分离地点将其命名为Nam Dinh Virus（NDiV）。
由于NDiV和CA VV 的宿主与分子特性相似，与套式病毒中的已有家族存在差异，故Phan Thi Nga 将其归类为Nidoviruses的新家族，命名为Mesoniviridae（7）。
传统意义的套式病毒（Nidoviruses）包括冠状病毒（Coronaviridae）、动脉炎病毒（Arteriviridae）及罗尼病毒（Roniviridae），主要感染哺乳动物、少数禽类及无脊椎动物（虾），由于其独特的套式转录机制和较长基因组（12.7~31.7kb）的特征，被认为是最复杂的单股正链RNA病毒。
残杀威的室内毒力生物测定的试验方案
残杀威的室内毒力生物测定的试验方案残杀威（Qiang Sha Wei，一种杀虫剂）在室内的毒力测定方案。
残杀威主要针对害虫，如蚊子、苍蝇和蟑螂等。
以下是一个基于残杀威的室内毒力测定实验方案：1. 实验材料和设备：- 实验样本：室内常见害虫，例如蚊子、苍蝇和蟑螂。
- 残杀威：具有足够有效浓度的残杀威产品。
- 实验板：用于毒力测定实验的标准品，通常由两个试验区组成，一个是对照区，另一个是毒力区。
- 毒力测定板：专门设计用于毒力测定实验，通常包括两个实验区和一个对照区。
- 显微镜、解剖刀、滴管、镊子等实验工具。
2. 实验步骤：- 准备实验样本：将实验样本（如蚊子、苍蝇和蟑螂）放入适当的容器中，例如试管或培养皿。
- 配制毒力测定溶液：使用适当的化学溶剂（例如酒精）将残杀威溶解，配制适当浓度的毒力测定溶液。
- 在标准区和毒力区涂抹标准品：将标准品均匀地涂抹在标准区和毒力区的板上。
- 制备对照组：使用无菌生理盐水或蒸馏水等无菌物质在对照区涂抹标准品。
- 添加毒力测定溶液：将毒力测定溶液分别添加到标准区和毒力区的板上。
- 设置对照组：在对照区涂抹同等剂量的无菌生理盐水或蒸馏水。
- 设置实验组：将相应的实验样本放入每个实验组的区域中。
- 孵育：将实验板放入恒温箱或其他适当的条件下孵育，孵育时间根据实验样本的种类和实验需求而定。
- 观察和记录：在孵育时间结束后，使用显微镜观察并记录实验样本在毒力区的数量。
- 数据整理和分析：根据实验数据，计算每种实验样本的毒力指数（例如，病毒的毒力指数可定义为感染的实验样本数/对照区的实验样本数）。
- 实验结果报告：撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果和讨论等内容。
请注意，本实验方案仅供参考，实际实验操作应根据具体实验要求和实验条件进行调整。
同时，在进行实验时，应遵守实验室安全规程，确保实验人员和环境的安全。
CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定
CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定文兆海;周海滢;翟少华;陈凯云;胡远;简子健【摘要】为了探究CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及对小鼠的免疫效果,将CDV-N 重组狂犬病病毒于BSR细胞上扩毒培养、浓缩后测定其FFD50及LD50;将浓缩后的重组病毒液与复合佐剂按一定比例混匀,按不同免疫剂量、不同免疫方式分组免疫接种小鼠,利用ELISA试剂盒对狂犬病、犬瘟热的特异性抗体进行定性/定量检测.结果显示,重组病毒浓缩后的FFD50值为7.85 logFFD50/0.1 mL,LD50值为7.67 logLD50/0.03 mL;免疫接种后第14天抗体阳性率达100％,小鼠血清中的特异性抗体IgG水平随着免疫剂量的递增而递增.试验结果可为CDV-N重组狂犬病病毒制备口服弱毒疫苗的进一步研究提供试验数据.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】7页(P21-27)【关键词】重组狂犬病病毒;半数荧光灶形成量;半数致死量;免疫;抗体【作者】文兆海;周海滢;翟少华;陈凯云;胡远;简子健【作者单位】新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的以侵犯中枢神经系统为特征的一种高度致死性人兽共患传染病[1-2]。
患病动物的唾液中含有大量的RV，一般通过咬伤的方式，RV经唾液进入伤口沿着外周神经向中枢神经系统进犯，一旦到达大脑神经中枢，则引发狂犬病[3-4]。
而犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的病死率高达80%以上的一种急性高度接触性传染病，具有极强传染性[5]。
