荧光定量PCR技术及其应用研究进展_郭杨
实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用
收稿日期:2010-10-14作者简介:钟江华,女(1968-),技师,协助从事病源微生物定量基因检测研究。
3通讯联系人Email:wangyefu@whu .edu .cn实时荧光定量PCR 技术的研究进展与应用钟江华,张光萍,柳小英3(武汉大学后勤集团,武汉430072)摘要:实时荧光定量PCR 技术(real -ti m e fluorescent quantitative PCR,F Q -PCR )以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点在人类和动物疾病的快速检测、食品安全检测、定量分析、基因分型、基因表达研究、以及疫苗效力测定中成为分子生物学研究的重要工具,而且其定量范围极宽,无需做梯度稀释,特异性更强,克服了假阳性。
本文分别从实时荧光定量PCR 技术的背景、原理、类型、技术优点和定量方法、实验条件和主要影响因素、应用前景以及存在的不足等方面作了一个综述。
关键词:荧光定量;PCR;原理;应用中图分类号:Q53文献标识码:A文章编号:1006-8376(2011)02-0068-05 随着基因诊断技术的不断发展和成熟,基因诊断在临床中的地位显得更为重要。
实时荧光定量PCR (real -ti m e fluorescent quantitative poly merase chain reacti on,real -ti m e F Q -PCR )技术于1996年由美国App lied B i osyste m s 公司推出,由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR 技术相比它所具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点使其很快成为科研、临床诊断的热点技术,目前已得到广泛应用,包括对mRNA 表达的研究、各种基因定量分析、点突变分析和等位基因分析、单核苷酸多态性分析、DNA 甲基化的检测及对各种传染病进行定量定性分析。
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展
第16卷第4期 2007年8月 中国组织化学与细胞化学杂志CH I NESE J O URNAL O F H I ST OCHE M I STR Y AND CY T OCHE M I STR Y Vol 1161No .4Aug .2007实时荧光定量PCR 技术的原理及其应用研究进展赵焕英 包金风3(首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经再生修复重点实验室,教育部神经变性病重点实验室,北京 100069)〔关键词〕 实时荧光定量PCR; 荧光标记探针; DNA 结合染料〔中图分类号〕 Q52311 〔文献标识码〕 A〔收稿日期〕2006210231 〔修回日期〕2007201226〔作者简介〕赵焕英,女(1975),汉族,在读硕士研究生。
3通讯作者(To whom corres pondence should be addressed ) 自从1983年Mullis 发明聚合酶链式反应(poly merase chain reacti on ,PCR )以来,PCR 技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。
但是传统PCR 技术在应用中一是不能准确定量,二是容易交叉污染,产生假阳性。
直到近年来荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy transfer ,FRET )技术用于PCR 定量后,上述问题才得到较好的解决[1]。
实时荧光定量PCR (real 2ti m e fluor o 2genetic quantitative PCR ,F Q 2PCR )是在PCR 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。
它是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
该技术不仅实现了对DNA 模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。
实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用
实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用引言实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的分子生物学方法，可用于精确测量目标DNA或RNA的数量。
