双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)实验设计

双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) 【技术背景】
目前检测HBsAg的技术有：①两位点一步法：可出现钩状效应，待测抗原浓度过高出现假低值或假阴性；②两步法：无钩状效应；③一步半法：减少钩状效应。

本实验所采用的方法为一步半法，此法是基于抗原抗体特异性反应的原理，因此对于所检测的抗原其对应的抗体是特异性的，待测抗原必须存在于抗体结合的抗原决定簇，因此，此法用于乙肝表面抗原是比较准确的。

【病人准备】
虽然在进行乙肝表面抗原检查前没有空腹检查的要求，但检查前一天应注意不喝酒、不服用任何对检测结果有影响的药物。

【标本的采集与保存】
血清：采用正确医用技术采集静脉血2ml，待血液自然完全凝固后，2000-3000转/分离心10分钟，取新鲜血清用于检测。

血浆：用抗凝血浆管（枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一作抗凝剂）采集静脉血2ml，3000-3500转/分离心10分钟，取新鲜血浆用于检测。

血清样品：5天内测定，可以放置于4℃；超过一周，-80℃保存
2.实验前准备
1）用前三十分钟从冰箱中取出的试剂盒和待测标本，平衡至室温（18-25℃）；
2）将恒温箱或恒温水箱调至反应温度。

【原理】
将抗HBs 的单克隆抗体（简称单抗）或多克隆抗体（简称多抗）包被于聚苯乙烯微孔板等固相载体上，加人待测血清和酶标记抗体（抗HBs-HRP），血清中HBsAg与微孔板上的包被抗体（抗HBs）结合，洗涤分离后，加人酶底物系统，留在微孔板表面抗HBs-HBsAg-抗HBs-HRP复合物中的HRP催化底物进行显色反应。

根据显色反应颜色的深浅（吸光度A 高低）与血清标本中HBsAg含量成正相关，以此判定血清样品中HBsAg 的有无及相对含量。

显色为阳性，不显色为阴性。

【试剂与器材】
1.试剂抗HBs包被的微孔板、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、酶标试剂、浓缩洗涤液、显色剂A、显色剂B、终止剂、封板膜
2.器材加样枪（20μL、50μL -250μL）、恒温设备（恒温水浴箱或恒温箱）、洗板机、酶标仪、吸水纸、消毒缸
要求：a ）酶标仪在450 nm 和492 nm 的波长不精密度应在≤1 %，分别在449 nm -451 nm 和491 nm-493 nm 之间，吸光度（A 值）要求可以测到小数点后两位；
b ）移液系统在100μl和50 μl 的移液不精密度应≤1 % ，分别在99- 101μL和
49.5μL-50.5μL 之间；
c ）恒温系统在37 ℃、43℃的温度变异应成±1℃。

【操作方法】
1.编号
将微孔板按序编号。

每批实验应设阴性对照3孔、阳性对照2孔、空白对照1孔，其余为待测血清孔（3孔）。

2.加样品稀释液：每孔加入样品稀释液20μL或一滴，空白孔不加。

3.加样：在待测血清孔、阴性对照孔和阳性对照孔中加入相应血清100μL/孔。

轻轻振荡混匀。

4.温育：用封板膜封板后，置37℃温育60min。

5.加酶标物：小心揭掉封板膜，每孔加入酶标试剂50μL或1滴，空白孔不加。

轻轻振荡混匀。

6.温育：用封板膜封板后，置37℃温育30min。

7.将浓缩洗涤液用新鲜蒸馏水或去离子水稀释20倍后备用。

8.洗板：小心揭掉封板膜，手工洗涤5次，每次都要在吸水纸上尽量拍干或用洗板机洗涤5次，最后一次尽量扣干。

9.显色：每孔加显色剂A和显色剂B各50μL或1滴，轻轻振荡混匀，37℃避光显色30min。

10.比色测定：每孔加终止剂50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪主波长为450nm，次波长630nm，10min内测定各孔吸光度（A）值
【结果判定】
1．临界值Cut off（CO）的计算：CO = 阴性对照孔A均值×2.1 （阴性对照孔A值低于0.05者，按0.05，高于0.05按实际A值计算计算）
2.计算S / CO比值（S为样品A值）
3.阳性结果：样品A值≥CO值或S / CO ≥ 1为HBsAg阳性
4. 阴性结果：样品A值＜ CO值或S / CO ＜ 1为HBsAg阴性
5.有效性判断：阴性对照孔A值≤0.1，阳性对照孔A值≥0.8。