微生物 in vivo 毒性测试技术在食品安全检测中的应用
微生物 in vivo 毒性测试技术在食品安全检测中的应用在如今的社会，食品安全问题已经成为了人们生活中的一大隐患。
由于食品中常常会残留着一些对人体有害的物质，因此食品安全检测就显得尤为重要。
而在食品安全检测中，微生物 in vivo 毒性测试技术成为了一项重要的检测手段。
所谓微生物 in vivo 毒性测试技术，就是将某种食品添加一定量的微生物（如大肠杆菌等）后，再将其喂养于小白鼠、大鼠等哺乳动物中，通过观察它们的生理反应，例如体重变化、呕吐、腹泻等来判断该食品是否存在毒性。
这种毒性测试技术的优势在于它可以模拟真实食品摄入的情况，更加贴近于人体环境，可以准确地判断某种食品是否有害健康，因此在食品安全检测中的应用逐渐逐渐增多。
事实上，微生物 in vivo 毒性测试技术也已经被广泛地应用于国际食品安全检测中，如美国食品和药品管理局、欧洲食品安全局等均将其认可为一项重要的检测手段。
而在国内，微生物 in vivo 毒性测试技术也已经逐渐开始被广泛采用。
在实际应用中，微生物in vivo 毒性测试技术能够对食品中的微生物、添加剂、化学物质等进行快速的检测。
例如，针对某一种添加剂，我们可以将其加入到小白鼠的饲料中，再观察小白鼠的身体反应，如体重下降、呕吐、腹泻等，就可以初步确定该添加剂是否存在毒性。
此外，微生物in vivo 毒性测试技术还可以对食品中的微生物进行快速的检测。
例如，将某一种细菌加入到小白鼠的食物中，观察小白鼠是否患上细菌相关的疾病，就可以初步确定该食品中是否存在细菌污染。
当然，微生物 in vivo 毒性测试技术也有其缺点，它所涉及的检测时间较长，需要多次进行实验才能得出稳定可靠的结果。
同时，检测过程中也需要大量的动物参与，这也在一定程度上受到了动物保护组织的反对。
因此，在使用微生物 in vivo 毒性测试技术时，需要注意细节和前期准备工作的做好以及对动物的保护。
总的来说，微生物 in vivo 毒性测试技术的应用为我们保障食品安全提供了一种有效可行的手段。
诺如病毒实验室检测
诺如病毒实验室检测诺如病毒实验室检测诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。
NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。
诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。
2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。
诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。
诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。
诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。
诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。
诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。
诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V （GGV）各有1个基因群。
与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。
一、标本采集注意事项：粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。
[基础科学]实验三__病毒感染力的滴定
![[基础科学]实验三__病毒感染力的滴定](https://img.taocdn.com/s3/m/94b31f543968011ca30091ed.png)
的DMEM
PRV感染IBRS-2典型病变：
细胞变圆、固缩，折射率增加
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3
三、实验用传代细胞的准备
1. 取长满单层的细胞(IBRS-2)一瓶，倾去培养液。
2. 加入1-2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟， 至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。
实验三 病毒感染力（毒力）的滴定