该技术在许多领域得到了广泛的应用，如医学诊断、基因表达分析、病原体检测以及环境监测等。
一、实时荧光定量PCR技术的原理实时荧光定量PCR技术基于PCR反应过程中，目标DNA（或RNA）序列的指数级扩增特性。
该方法需要引物与目标序列相互结合，合成适量的荧光探针用于监测PCR过程中目标序列的扩增程度。
其中，引物是起始特异性扩增的核酸片段，荧光探针含有荧光染料和荧光阻断剂。
当探针结合至目标序列时，就会被5'→3'外切酶降解，并释放荧光信号，实时监测PCR反应进程。
二、实时荧光定量PCR技术的优势1. 高灵敏度和高精确度：实时荧光定量PCR技术通过荧光信号的动态监测，可准确测量目标序列的扩增数量。
其灵敏度能够达到单个拷贝级别，且可靠性高，消除了传统PCR中间断性的'瓶颈'效应。
2. 快速和高通量：相比传统PCR技术，实时荧光定量PCR所需的时间更短，反应速度快。
通过多重PCR反应孔，可以同时测定多个样品，提高了检测效率。
3. 广泛的应用范围：实时荧光定量PCR技术不仅适用于基因表达、基因突变和SNP（单核苷酸多态性）的检测，还可用于病原体的检测和定量，如病毒感染、细菌感染等。
4. 可靠的检测结果验证：通过内参基因和集成阳性对照，可以消除检测结果偏差，确保检测结果的准确性和可靠性。
三、实时荧光定量PCR技术的应用1. 医学诊断：实时荧光定量PCR技术在临床医学诊断中具有很大的潜力，可用于早期肿瘤标志物、病原体和遗传疾病的检测与定量。
例如，可通过检测突变基因来判断特定癌症患者对某些药物的敏感性，从而为精准化治疗提供依据。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR (qPCR) 技术是一种快速检测DNA或RNA的工具，它以实时监测荧光信号的增长来定量PCR产物。
qPCR技术可以广泛应用于医学、生物学、环境科学和工业等领域，是研究基因表达、突变、多样性和病原体检测的常用方法之一。
近年来，qPCR技术取得了很多进展。
其中一个重要的进展是新型荧光探针的发展。
新型荧光探针不仅可以更快地生成荧光信号，而且还可以改善信噪比和基线噪音。
例如，使用SYBR Green和TaqMan探针等新型探针的qPCR技术可以快速准确地检测DNA、RNA和病原体，并且能够检测到非常低的样本浓度。
另一个重要的进展是高通量qPCR技术。
高通量qPCR技术可以在更短的时间内处理更多的样本，并且能够实现高度精确的定量。
在生物学研究中，高通量qPCR技术已被广泛应用于基因表达分析、SNP分型和基因组分析等领域。
此外，qPCR技术的自动化和微型化也是一个重要的进展，使得qPCR技术更快、更简单、更安全和更可靠。
自动化和微型化的qPCR技术可以大大提高生产效率，减少操作和重复步骤，同时也能够减少样本使用量和技术偏差。
qPCR技术在医学、生物学、环境科学和工业等领域中有着广泛应用。
其中，在医学领域，qPCR技术已被广泛应用于病原体检测、基因表达分析和诊断等方面。
在生物学研究中，qPCR技术已被广泛应用于基因表达分析、SNP分型和基因组分析等领域。
在环境科学中，qPCR技术能够检测自然环境中的微生物、重金属和有机物污染物等。
在工业领域，qPCR技术也被应用于食品安全检测和基因工程产品检测等方面。
总的来说，qPCR技术在科学研究和实际应用中具有广阔的前景。
随着新技术和新应用的出现，我们相信qPCR技术将在未来得到更广泛的应用。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
一、实时荧光定量PCR技术原理及方法
实时荧光定量PCR技术是一种结合了PCR和荧光信号检测的新型分析技术。
其原理是通过引入一种荧光探针或染料，使PCR反应进行过程中产生的DNA片段或RNA片段能够发出荧光信号，从而实现对PCR产物的实时监测和定量分析。
在实时PCR过程中，荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，因此可以通过测定荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
实时荧光定量PCR技术的方法包括SYBR Green I法和探针法两种。
SYBR Green I法是利用SYBR Green I染料与DNA双链结合时发出荧光的特性，实现对PCR产物的定量分析。
探针法则是引入一种特定的探针分子，当探针与PCR产物结合时，荧光信号会产生变化，从而进行定量分析。
两种方法各有优缺点，研究者可根据具体实验需求选择合适的方法进行实时PCR分析。
实时荧光定量PCR技术在医学诊断中具有重要的应用价值。
它可以用于病原体检测，如病毒、细菌等的快速定量分析。
通过设计特异性的引物和探针，可以实现对病原体的快速检测和定量分析，为临床诊断提供重要的依据。
实时荧光定量PCR技术还可以用于基因突变的检测，如常见的遗传病突变、肿瘤基因突变等。
通过对基因突变的定量分析，可以为临床诊断和治疗提供重要的信息。