否则试验无效。

【质量控制】
室内质量控制血清的两个浓度值分别为：1 ng/ml、2 ng/ml，均购自卫生部临床检验中心，每批次试验加入两个水平质控血清各一孔，同其他待测样本一同记录S/CO值。

一、分析前质量控制
1、标本采集：规范操作意识；防止溶血；要正确使用抗凝剂和真空采血管；
2、标本处理：及时分离血清或血浆；高危标本应注明；标本闭光、应专人运送。

二、分析中质量控制
1、试剂、校准品和耗材必须取得国家相关部门的批文，在有效期内正确使用，妥善保藏，质检;
2、选购高质量、有批文的仪器设备，要正确使用、定期检查、维护和保养，使其在最佳状态下运转；
3、实验室内检测结果比对：一个实验室对同一项目用不同方法，试剂，仪器，或在不同地点进行检测，需对不同方法，试剂，仪器，不同地点的检测结果进行比对；
4、严格规范操作程序：HBsAg测定项目和仪器应有SOP，并严格遵守；
5、保持检测系统的完整性和有效性，对检测系统的精密度、准确度、可报告范围、参考区间等性能进行核实、确认和评价；
6、对于脂血、溶血标本应采取一定措施，做室内质控和室间质控；
7、室内质控应连续每天监测，且试验时带质控物随标本一起测定，并对质控结果进行分析判断。

三、检验后质量控制
1、检验结果的审核和发放：评价HBsAg的测定结果与检验对象的符合性；根据检验结果是否需要作其他补充检查；有无异常结果；应对检测系统和检验过程进行评审，以保证检验结果的真实性和可靠性；判断标本的检验结果是否可靠，检验报告是否可发出。

2、室间质量控制：每年参加卫生部、省以市级临床检验中心乙型肝炎病毒表面抗原的质量评价。

【影响因素与注意事项】
（1）标本：①乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求。

②血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

③采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

④不使用任何热处理过的标本，严重溶血或脂血标本不能使用。

高浓度RF、高胆红素、溶血、高脂等标本可能干扰实验，应避免使用。

⑤.存放：样本于2-8℃可储存一周；样本长期储存应放置于-20℃或-20℃以下环境中，且不宜反复冻融。

（2）试剂盒：试剂盒从冷藏环境中取出，应平衡至室温后再使用。

不同批号或不同厂商的试剂切勿混用或互换。

（3）检测：检测必须符合国家有关HBsAg检测的实验室管理及安全的规定，并按有关规定处理所使用组分及样品。

（4）加标本和试剂液时应准确加入，且经常对加注器进行校正。

不同试剂分开加入，避免交叉污染。

（5）温度、时间：严格控制反应温度和时间，并尽量使用移液器加样，结果判定以酶标仪读数为准。

（6）洗板结束后，必须立即进行下一步，不可使酶标板孔干燥。

封板膜不能重复使用（7）显色时必须现加底物液，后加显色剂液，以免显色过低。

（8）所有样品、废液和废弃物都应按传染物处理。

（9）酶标仪、酶标洗板机、气浴恒温振荡器均由仪器生产厂家的技术支持部门负责技术校准过的，符合实验标准。

（10）尽可能排除干扰因素对试验的影响。

干扰因素及变异的潜在来源：以下类型的冻融过的样品可能会引起本实验结果的假阳性：含高滴度免疫球蛋白（IgG 骨髓瘤，IgM骨髓瘤，怀孕前3个月的妇女，流感疫苗受体），大肠杆菌抗体，抗-CMV阳性，抗-EBV阳性，抗-HSV 阳性，风疹抗体阳性，霉菌感染，抗核抗体阳性，梅毒阳性，类风湿因子及弓形虫抗体阳性。