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1
一、实验目的
➢ 了解正常细胞、病毒致细胞病变（CPE） 的形态、病毒感染力测定的几种方法
➢ 掌握半数细胞培养物感染量(TCID50)的 操作步骤、计算方法及含义
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二、材 料
1. 96孔细胞培养板、加样器(200ul)、枪头、 Eppendorf管(1.5ml)
2、Karber法
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lgTCID50=L-d(s-0.5) L：最高浓度的稀释度的对数 d：稀释度对数之间的差 s：阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875 TCID50=10-3.875/100ul 含义:将该病毒稀释103.875倍接种96孔细胞培养板 ，每孔100µl，可使50%接种孔的细胞发生病
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1、Reed-Muench法
CPE：Cytopathic effect
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距离比例＝（91.6-50）/（91.6-40） ＝0.8
lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于 50%病变率的稀释度的对数
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
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毒力测试技术路线前言:虫媒病毒（Arbovirus ）是指由吸血昆虫传播的病毒，其特点是病毒可在昆虫体内繁殖，但昆虫本身不发病，昆虫通过叮咬将病毒传播给人、畜引起疾病，因此虫媒病毒可以引起人畜共患传染病（1）。
套式病毒（Nidoviruses ）包括了冠状病毒（Coronaviridae ）和动脉炎病毒（Arteriviridae ）及罗尼病毒（Roniviridae ），主要感染哺乳动物、少数禽类及无脊椎动物（虾），由于其独特的套式转录机制和较长基因组（12.7~31.7bp）的特征，被认为是最复杂的单股正链RNA病毒（2）。
国内，深圳市龙岗区疾控中心开展了虫媒监测项目，从医院监测点捕获的成蚊标本中首次发现昆虫套式病毒NDiV，并应用C6/36细胞成功地分离到NDiV 病毒，是目前国内对NDiV的研究仅有这一篇报道（3）。
国外,2011年，mBio报道了首篇昆虫套式病毒的研究（4），在科特迪瓦的原始森林的库蚊中首次发现了昆虫套式病毒，命名为Cavally virus（CA VV）。
同年，PlOS Pathogens刊登（5）同为昆虫套式病毒的研究，病毒于2002年在越南急性脑炎病人的脑脊液中分离成功（6），在当地库蚊标本也分离得到，作者Phan Thi Nga 根据病毒的分离地点将其命名为Nam Dinh Virus（NDiV）。
由于NDiV和CA VV 的宿主与分子特性相似，与套式病毒中的已有家族存在差异，故Phan Thi Nga 将其归类为Nidoviruses的新家族，命名为Mesoniviridae（7）。
传统意义的套式病毒（Nidoviruses）包括冠状病毒（Coronaviridae）、动脉炎病毒（Arteriviridae）及罗尼病毒（Roniviridae），主要感染哺乳动物、少数禽类及无脊椎动物（虾），由于其独特的套式转录机制和较长基因组（12.7~31.7kb）的特征，被认为是最复杂的单股正链RNA病毒。
在科特迪瓦与越南发现的昆虫套式病毒填补了套式病毒存在于节肢动物的空白。
目前最长的单股正链ssRNA+节肢动物病毒，NDiV 与CA VV核酸序列长度约为20.2kb，这显示它们可能是套式病毒中如猪生殖与呼吸综合征病毒的短基因病毒（small genomes）与SARS冠状病毒的长基因病毒（large genomes）之间的进化连接。
目前，国外关于NDiV的研究报告仅有Phan Thi Nga发表的两篇论文（5,7），国内的研究报告有“中国国内首次发现Nam Dinh 病毒”。
研究程度只涉及病毒的分子结构学领域。
虽然该病毒曾在越南急性脑炎病人的脑脊液中分离得到，但尚未有具体的病理因果证据证明该病毒的致病性。