实时荧光定量PCR技术还可以用于药物代谢酶基因的表达分析，从而指导个体化药物治疗。
实时荧光定量PCR技术在医学诊断中有着广泛的应用前景，有望成为未来医学诊断的重要手段。
实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展
实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展摘要：实时荧光定量ｐｃｒ技术是在ｐｃｒ反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个ｐｃｒ反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点.近年来，实时荧光定量ｐｃｒ技术在植物检疫研究上不断深入，大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平.综合论述了实时荧光定量ｐｃｒ技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。
关键词：实时荧光定量ｐｃｒ技术；植物检疫；植物病害ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅａｌｔｉｍｅ fluorescent ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｃｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｐｌａｎｔｑｕａｒａｎｔｉｎｅｈｕａｎｇｈａｉ－ｑｕａｎ（ｂｅｉｌｕｎｅｎｔｒｙ－ｅｘｉｔｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｒａｎｔｉｎｅｂｕｒｅａｕ，ｎｉｎｇｂｏ３１５８００，ｚｈｅｊｉａｎｇ，ｃｈｉｎａ)ａｂｓｔｒａｃｔ：ｆｑ－ｐｃｒｉｎｖｏｌｖｅｓｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆａｄｄｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｓｉｎｔｈｅｐｃｒｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｉｇｎａｌ, ｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ｐｃｒ) ｐｒｏｃｅｓｓ could be monitored ｉｎｏｒｄｅｒｔｏ quantitatively ａｎａｌｙｚｅｕｎｋｎｏｗｎｔｅｍｐｌａｔｅｂｙｍｅａｎｓｏｆｍａｋｉｎｇｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ．ｆｑ－ｐｃｒｈａｓｇｏｏｄｆｅａｔｕｒｅｓｓｕｃｈａｓｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙｏｆｏｐｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，ａｎｄｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｅｔｃ．ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ， application of ｆｑ－ｐｃｒｉｎｐｌａｎｔｑｕａｒａｎｔｉｎｅ was studied ａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅ detecting ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｌｅｖｅｌｏｆｐｌａｎｔｅｐｉｄｅｍｉｃ． tｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｓｅｐｉｄｅｍｉｃｃａｕｓｅｄｂｙｆｕｎｇｉ，ｂａｃｔｅｒｉａ，ｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｎｅｍａｔｏｄｅｓ was comprehensively described．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｃｒ；ｐｌａｎｔｑｕａｒａｎｔｉｎｅ；ｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅ实时荧光定量ｐｃｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｃｒ，ｆｑ－ｐｃｒ）技术是２０世纪９０年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。