NDiV是否为新的虫媒病毒仍然需要进行深入的研究与论证，后续研究将有助于我国新分离虫媒病毒的致病性的研究，对探讨病毒与人类疾病的关系，对新发病毒的危害作出更客观的评估。
NDiV毒力测试实验步骤：1．1 NDiV 乳鼠脑病毒悬液制备与保存1~2 日龄健康乳鼠（昆明品系），脑内接种NDiV C6/36 细胞病毒悬液0.02mL/只，在有纱窗设备的动物房中饲养。
逐日观察乳鼠是否发病（如出现散窝、抽搐、弓背等症状），于濒临死亡时无菌解剖取出鼠脑。
加无血清的DMEM 培养液在冰浴中研磨成浆，12,000rpm 离心10min，冻存管分装，液氮冻存备用。
1.2 NDiV 病毒株的获取途径（8）1.2.1 NDiV 病毒在细胞中传代利用C6/36细胞，模拟自然界中NDiV病毒在宿主C6/36细胞中传代，同时在C6/36细胞中连续传代。
用已定量的病毒采用高感染复数(MOI)＜0.01的病毒悬液分别接种C6/36，逐日观察细胞病变情况，当CPE达到最佳时，冰冻于-30℃冰箱中破裂细胞，然后放置37℃环境下解冻，低速离心，通过0.22μm的过滤器过滤，收集上清液感染下一代细胞，如此培养数代细胞病毒。
余下的上清液标记编号置于-70冰箱冻存备用。
1.2.2 NDiV病毒滴度的测定（9）根据传统的空斑形成试验测定方法，将上述收集的病毒悬液采用空斑法进行病毒滴度测定。
首先在12 孔培养板内常规制备BHK21和C6/36单层细胞。
在冰浴中，将每代细胞病毒上清液用细胞维持液作10倍稀释（10-1至10-8），接种各稀释度的病毒悬液，每个稀释度接种各2孔，每孔0.4mL，摇动12孔板，使布满细胞层。
置于37℃吸附1.0 h，每隔15min摇动一次，使病毒充分吸附。
吸出孔内液体，加2%琼脂糖覆盖胶，每孔3.0 （1.5）mL，室温下待覆盖胶凝固，然后细胞面朝上，置37℃孵箱中培养6-7 d。
直接加入4%甲醛固定30min 后，自来水冲洗，加入1%的结晶紫或者中性红染液染色10min，自来水冲洗晾干，开始观察计数空斑数，按公式计算空斑形成单位。
空斑形成单位（PFU/mL）＝每孔平均空斑数（PFU）×病毒稀释倍数÷每孔病毒接种量（mL）1.2.3 NDiV病毒荧光定量PCR 标准品的制备：按照RNA提取试剂盒说明书提取NDiV病毒鼠脑悬液的RNA，吸取病毒鼠脑悬液200μL加入Trizol 500μL，再经过氯仿分离、异丙醇沉淀、冰乙醇洗涤等步骤提取RNA，20μL DEPC 处理水溶解后反转录为cDNA，并用上述引物扩增目的基因，片断大小为128 bp，PCR 反应条为：94 ℃ 5 min，94℃30 s，58 ℃3 0 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，4℃保存，40个循环。
反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。
而后用胶回收试剂盒对PCR 产物进行回收，回收产物连接载体，转化DH5α感受态细胞，挑取单个菌落进行PCR和测序检测，鉴定测序结果与原核酸序列高度同源后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，测定质粒浓度，作为标准质粒，按如下公式计算标准质粒拷贝数：质粒拷贝数（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×质粒浓度（g/μL）/质粒分子量（MWg/mol）（10）。
1.2.4 实时荧光定量PCR 检测病毒在C6/36细胞中的动态变化按照RNA 提取剂盒说明书提取上述不同时间收集的细胞上清病毒RNA，阳性质粒标准品用作为阳性对照，用前述建立的荧光定量PCR 方法检测病毒增殖量，用仪器自带软件分析增殖量的动态变化，PCR 扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳验证。
构建病毒在C6/36细胞中不同时间段的病毒复制曲线。
1.3 NDiV病毒对小鼠的致病性与半数致死量（LD50）测定（11）1.3.1 NDiV 病毒对小鼠的LD50测定领取体重1~2日龄健康乳鼠5窝（40只），按体重随机分为9个剂量组，每组4只，其中第9组为对照组，给予不含病毒的2% FBS DMEM 培养液，其余各组的病毒以10倍递次稀释成10-1至10-8或100至10-6，每个稀释度分别接种4 只小鼠，每只脑内注射0.03mL，在有纱窗设备的动物房中饲养。
逐日观察乳鼠发病症状，记录各组乳鼠的死亡数与时间。
按Reed 和Muench 氏法计算LD50。