实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展
根据荧光类型,FQ-PCR 可分为染料类、 探针类和引物标记三种。 染料法中以 SYBR Green I 染料应用最广泛。 SYBR Green I 能与所有 双链 DNA 小沟结合。 在 PCR 反应体 系 中,加 入 过 量 SYBR 荧 光 染 料, SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链 中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信 号,从 而 保 证 荧 光 信 号 的 增 加与 PCR 产物的增加完全同步。 探针法是在待扩增区域结合上 DNA 探 针 ，在 PCR 过 程 中,具 有 5′→3′外 切 酶 活 性 的 Taq 酶 延 伸 引 物 链 到 DNA 探 针 时,将 DNA 探 针 逐 个 降 解,释 放 出 荧 光 报 告 基 团,这 样 PCR 体系中荧光的强度与 PCR 产物量之间呈正比,可通过测定荧光强度而 对 PCR 产物定量。 引物标记是直接对引物进行荧光标记从而使荧光 标记基团直接掺入 PCR 扩增产物的方法。
实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用
实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用随着分子生物学和遗传学的发展，实时荧光定量PCR技术（quantitative real-time PCR）在生物医学研究和医学检测中得到了广泛的应用。
实时荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改良版，能够实时监测PCR反应的进程，实现对DNA或RNA的定量分析。
本文将综述实时荧光定量PCR技术的研究进展以及其在医学领域中的应用。
一、实时荧光定量PCR技术的原理及方法实时荧光定量PCR技术利用特定荧光探针以及相应的荧光探测系统，通过测量荧光信号的增加来定量分析PCR反应中基因的拷贝数。
具体步骤如下：首先，通过DNA提取或RNA提取获得待检测物质的样本。
接着，将获得的DNA或RNA经过逆转录反应合成cDNA，以备进行PCR扩增。
然后，在PCR反应混合液中加入特定引物和荧光探针。
引物是用于扩增待检基因的片段，而荧光探针则是用于实时监测扩增过程中产生的DNA量。
荧光探针通常由一个碱基特异的标记染料和一个荧光供体相连，当探针与待检基因的DNA结合时，标记染料和荧光供体的空间关系发生改变，导致荧光强度的变化。
接下来，在实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。
仪器通过加热、冷却等步骤循环进行，同时测量荧光信号的强度。
实时荧光定量PCR技术能够在PCR反应过程中记录和监测荧光信号的增加，从而实现对样本中待检基因的定量分析。
最后，根据荧光信号的强度变化，通过标准曲线法或绝对定量法计算出待检基因在样本中的拷贝数。
标准曲线法通过制备一系列浓度已知的标准品，绘制标准曲线并求出待检样品中的基因拷贝数。
绝对定量法则是通过计算PCR反应的阈值周期数（Ct值）并结合样品的稀释倍数得出基因拷贝数。
二、实时荧光定量PCR技术的应用实时荧光定量PCR技术在医学领域中的应用广泛且多样，以下列举了其中几个典型应用：1. 疾病诊断实时荧光定量PCR技术能够定量检测体内的病原体，如病毒、细菌等，并帮助医生进行疾病的早期诊断。
荧光定量PCR技术的原理和应用进展
荧光定量PCR技术的原理和应用进展2005-3-21 15:25:04--------------------------------------------------------------------------------实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展过程中，两个重要的发现推动了荧光定量技术的大力发展：在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展推动实时荧光定量PCR方法在研究工作中的运用。
定量原理PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。
在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
在实时荧光定量PCR反应中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。
在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。
◇基线（Baseline）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。