LD50的计算：高于50%的死亡分数-50%距离比例= ────────────────────高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数1.4 NDiV病毒对鸡致病性实验（12）1.4.1 NDiV病毒的SPF鸡胚EID50的测定将Nidoviruses毒种做10 倍系列稀释，取10-1至10-8分别卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚各10枚，0.2 mL/枚。
37℃孵育（48h 内死亡者弃去，不入记录）至正常出雏日后第3日，统计其未出壳胚数、特异性死亡雏鸡数及有禽脑脊髓炎特异性症状(如头颈震颤或麻痹、运动失调等)的发病雏鸡数，按Reed-Muench 法计算EID50。
同时设6日龄SPF鸡胚10枚，卵黄囊接种灭菌生理盐水，0.2mL/胚，作对照鸡胚，应至少8枚按时出雏。
1.4.2 NDiV病毒对雏鸡的毒力试验将毒种稀释至100 EID50，分别通过脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种1日龄SPF鸡各10只，0.1mL/只，观察28日。
每日记录出现AE症状的鸡数（病雏症状有：发育不良，精神不振、易惊，半蹲姿势，重者头颈震颤、运动失调，瘫痪等）。
同时设10只SPF鸡对照，分别脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种稀释液0.1mL/只，在同等条件下饲养，观察28日，应不发病。
1.4.3 鸡胚平均死亡时间(MDT)试验新收获的鸡胚尿囊液用无菌生理盐水10倍倍比稀释后,接种10日龄SPF鸡胚,每个稀释度接种6枚鸡胚,0.2mL/枚,并设生理盐水对照组,35°C孵育7d。
定时照胚并记录鸡胚死亡数量和死亡时间,收集尿囊液测定血凝价。
使所有鸡胚死亡的最高稀释倍数为病毒的最小致死剂量,MDT是最小致死剂量使鸡胚死亡平均时间,具体计算如下：Xh死亡胚数x Xh+YH死亡胚数x YHMDT = ────────────────────死亡总胚数参考文献:[1] 梁国栋.虫媒病毒研究进展[C].国内外医学科学进展，1999.62- 68.[2] Gorbalenya A E，Enjuanes L，Ziebuhr J，et al. Nidovirales：evolving the largest RNA virus genome [J] . Virus Res，2006，117：17-37.[3] 刘渠，林琳，周健明，等.中国国内首次发现Nam Dinh 病毒[J].病毒学报，2013，29（1）.[4] Florian Z，Andreas K，Phenix-Lan Q，et al. An Insect Nidovirus Emerging froma Primary Tropical Rainforest [J].mBio，2011，2（3）：1-10.[5] Phan T N，Maria del C P，Chris L，et al. Discovery of the first insect nidovirus，a missing evolutionary link in the emergence of the largest RNA virus genomes [J].PLoS P，2011，7（9）：1-18.[6] Phan T N，Nguyen T T，Komichi M，et al. Emerging viruses associated with acute encephalitis syndrome in vietnam[A]. Scientific conference of the institut pasteur international network：emerging and re-emerging viral infections[C]. National Institute of Hygiene and Epidemiology Hanoi，2006.[7] Chris Lauber，John Ziebuhr，Sandra Junglen，et al.Mesoniviridae: a proposed new family in the order Nidovirales[J]. Arch Virol，2012，157：1623-1628.[8]朱小娟. 登革病毒在宿主选择压力下基因组核苷酸变异与毒力的相关研究[D].安徽医科大学,2013.[9]彭文明,黄如统. 五种虫媒病毒的细胞敏感性观察[J]. 微生物学杂志,2002,02:28-29+64.[10]李慧锋,李丽,张丽娟,等.2010.基因绝对荧光定量PCR标准曲线的建立。