◇光域值threshold的设定一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR技术是近年来迅速发展的一种生物技术手段，它具有快速、精准、高灵敏度和高特异性等特点，被广泛应用于基因表达分析、基因型鉴定、细菌和病毒等微生物检测、肿瘤标志物测定等多个领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术的原理、方法及其在不同领域中的应用研究进展。
一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是一种将PCR扩增与实时荧光检测相结合的技术，它可以同时进行DNA扩增和检测，实时监测扩增过程中荧光信号的强度，从而直接定量目标DNA的含量。
其原理主要包括引物设计、扩增反应、荧光探针和检测系统。
1. 引物设计实时荧光定量PCR技术需要使用两对引物，分别是特异性引物和荧光标记的引物。
特异性引物即PCR扩增所需的引物，而荧光标记的引物是一种能够与目标DNA结合并产生荧光信号的特殊引物。
2. 扩增反应扩增反应是实时荧光定量PCR的核心部分，它通过多轮循环反应使目标DNA序列不断扩增，同时释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标DNA的数量成正比，可以实时监测扩增过程。
3. 荧光探针在扩增反应中加入荧光标记的探针，这种探针通常由一个荧光素和一个受体组成，当探针与目标DNA结合时，荧光素就会释放出荧光信号。
4. 检测系统实时荧光定量PCR技术需要使用专门的实时荧光PCR仪来检测荧光信号，不同的仪器有不同的检测系统，但原理基本相同，即通过检测荧光信号的强度来定量目标DNA的含量。
实时荧光定量PCR技术主要包括SYBR Green I法和探针法两种方法。
1. SYBR Green I法SYBR Green I是一种DNA结合染料，可以与PCR扩增产物结合并产生强烈的荧光信号。
使用SYBR Green I法时，需要同时使用特异性引物和SYBR Green I染料，PCR扩增产物会结合SYBR Green I染料产生荧光信号，实时检测扩增过程中的荧光强度。
2. 探针法探针法是另一种实时荧光定量PCR技术，它需要使用荧光标记的探针来与目标DNA结合产生荧光信号。
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动物医学进展,2009,30(2):78-82Progress in Veterinary Medicine荧光定量PCR 技术及其应用研究进展＊郭 杨1,2,陈世界1＊,郭万柱2,李 璟3(1.四川出入境检验检疫局技术中心,四川成都610041;2.四川农业大学动物生物技术中心,四川雅安625014;3.成都理工大学材料与生物工程学院,四川成都610059) 摘 要:荧光定量PCR 是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PC R 技术的有机结合,而荧光探针是荧光定量PCR 的核心。
荧光定量PCR 具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,是对原有PCR 技术的革新,扩大了PCR 的应用范围。
论文综述了FQ -PCR 技术的原理、FQ -PCR 实时定量检测系统及其应用。
关键词:荧光定量PCR ;荧光探针;检测;应用中图分类号:S854.43文献标识码:A文章编号:1007-5038(2009)02-0078-05 自1985年PC R 技术问世以来,已研究成功以PCR 为基础的扩增和操作DNA 序列的一系列方法。
实时荧光定量PCR (real -time flurescent quan -titive po1y merase chain reaction ,FQ -PC R )是基于荧光能量传递技术,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色基团转移到受体发色基团,受体荧光染料发射出的荧光信号强度与DN A 产量成正比,检测PCR 过程的荧光信号便可得知靶序列的初始浓度。
它融汇PCR 技术的核酸高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,直接探测PCR 过程中荧光信号的变化以获得定量的结果[1-2]。
目前已在动植物基因工程,分子生物学研究和医学研究等领域得以应用。
1 两个重要概念1.1 荧光阈值荧光阈值(thresho ld )以PC R 反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,一般荧光阈值定义前3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
1.2 循环阈值循环阈值(cy cle thresho ld value ,Ct )中,C 代表cy cle ,t 代表thre shold 。
其含义是在PCR 循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值的时刻。
Ct 值取决于阈值。
FQ -PC R 采用始点定量的方式,通过Ct 值确立样品起始模板数从而实现定量,Ct 值与模板DNA 的起始拷贝数成反比。
同一台PCR 仪上对相同模板进行扩增,在Ct 值处PCR 产物数量的重现性极好,在Ct 值处对起始核酸进行定量,此时误差未被放大且扩增效率也恒定,处于线性扩增范围内。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表C t 值(图1)。
只要获得未知样品的表Ct 值,便可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图1 F Q -P CR 的标准曲线Fig .1 Standard curve of FQ -PCR＊收稿日期:2008-11-12基金项目:国家质检总局科研课题资助项目(SK 064-02)作者简介:郭 杨(1984-),女,四川成都人,硕士,主要从事动物传染病病原分子生物学研究。
＊通讯作者2 FQ-PC R反应方法的分类按照荧光产生的原理,可将FQ-PC R分为非特异性DN A结合染料法和探针法。
2.1 非特异性DNA结合染料法染料与DNA双链结合时在激发光源的照射下发出荧光信号,其信号强度代表双链DNA分子的数量。
随PCR产物的增加,PCR产物与染料的结合量也增大。
不掺入链中的染料不会被激发出任何荧光信号。
染料与DNA双链分子的结合是非特异性的,它可以和反应体系中所有DNA分子结合,易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响,使定量结果不可靠。
可用熔解曲线分析区分特异性和非特异性扩增,引物的设计和反应条件的优化对消除非特异性荧光都有很大帮助。
目前主要使用的是SYBR G reenⅠ和S YBR Gold。
一般的染料法灵敏度低,特异性不强。
Po we r SYBR G reen是最新推出的荧光染料,能非特异地嵌合在DNA双螺旋结构的小沟内,结合状态的荧光强度较之游离状态的荧光强度增强千倍,灵敏度可达几个拷贝/μL,通过熔解曲线区分特异性和非特异性扩增。
在扩增体系中直接加入Pow er S YBR G reen,避免了设计、标记荧光探针和使用价格昂贵、复杂的试剂。
在操作方面更为简便安全,对环境污染很小。
Pow er S YBR Green PC R Master M ix中的热启动酶常温无活性,热启动95℃10min后才有PCR活性,可阻断配液时的随机扩增,大大提高了荧光定量PCR反应的特异性。
2.2 探针法2.2.1 Taq M an探针 也称水解寡核苷酸探针。
该方法使用具有5′～3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
在该探针两端分别标记报告荧光基团(R)和淬灭荧光基团(Q)。
探针完整时R基团发出的荧光被Q基团吸收,无荧光产生。
若底物序列不能同探针互补,探针仍游离,未杂交的探针保持完整,荧光信号不能被检测到。
若正确的底物被扩增,探针会在复性阶段与其杂交,当聚合酶延伸到探针时,会将其5′端替换下来,并将R基团切下,R基团和Q基团分开,使荧光信号释放出来,可通过检测系统观察到信号的变化,荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
每扩增一条DNA链就有一个游离的荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
利用标准品模板系列绘制出标准曲线,结合各样品的C t值,可确定样品的起初模板量。
Taq Man探针的优点是可利用多种荧光同时进行多重分析,而S YBR等DNA结合荧光基团不能。
美国ABI公司推出了一种新的MGB Taq M an(mino r gro ove binding Taq M an)探针。
其3′端采用非荧光性的淬灭基团,大大降低本底信号干扰,3′连接的一个二氢环化吲哚卟啉-三肽,稳定了探针与模板的杂交,提高探针的Tm值,使较短的探针可达到较高的Tm值,而短探针R基团和Q基团距离更近,淬灭效果更好,荧光背景更低,短探针也简化探针设计降低了成本。
常用R基团有FAM、JOE、H EX、TET、VIC等,Q基团有TAM RA、Eclipse等。
2.2.2 分子信标 它是能与DNA杂交的具有茎-环结构的探针,环形部分的碱基可与目标核苷酸序列互补,一般为15个～30个核苷酸长,茎部是由互相配对的碱基组成,不能与目标基因配对结合。
探针5′端有荧光标记物,3′端有淬灭基团。
当无特异性单链DNA时,探针自身两端的序列互补,形成发夹结构;淬灭基团吸收荧光标记物发出的荧光,以热量形式释放掉。
当该探针与特异模板杂交,破坏探针的发卡结构,溶液产生荧光,荧光强度与溶液中模板的量成正比,可用于PCR定量分析;若目标DNA 序列同分子信标不能完全配对,杂交过程和信号不会出现。
若在发夹结构中荧光标记物不能紧靠淬灭基团,会产生很强的背景信号。
若分子信标内杂交过强,会妨碍同目标DNA分子的杂交,使得荧光信号不能充分释放。
最佳的分子信标应有合适的熔链特性。
分子信标可检测单个核苷酸的突变,适于SN P分析和等位基因突变分析。
但设计较难,既要避免产生强的背景信号,又要避免茎部杂交过强,影响其与模板退火,从而影响荧光生成。
2.2.3 双杂交探针 Ro che公司新近开发的一种PCR定量技术,使用两个杂交探针,提高特异性。
2条探针中的一条在5′端标记荧光,一条在3′端标记荧光,其中一个为受体荧光基团,另一个为供体荧光基团,供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱,自由状态时只检测到供体荧光基团发出的荧光。
两探针可与模板同一条链相邻的序列杂交。
退火时两条探针与目的基因特异性结合,首尾连接,2个荧光基团互相靠近,供体基团发出的能量激发受体基团发出荧光,检测时只检测受体基团发出的荧光。
该方法淬灭效率高,两条探针均与目的基因特异性结合才能检测到受体基团发出的荧光,检测的特异性增加。
但两个探针结合于模板上影响扩增效率,合成2个探针,成本相对较高。
2.2.4 复合探针法 该法结合了分子信标和Light Cy cler两种技术的优点,克服了他们的不足,是我国研究和开发的一种新型定量PCR技术。
合成两个探针,一是荧光探针(25bp),5′端接一荧光分子;另79郭 杨等:荧光定量PC R技术及其应用研究进展一为淬灭探针(15bp),3′端接一淬灭分子,淬灭探针能与荧光探针5′端杂交。
无模板时,两探针结合形成复合探针,荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收,无荧光产生;当溶液中有模板时,在较高温度下荧光探针优先与模板结合,两探针分离,产生荧光。
荧光强度与PCR体系中模板数量成正比,可进行PC R 定量。
该法优点为使用非荧光淬灭剂,本底低,对扩增效率影响小,探针设计、合成、标记、纯化方便。
3 FQ-PC R在预防兽医学中的应用PCR技术的应用有许多局限,不能准确定量,假阳性率太高,只要有微量病原体存在就可以得到阳性结果,这不能完全作为诊断依据,只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。
FQ-PC R实现了PCR从定性到定量的飞跃,有效解决PCR污染和对模板定量不准确等问题。
3.1 在动物病原菌检测和鉴定中的应用炭疽杆菌作为人兽共患病的病原,尤其炭疽杆菌的芽胞可作为生物武器的病原。
王梁燕等[3]在100L纯化空气中加入炭疽杆菌芽孢,进行FQ-PC R 检测,1h内炭疽杆菌的单个芽孢就被检测到。
空肠弯曲菌是人类主要的食源性病原之一,常规细菌培养鉴定结果不可靠。
阳成波等[4-5]以Lig ht Cycler为平台,先后建立一种基于Taq Man探针的FQ-PC R 和SYBR G reen I,能与双链DNA结合而发出荧光的特性来定量检测空肠弯曲菌,检测限度为5cfu,整个检测过程在60min内完成。
3.2 在动物病毒检测和鉴定上的应用FQ-PCR问世后,积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料,形成感染性疾病的临床分子诊断标准。
FQ-PCR已应用于许多病原体的检测,如对艾滋病病毒、乙型肝炎病毒DNA[6]、尖锐湿疣皮损中H PVD-NA[7]、与鼻咽癌关系密切的EB病毒、结核分支杆菌、巨细胞病毒、A型和B型流感病毒等病原体的检测[8-9]。
Takele等建立了高通量定性和定量检测来源于人或猪的PERV的Taq Man技术;宋志军等[10]建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Taq M an荧光定量RT-PC R检测方法,灵敏度可达5.0拷贝;张鹤晓等建立了检测活禽和禽产品中中强毒力新城疫病毒(NDV)的Taq M an荧光RT-PC R方法;黄娟等[11]建立了PRRSV实时PCR检测患病猪的肺脏等样品,对PRRSV细胞培养物检测下限为0.01TCID50;朱文新等[12]建立了快速通用型“一步法”检测活禽和禽产品中所有A型禽流感病毒的FQ-PC R技术;花群义等[13]采用FQ-PC R对水疱性口炎病毒的鉴定检测;邹文等[14]利用S YBR Green FQ-PC R检测鸭乙型肝炎病毒;Yang F L等[15]建立了检测鸭瘟病毒的FQ-PCR技术;陈玉栋等建立了快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的FQ-PC R技术;罗长保等建立了FQ-PCR检测口蹄疫病毒。